動(dòng)物繁殖學(xué)：胚胎體外生產(chǎn)、性控與保存技術(shù)

第一講胚胎移植技術(shù)（一）第二講胚胎移植技術(shù)（二）第三講胚胎體外生產(chǎn)、性控與保存技術(shù)第四講干細(xì)胞、克隆與轉(zhuǎn)基因技術(shù)第十單元配子與胚胎生物工程技術(shù)第三講胚胎體外生產(chǎn)、性控與保存技術(shù)IVF技術(shù)的概念與意義IVF技術(shù)的基本操作程序IVF技術(shù)的現(xiàn)狀及存在問題IVF技術(shù)的研究方向體外受精技術(shù)一、IVF技術(shù)的概念與意義在自然條件下，哺乳動(dòng)物精子和卵子的受精過程是在輸卵管內(nèi)完成的。將精子和卵子分別從公、母畜內(nèi)取出并經(jīng)過一系列的處理，使精卵在體外條件下結(jié)合的過程，稱為體外受精（invitrofertilization，IVF）。由于卵子和精子的受精過程是在實(shí)驗(yàn)室中完成，因而，通過這一技術(shù)而產(chǎn)下的動(dòng)物又稱為“試管動(dòng)物”。同時(shí)，由于體外受精技術(shù)與胚胎移植技術(shù)（ET）密切相連，又稱為IVF-ET。隨著哺乳動(dòng)物胚胎工程技術(shù)的深入研究、胚胎國際貿(mào)易的發(fā)展、商業(yè)性胚胎移植技術(shù)的迅猛發(fā)展,對胚胎的需求量日益增加。單純依靠超數(shù)排卵獲得胚胎的方法,成本高，時(shí)間長，步驟多，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足科學(xué)研究和生產(chǎn)的需求。IVF技術(shù)是繼人工授精、胚胎移植技術(shù)之后,家畜繁殖領(lǐng)域的“第三次革命”。1、為體外工廠化大量生產(chǎn)質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的胚胎提供了可能，現(xiàn)已將牛卵母細(xì)胞體外成熟—體外受精—早期胚胎的體外發(fā)育，結(jié)合冷凍保存，生產(chǎn)出了大量試管犢牛，逐步建立了工廠化生產(chǎn)胚胎的成套技術(shù)。一、IVF技術(shù)的概念與意義2、為動(dòng)物克隆、胚胎性別鑒定和轉(zhuǎn)基因等其他胚胎生物技術(shù)提供豐富的實(shí)驗(yàn)材料和必要的研究手段。3、有利于揭示配子的受精機(jī)理與早期胚胎的發(fā)育本質(zhì),為受精生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科提供重要的理論依據(jù)。4、對人類生殖醫(yī)學(xué)（如試管嬰兒治療不孕不育癥等）產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。1978年英國1998年我國首例試管嬰兒誕生10周年時(shí)，張麗珠與鄭萌珠在一起。北京醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院.二、IVF技術(shù)的基本操作程序包括卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精、精子的體外獲能和體外培養(yǎng)、體外生產(chǎn)的胚胎簡稱IVF胚胎。生殖細(xì)胞的收集精子卵母細(xì)胞卵母細(xì)胞制備體外成熟培養(yǎng)受精受精卵的體外培養(yǎng)

精子制備體外獲能IVF技術(shù)輔助生殖技術(shù)體外受精精子成熟的卵母細(xì)胞脫掉卵丘細(xì)胞的卵丘細(xì)胞1．卵母細(xì)胞的采集卵母細(xì)胞的采集方法可以分為離體采集和活體采集兩種。（1）離體采集從屠宰場獲取卵巢是體外受精研究中卵母細(xì)胞的重要來源之一。（2）活體采集動(dòng)物超排后，在排卵前通過剖腹術(shù)、腹腔鏡技術(shù)或B超技術(shù)，用空氣泵所產(chǎn)生的負(fù)壓可抽吸獲得卵泡卵母細(xì)胞。2．卵母細(xì)胞的體外成熟從卵巢上采集到的卵母細(xì)胞大多處在生發(fā)泡階段，還沒有成熟到能和精子受精的階段，故需進(jìn)行進(jìn)一步的成熟培養(yǎng)。牛和羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的時(shí)間一般為22~24h，而馬為30~36h，豬為40~44h。卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)方法一般采用微滴法、封閉法和開放法三種。

只有周圍包被著完整卵丘（A級(jí)）或部分卵丘脫落（B級(jí)）、胞漿均質(zhì)并充滿于透明帶內(nèi)的卵母細(xì)胞才能進(jìn)行成熟與胚胎發(fā)育的培養(yǎng)。

