動物疫病鑒別檢測技術(shù) 第1部分：豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒-地方標(biāo)準(zhǔn)草案報批稿

ICS11.220CCSB41DB37 Animaldiseaseidentificationanddetectiontechnology——Part1:classicalswinefevervirulentstrainandvaccinestrain山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布本文件按照GB/T1.1－2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起本文件是DB37/TXXXX《動物疫病鑒別檢測技術(shù)》的第1部分。DB37/TXXXX已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實施。本文件由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。動物疫病是影響山東省畜牧業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一。不同病原或者相同病原的不同血清型/基因型引起疫病的臨床病癥具有一定程度的相似性，一些疫病弱毒疫苗的使用也干擾了病原的檢測。動物疫病鑒別檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的建立，規(guī)定了對不同病原、相同病原的不同血清型/基因型以及弱毒疫苗株的鑒別檢測，為山東省動物疫病精準(zhǔn)防控提供了技術(shù)支持，對于促進畜牧業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。豬瘟病毒（Classicalswinefever,CSFV）屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，是引起豬瘟的病原體。豬瘟嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)，世界動物衛(wèi)生組織將其列為必須通報的動物疫病之一，我國將其列為二類動物傳染病。豬是豬瘟病毒的唯一宿主。在自然條件下，病毒經(jīng)口腔和鼻腔途徑進入宿主，也可通過損傷的皮膚或傷口感染，感染的豬在潛伏期便可排出病毒，病毒隨病豬的分泌物和排泄物污染的飼料和飲水進入機體。我國從20世紀(jì)50年代便開始廣泛應(yīng)用兔化弱毒疫苗做預(yù)防注射，在控制豬瘟中起到重要的作用，隨著養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，集約化養(yǎng)豬場規(guī)模越來越大，國內(nèi)生豬的交易和流通日趨頻繁，給豬瘟的防制帶來了挑戰(zhàn)。各地豬瘟仍時有發(fā)生，而且多表現(xiàn)為非典型、慢性及隱性狀態(tài)，并出現(xiàn)豬瘟病毒的持續(xù)感染和妊娠母豬帶毒綜合征。這給獸醫(yī)臨床診斷帶來了很大困難。中國豬瘟弱毒疫苗的全面應(yīng)用，使生豬攜帶豬瘟疫苗毒成為常態(tài)，導(dǎo)致常規(guī)的豬瘟病毒核酸檢測難以區(qū)分豬瘟病毒的強毒感染和免疫接種的疫苗弱毒，迫切需要建立一種快速、特異的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來區(qū)分豬瘟強毒和豬瘟疫苗弱毒，為保障我省養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展發(fā)揮引領(lǐng)和示范作用。本標(biāo)準(zhǔn)制定后，作為《動物疫病鑒別檢測技術(shù)》的1部分，《動物疫病鑒別檢測技術(shù)》擬由以下部分構(gòu)成：——第1部分：豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒。目的在于規(guī)范豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒SYBRGreenI熒光RT-PCR鑒別檢測技術(shù)的操作，便于檢測技術(shù)在豬瘟臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢驗檢疫、豬瘟疫苗質(zhì)量控制等方面的穩(wěn)定應(yīng)用?！?部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型。目的在于規(guī)范兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型實時熒光RT-PCR鑒別檢測技術(shù)的操作，便于檢測技術(shù)在兔瘟臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢驗檢疫等方面的穩(wěn)定應(yīng)用。——第3部分：禽腺病毒Ⅰ群與禽腺病毒Ⅲ群。目的在于規(guī)范禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群PCR鑒別檢測技術(shù)的操作，便于檢測技術(shù)在禽腺病毒病臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢驗檢疫等方面的穩(wěn)定應(yīng)用。動物疫病鑒別檢測技術(shù)第1部分：豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒本文件規(guī)定了豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒SYBRGreenI熒光RT-PCR鑒別檢測。本文件適用于豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒的鑒別檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4試驗原理本文件通過特異性引物，在RT-PCR反應(yīng)體系中擴增出了豬瘟疫苗弱毒126bp及豬瘟強毒335bp的目的產(chǎn)物，當(dāng)SYBRGreenI熒光染料與擴增產(chǎn)物結(jié)合時，熒光信號增強，從擴增產(chǎn)物上釋放出來時，熒光信號急劇減弱，不同DNA擴增產(chǎn)物，Tm值不同，通過Tm值的差異及熒光信號的變化實現(xiàn)了豬瘟疫苗弱毒與豬瘟強毒擴增產(chǎn)物的鑒別。