2.1微生物的實(shí)驗室培養(yǎng)(選修一)

課題1微生物的實(shí)驗室培養(yǎng)專題2:微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡單,個體多數(shù)十分微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進(jìn)行光合作用.一、基礎(chǔ)知識：

(一)微生物：是一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱．微生物原核生物界原生生物界真菌界病毒界(細(xì)菌、放線菌、藍(lán)藻)(酵母菌、霉菌、大型真菌)(草履蟲、變形蟲、衣藻)(噬菌體、艾滋病毒)病毒的結(jié)構(gòu)刺突囊膜衣殼(粒)核酸病毒的結(jié)構(gòu)示意圖蛋白質(zhì)、多糖、脂類構(gòu)成的膜決定病毒的遺傳性狀本質(zhì)為蛋白質(zhì)病毒

SARS冠狀病毒、禽流感病毒朊病毒（蛋白質(zhì)病毒）病毒的增殖吸附注入核酸合成核酸和蛋白質(zhì)釋放裝配只能在宿主的活細(xì)胞中進(jìn)行擬核，大型環(huán)狀DNA質(zhì)粒(小型環(huán)狀DNA，含抗生素，抗藥性，固氮基因)其成分為肽聚糖細(xì)菌的結(jié)構(gòu)特殊結(jié)構(gòu)細(xì)菌的外形與大小

常見的細(xì)菌典型形態(tài)A.球菌B.

桿菌C.弧菌D.螺旋菌D芽孢

有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。（抗逆性極強(qiáng)）例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細(xì)菌.菌落：單個或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。菌落細(xì)菌的菌落特征因種而異細(xì)菌的營養(yǎng)類型

根據(jù)細(xì)菌所利用的能源和碳源的不同，將細(xì)菌分為兩大營養(yǎng)類型。光能自養(yǎng)型:光合細(xì)菌化能自養(yǎng)型:硝化細(xì)菌,鐵細(xì)菌,硫細(xì)菌自養(yǎng)菌:分類,舉例?異養(yǎng)菌:腐生菌例如枯草桿菌寄生菌例如寄生在腸道內(nèi)的痢疾桿菌

(大部分病原菌)放線菌1、結(jié)構(gòu)：單細(xì)胞原核生物分支狀的菌絲（基內(nèi)菌絲、氣生菌絲）70%以上的天然抗生素均由土壤放線菌產(chǎn)生。如頭孢拉定、鏈霉素、金霉素、土霉素、慶大霉素、春雷霉素、四環(huán)素、紅霉素和卡那霉素等。真菌如圖是酵母菌電子顯微鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)酵母菌和霉菌青霉生殖直立菌絲營養(yǎng)菌絲腐生生活孢子生殖（二）培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。1.培養(yǎng)基的類型及用途種類是否含凝固劑用途固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基按物理性質(zhì)分是是否分離、計數(shù)等觀察微生物的運(yùn)動、鑒定菌種等工業(yè)生產(chǎn)固體培養(yǎng)基：菌落半固體培養(yǎng)基：無動力有動力(彌散)液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長按化學(xué)成分分種類化學(xué)成分是否明確用途天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基否是主要用于工業(yè)生產(chǎn)分類、鑒定按培養(yǎng)基的功能（用途）分種類制備方法原理用途舉例選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基加入某種化學(xué)物質(zhì)加入某種試劑或化學(xué)藥品依據(jù)某些微生物對某些物質(zhì)的抗性依據(jù)微生物的代謝產(chǎn)物與特定試劑或化學(xué)藥品反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化從眾多微生物中分離所需的微生物鑒別不同種類的微生物加入青霉素分離得到酵母菌和霉菌伊紅和美藍(lán)培養(yǎng)基可鑒別大腸桿菌選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基不加氮源的無氮培養(yǎng)基不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基分離酵母菌、霉菌等真菌分離金黃色葡萄球菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物（二）培養(yǎng)基