IVM27h擴(kuò)展的COCs

IVM0h部分卵丘的COCs

IVM0h卵丘完整的COCs

IVM27h卵母細(xì)胞排出PBI

3、體外受精

體外受精是一個(gè)將獲能精子與成熟卵子共培養(yǎng)，完成受精的過程。卵母細(xì)胞體外受精的完成需要成熟的卵子和精子，其次，還需要一個(gè)有利于細(xì)胞存活與代謝的培養(yǎng)條件。因此，精子的制備、獲能和受精一般在Tyrode’s液或BO液中進(jìn)行。精子的獲能處理常用肝素和鈣離子載體。體外受精的完成需要一個(gè)有利于精子和卵子存活的培養(yǎng)系統(tǒng)，目前主要包括微滴法和四孔培養(yǎng)板法兩類。

IVF后形成兩原核

IVF后卵排出PBII

IVF后第一次卵裂

三、IVF技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀和存在的問題1、發(fā)展現(xiàn)狀

家畜體外受精技術(shù)經(jīng)過20多年的發(fā)展，已經(jīng)取得很大進(jìn)展。尤其是牛的體外受精技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入了產(chǎn)業(yè)化開發(fā)階段，其入孵卵母細(xì)胞的卵裂率可達(dá)80%～90%，發(fā)育至桑葚胚、囊胚階段的胚胎可達(dá)40%～50%，桑葚胚、囊胚超低溫冷凍后繼續(xù)發(fā)育率可達(dá)70～80%，移植后產(chǎn)犢率可達(dá)20%～30%。平均每個(gè)卵巢可獲得A級(jí)卵母細(xì)胞10枚左右，受精后可獲得桑葚胚或囊胚3～4枚，移植后產(chǎn)犢1～2頭。此外，綿羊、山羊和豬的IVF技術(shù)也取得了很大進(jìn)展，入孵卵母細(xì)胞的卵裂率可達(dá)80%～90%。（1）囊胚發(fā)育率低，胚胎質(zhì)量差。卵母細(xì)胞經(jīng)IVM，雖然大部分可以成熟，但經(jīng)過IVF和IVC后，囊胚率只有40%左右，移植妊娠率20％～40％。（2）產(chǎn)犢率低，胎兒初生重高。體外受精胚胎，尤其是牛的體外生產(chǎn)胚胎移植給受體后，妊娠率低，新鮮胚胎妊娠率30～40％，冷凍胚胎妊娠率20～30％；初生重比正常犢牛高10％，流產(chǎn)率高達(dá)20％。同時(shí)，還存在從屠宰場獲得的卵母細(xì)胞系譜不清楚，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)奶牛卵母細(xì)胞不容易獲得等問題。2、存在的問題四、IVF技術(shù)的發(fā)展方向（1）深入研究胚胎發(fā)育的機(jī)制。優(yōu)化卵母細(xì)胞和早期胚胎的體外培養(yǎng)體系，探索更有效的卵母細(xì)胞和胚胎冷凍方法，從而大幅度提高胚胎體外生產(chǎn)的效率和移植妊娠率。（2）加強(qiáng)腔前卵泡的培養(yǎng)研究，以充分利用優(yōu)良母畜的遺傳資源。

（3）加強(qiáng)體外受精與其他生物技術(shù)的結(jié)合。

和性控技術(shù)相結(jié)合，生產(chǎn)特定性別的體外胚胎，具有更廣泛開發(fā)應(yīng)用前景；同時(shí)，該技術(shù)與體細(xì)胞核移植、轉(zhuǎn)基因、干細(xì)胞等技術(shù)密切相關(guān)，可為后者提供充足的試驗(yàn)材料和技術(shù)支持。第三講胚胎體外生產(chǎn)、性控與保存技術(shù)性控技術(shù)的定義與意義性別控制的方法（一）受精前：X.Y精子分離（二）受精后：早期胚胎性別鑒定胚胎性別控制技術(shù)性別控制（sexcontrol）是人為干預(yù)動(dòng)物的生殖過程，使雌性動(dòng)物產(chǎn)出人們期望性別的后代的技術(shù)。性別控制對人類和動(dòng)物尤其是對家畜的育種和生產(chǎn)有著深遠(yuǎn)的意義。第一，通過控制后代的性別比例，可充分發(fā)揮受性別限制的生產(chǎn)性狀（如泌乳）和受性別影響的生產(chǎn)性狀（如生長速度、肉質(zhì)等）的最大經(jīng)濟(jì)效益。第二，控制后代的性別比例可增加選種強(qiáng)度，加快育種進(jìn)程。對人類來說，通過性別控制可以避免出生與X染色體相關(guān)隱性疾病的嬰兒。一、性控技術(shù)的定義與意義二、性別控制的方法性別控制目前主要通過以下兩種方式來實(shí)現(xiàn)。在受精之前，體外分離出含X染色體的精子和含Y染色體的精子，用所需性別的精子進(jìn)行受精；在受精之后，通過對胚胎的性別進(jìn)行鑒定、移植，從而獲得所需性別的后代。（一）X、Y精子的分離1．物理分離法物理分離法是以X精子和Y精子之間存在一定的物理特性（如密度、大小、重量、形態(tài)、活力和表面電荷等）差異為依據(jù)。其分離的方法有密度梯度離心法、層流分離法和電泳法等，但由于X精子和Y精子之間差異很小，用這些方法分離效果不理想，已很少應(yīng)用。2．免疫學(xué)分離法原理是Y精子質(zhì)膜攜帶H-Y抗原，而X精子無此抗原，利用H-Y抗體和H-Y抗原免疫反應(yīng)檢測Y精子，再通過一定的程序，分離X精子和Y精子。該法的分離效果也不理想，目前很少用。3．流式細(xì)胞儀分離法流式細(xì)胞儀法是目前比較科學(xué)、可靠、準(zhǔn)確性高的精子分離方法。其理論基礎(chǔ)是X精子和Y精子的常染色體相同，而性染色體的DNA含量有差異。研究表明，家畜中X染色體的DNA含量比Y染色體高出3%~4%。XY精子熒光染色，X精子發(fā)出較強(qiáng)的熒光信號(hào)。

發(fā)出的信號(hào)利用儀器和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增，并分辨X精子、Y精子及分辨模糊的精子。

（負(fù)）電荷耦合計(jì)算機(jī)指令液滴充電器使發(fā)光強(qiáng)的液滴帶負(fù)電，弱的帶正電，分辨模糊的不帶電。（二）早期胚胎的性別鑒定對移植前胚胎性別鑒定研究稍晚于精子分離研究，因當(dāng)時(shí)還沒有找到一種有效的精子分離方法。人們運(yùn)用細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)及免疫學(xué)方法對哺乳動(dòng)物附植前的胚胎進(jìn)行性別鑒定，通過移植已知性別的胚胎控制后代性別比例。1．核型分析法其原理是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體分為常染色體和性染色體，在雌雄細(xì)胞中，常染色體的同源染色體大小和形態(tài)相同，只有性染色體的形態(tài)和大小不同，雌性為XX，雄性為XY。因此通過核型分析能鑒定胚胎性別。2．分子生物學(xué)法此法的理論依據(jù)是SRY基因僅存在于Y染色體上。因此，通過分子生物學(xué)技術(shù)鑒別胚胎細(xì)胞是否存在SRY基因，就能鑒別出雄性胚胎和雌性胚胎。目前常用的方法是聚合酶鏈反應(yīng)PCR（PolymeraseChainReaction）鑒定法和熒光原位雜交法（fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）兩種。PCR法

用PCR擴(kuò)增SRY基因，陽性胚胎為雄性，陰性胚胎是雌性，準(zhǔn)確率達(dá)90%。與胚胎分割等技術(shù)結(jié)合起來，先將胚胎分割，一小半用于PCR鑒定，另一大半用于鑒定后的移植。這種方法取樣細(xì)胞少，對胚胎的損傷小、快速而準(zhǔn)確，準(zhǔn)確率高達(dá)90%以上。目前廣泛應(yīng)用于家畜，特別是牛、羊胚胎的性別鑒定。這種方法在操作過程中偶爾會(huì)丟失細(xì)胞，也會(huì)被血清DNA污染而導(dǎo)致誤判。因此，操作要謹(jǐn)慎細(xì)致，嚴(yán)格消毒，防止污染。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，是一種新型的核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是對目標(biāo)基因的6個(gè)區(qū)段設(shè)定雄性特異性以及雌雄共同引物（4種），利用特殊的鏈置換型DNA聚合酶，在65℃的恒溫條件下對胚細(xì)胞中的雄性特異性核酸序列和雌雄共有核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，最后通過反應(yīng)過程中獲得的副產(chǎn)物焦磷酸鎂與反應(yīng)溶液中的鎂離子反應(yīng)形成的白色沉淀來進(jìn)行早期胚胎性別的鑒定。牛胚胎的LAMP性別鑒定不需要繁瑣的電泳來進(jìn)行檢測和鑒定♂♂♂♂從上述現(xiàn)狀來看，在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用現(xiàn)代分子新技術(shù)，對早期胚胎進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的性別鑒定是可行的，可以獲得所需性別的后代。但由于早期胚胎性別鑒定需從胚胎上采取少量細(xì)胞，因而性別鑒定的胚胎經(jīng)冷凍-解凍處理后僅有少量胚胎存活，導(dǎo)致胚胎移植成功率下降，同時(shí)劣質(zhì)胚胎的性別鑒定成功率更低，這就制約了提供預(yù)知性別動(dòng)物胚胎的商業(yè)化進(jìn)程。因此，發(fā)展一種快速、準(zhǔn)確，且盡量減少對胚胎產(chǎn)生損害的非傷害性胚胎性別鑒定方法，這是今后共同研究的目標(biāo)。第三講胚胎體外生產(chǎn)、性控與保存技術(shù)胚胎冷凍技術(shù)的定義胚胎冷凍技術(shù)的意義胚胎冷凍技術(shù)的原理胚胎冷凍技術(shù)的方法胚胎冷凍保存技術(shù)一、胚胎冷凍的定義胚胎冷凍保存（cryopreservationofembryos）就是通過采用冷凍保護(hù)劑和降溫措施對動(dòng)物的早期胚胎進(jìn)行冷凍，使其能在超低溫條件下長期保存。