（1）按物理狀態(tài)分：（2）按功能分：（3）按成分分：1.培養(yǎng)基的類型固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、無機(jī)鹽、碳源和氮源等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求．3.培養(yǎng)基的成分碳源：為微生物提供碳元素。無機(jī)碳化合物——CO2、NaHCO3、CaCO3等有機(jī)碳化合物糖類（最常用的碳源，尤其是葡萄糖）烴類、醇類、脂肪酸蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等（有機(jī)大分子）牛肉膏、蛋白胨、花生粉餅、石油（天然）氮源:N2NH3等有機(jī)物中的氮無機(jī)氮牛肉膏、蛋白胨為微生物提供氮元素。圓褐固氮菌、硝化細(xì)菌和大腸桿菌氨鹽、硝酸鹽等是常用的氮源氮源主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮的代謝產(chǎn)物自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基的主要差別是()A．碳源B．氮源C．無機(jī)鹽D．特殊營養(yǎng)物質(zhì)A（三）無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)的概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。成功地培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵。

2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

3.常用的消毒與滅菌的方法比較項目理化因素的作用強(qiáng)度消滅微生物的程度芽孢和孢子能否被消滅消毒較為溫和部分生活狀態(tài)的微生物不能滅菌強(qiáng)烈全部微生物能（1）日常生活經(jīng)常用到的是

煮沸

消毒法；（2）對一些不耐高溫的液體，則使用

巴氏

消毒法（例如牛奶）；（3）對接種室、接種箱或超凈工作臺首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用

紫外線

進(jìn)行物理消毒。（4）實(shí)驗操作者的雙手使用酒精進(jìn)行消毒；（5）飲水水源用氯氣進(jìn)行消毒。消毒的方法1、灼燒滅菌滅菌的方法：接種環(huán)、接種針、試管口等的滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.如玻璃器皿、金屬用具等的滅菌如培養(yǎng)基、無菌水等的滅菌高壓蒸氣滅菌的原理是（）A．高壓使細(xì)菌DNA變性B．高壓使細(xì)菌蛋白質(zhì)凝固變性C．高溫燙死細(xì)菌D．高溫使細(xì)菌DNA變性B滅菌的方法：

1、灼燒滅菌2、干熱滅菌3、高壓蒸氣滅菌4、紫外線滅菌如表面滅菌和空氣滅菌等，所用器械是紫外燈

。1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗操作者的雙手答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思考關(guān)于滅菌和消毒的不正確的理解是A．消毒和滅菌實(shí)質(zhì)上是相同的B．滅菌是指殺死環(huán)境中的一切微生物的細(xì)胞、芽孢和孢子C．接種環(huán)用燒灼的方法滅菌D．常用滅菌方法有加熱法、過濾法、紅外線法、化學(xué)藥品法A微生物實(shí)驗室培養(yǎng)的基本操作程序1、器具的滅菌2、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存二、實(shí)驗操作（一）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細(xì)菌）1．計算、稱量2．溶化3．調(diào)pH：pH7．6

4．過濾：這一步可以省去。5．分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。6．加塞7．包扎操作步驟8．滅菌:

將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)基用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下滅菌2h。

9．倒平板:

待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種.10．無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。（二）純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法微生物的接種技術(shù)：平板劃線的操作一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細(xì)胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。稀釋涂布平板法問題討論涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？

應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)菌種的保存1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2、長期保存：甘油冷凍管藏法本課題知識小結(jié):四、課題成果評價

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。（三）是否進(jìn)行了及時細(xì)致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。【典例解析】例1．關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的A.是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽D.無機(jī)氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項，它的表達(dá)是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外的無機(jī)物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機(jī)鹽；而NaCl則只能提供無機(jī)鹽。對于D選項，無機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。答案：D例2．下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是A.防止雜菌污染B.消滅雜菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前答案：B解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因為發(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯誤的，因為滅菌的目的是防止雜菌污染，但實(shí)際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因為與發(fā)酵有關(guān)的所有設(shè)備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會把所接菌種也殺死。編號成分含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例3．右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型是

。（2）若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費(fèi)此培養(yǎng)基，可再加入

.（提示：金黃色葡萄球菌具耐鹽性）自養(yǎng)型微生物

含碳有機(jī)物

（3）若除去成分②，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)

。（4）表中營養(yǎng)成分共有

類。（5）不論何種培養(yǎng)基，在各種成分都溶化后分裝前，要進(jìn)行的是

。固氮微生物

3

調(diào)整pH

編號成分含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml（6）右表中各成分重量確定的原則是

。（7）若右表培養(yǎng)基用于菌種鑒定，應(yīng)該增加的成分

。依微生物的生長需要確定

瓊脂（或凝固劑）

編號成分含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml倒平板技術(shù)1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基