胚胎冷凍與卵子和精子的難易不同，方法類似。二、胚胎冷凍的意義適應(yīng)于胚胎移植的產(chǎn)業(yè)化，胚胎移植不受時(shí)間和空間的限制，能嚴(yán)格篩選受體，保證受體質(zhì)量，提高受胎率。便于胚胎運(yùn)輸，解決引種與運(yùn)輸種畜的困難，減少和防止傳染病傳播，可廣泛進(jìn)行國際和國內(nèi)優(yōu)良品種交流。建立胚胎庫，長期保存優(yōu)良家畜與瀕危動(dòng)物的遺傳資源。

三、胚胎冷凍原理哺乳動(dòng)物的胚胎細(xì)胞中，水分占細(xì)胞質(zhì)的80%以上，當(dāng)這些細(xì)胞在等滲溶液中冷卻至冰點(diǎn)以下時(shí)，經(jīng)維持一定的過冷狀態(tài)后，細(xì)胞的內(nèi)外均形成大量冰晶，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。如果采用合理的冷凍方法，加入冷凍保護(hù)劑，把細(xì)胞內(nèi)的冰晶降低到最小程度，就能避免或減少冷凍傷害，使其處在超低溫（液氮-196℃，液氦-269℃）下，代謝完全停止，升溫后細(xì)胞又恢復(fù)活性，從而達(dá)到長期保存的目的。四、胚胎冷凍方法慢速冷凍法（常規(guī)冷凍法）玻璃化冷凍法1、慢速冷凍法慢速冷凍的基本原理是在有可能造成冷凍傷害的各種因素之間找到一個(gè)最佳平衡點(diǎn)，這些因素包括冰晶形成、滲透壓損傷、冷凍保護(hù)劑的毒性、細(xì)胞內(nèi)濃縮的電解質(zhì)、溫度性傷害、透明帶破損、細(xì)胞器及細(xì)胞骨架的變化、細(xì)胞間連接的變化等；通過對冷凍速率的控制，使細(xì)胞內(nèi)外的液體自由交換而不會(huì)造成嚴(yán)重的滲透壓損傷和細(xì)胞形態(tài)變化，因此，這種方法又被稱為平衡冷凍法。慢速冷凍法是將胚胎置于含有低濃度抗凍劑的保存液中，經(jīng)過平衡、降溫、誘發(fā)結(jié)冰以后，以0.3~0.5℃/min的速率緩慢降溫，從而在胚胎內(nèi)形成玻璃化狀態(tài)，使胚胎得以保存的一種方法。慢速冷凍法經(jīng)過40年的發(fā)展，冷凍效果已基本穩(wěn)定，牛、山羊、綿羊、馬等動(dòng)物的凍胚移植相繼成功，在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用。慢速冷凍法的優(yōu)點(diǎn)是解凍后胚胎的存活率較高，適合規(guī)?；咛ダ鋬?，但其冷凍程序較繁瑣、費(fèi)時(shí)，而且冷凍過程中需要昂貴的程序降溫儀。2.玻璃化冷凍法玻璃化冷凍法是將胚胎放入含有高濃度抗凍劑的冷凍保存液中，通過快速降溫使胚胎內(nèi)外溶液形成玻璃化狀態(tài)，防止胚胎內(nèi)冰晶形成時(shí)造成的物理和化學(xué)損傷，從而使胚胎得以保存的一種方法。所謂玻璃化，即高濃度的抗凍劑，急速冷卻后，液體的黏性增加，冰晶不能形成，由液態(tài)變?yōu)橥该靼牍虘B(tài)的現(xiàn)象。玻璃化溶液①細(xì)胞內(nèi)液抗凍劑（滲透性）：這種抗凍劑分子量小