注：SYBRGreenI是一種只與雙鏈DNA小溝結(jié)合的染料。5試劑或材料除非另有說明，僅使用分析純試劑。5.1水：GB/T6682，一級。5.2焦碳酸二乙酯（DEPC）水：取1mLDEPC加入水至1000mL，充分震蕩混勻，靜置24h后，121℃高壓滅菌15min，2℃~8℃保存?zhèn)溆谩?.3磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：取Na2HPO4.12H2O2.9g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8g，溶于800mL水中，充分攪拌溶解，滴加濃鹽酸將pH調(diào)節(jié)至7.4，加水定容至1000mL，121℃高壓滅菌15min，2℃~8℃保存?zhèn)溆谩?.4氫氧化鈉溶液（3%稱取3g氫氧化鈉，溶于少量水中，放置室溫后，加水定容至100mL。5.5乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（4%）：稱取4g乙二胺四乙酸二鈉，加水定容至100mL。5.6引物：引物名稱和序列見附錄A。5.7商品化病毒核酸提取試劑盒。5.8商品化一步法熒光RT-PCR反應(yīng)試劑。5.9豬瘟疫苗弱毒陽性對照：市售商品化豬瘟兔化弱毒疫苗（傳代細胞源）。5.10豬瘟疫苗弱毒陰性對照：DEPC水。5.11豬瘟強毒陽性對照：含有豬瘟強毒株擴增目的基因的陽性質(zhì)粒。5.12豬瘟強毒陰性對照：DEPC水。5.13飲用水：清潔、無異味，pH值在6.5～8.5之間。6儀器設(shè)備6.1二級生物安全柜。6.2熒光PCR檢測儀。6.3電子天平：精度0.01g。6.4高速冷凍離心機：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。6.5瞬時離心機：轉(zhuǎn)速≥6000r/min。6.6低溫冰柜：-70℃以下。6.7高壓蒸汽滅菌器。6.8干熱滅菌器。7樣品7.1采樣工具7.1.1扁桃體采樣器：鼻鉗子、開口器和采樣槍。使用前均用3%的氫氧化鈉溶液浸泡消毒5min～10min，飲用水流水沖洗2min。7.1.2剪子、鑷子經(jīng)160℃干熱滅菌2h。7.2采樣7.2.1采樣要求采樣過程按照NY/T541執(zhí)行，采樣及樣品處理過程中應(yīng)戴一次性手套，樣品間不得交叉污7.2.2扁桃體樣品：鼻鉗子固定活豬上顎，用開口器打開口腔，用采樣槍采集扁桃體，滅菌牙簽挑至1.5mL離心管，編號標(biāo)記。7.2.3內(nèi)臟樣品：采集病死或安樂死的豬、兔各種內(nèi)臟器官（脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、肺臟、盲腸等）裝入一次性塑料袋或其他滅菌容器，編號標(biāo)記。7.2.4全血樣品：用無菌注射器采集全血，注入含有1/10體積4%的EDTA溶液的無菌容器內(nèi)，充分混勻后編號備用。7.2.5排泄物樣品：用棉拭子挑取少許新鮮糞便樣品于離心管內(nèi)，加入1mLPBS，震蕩混勻，編號標(biāo)記。27.2.6細胞培養(yǎng)物：取1mL細胞培養(yǎng)物置于離心管內(nèi)，編號標(biāo)記。7.2.7疫苗樣品：隨機抽取豬瘟活疫苗樣品3瓶，分別加入2mLPBS，溶解，編號標(biāo)記。7.3樣品的運輸及保存7.3.1運輸：采集的樣品密封后，采用保溫箱加冰密封，在2℃~8℃條件下24h內(nèi)運送到實驗7.3.2保存：采集的樣品在2℃~8℃條件下保存，時間不超過24h；-20℃不超過3個月，-70℃不超過5年。8試驗步驟8.1樣品處理8.1.1扁桃體樣品：樣品加入5倍體積4℃預(yù)冷的DEPC水，充分研磨，4℃、10000r/min離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入離心管中編號備用。8.1.2內(nèi)臟樣品：樣品加入5倍體積4℃預(yù)冷的DEPC水，充分研磨，4℃、10000r/min離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入離心管中編號備用。8.1.3排泄物樣品：4℃、10000r/min離心5min，取上清液0.5mL轉(zhuǎn)入離心管中編號備用。8.1.4細胞培養(yǎng)物：10000r/min離心5min，取上清液0.5mL轉(zhuǎn)入離心管中編號備用。8.1.5疫苗樣品：10000r/min離心5min，取上清液0.5mL轉(zhuǎn)入離心管中編號備用。8.1.6全血樣品：全血樣品可直接用做核酸提取。8.2核酸抽提進行豬瘟病毒檢測時，生物安全按照GB19489執(zhí)行，采用商品化試劑盒提取病毒核酸。8.3熒光RT-PCR檢測8.3.1反應(yīng)體系的配制反應(yīng)體系的配制見附錄B。8.3.2加樣在各設(shè)定的熒光RT-PCR管中分別加入陽性對照、陰性對照和提取的試樣溶液2μL，蓋緊管蓋，混勻，瞬時離心1min。8.3.3測定參考儀器參數(shù)，選擇SYBRGreenI熒光通道。參考擴增條件：第一階段，42℃反轉(zhuǎn)錄5min；第二階段，95℃預(yù)變性10s；第三階段，95℃變性5s，55℃退火10s，72℃延伸20s，40個循環(huán)。72℃時設(shè)置采集熒光。第四階段，溶解曲線分析，60℃1min，以0.1℃/s的速率升溫，直到97℃,整個過程連續(xù)采集熒光，繪制擴增產(chǎn)物的熔解曲線。9結(jié)果判定39.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)9.1.1豬瘟病毒疫苗弱毒9.1.1.1陰性對照：無Ct值，無典型擴增曲線，在熔解曲線Tm值為81.5℃±0.5℃范圍內(nèi)未出現(xiàn)熔解峰。9.1.1.2陽性對照：Ct值<30.0，并出現(xiàn)典型的擴增曲線，且熔解曲線Tm值在81.5℃±0.5℃出現(xiàn)熔解峰，參見附錄C（圖C.1）。9.1.1.3若陰、陽性對照組結(jié)果不成立，則視為無效檢驗。9.1.2豬瘟病毒強毒9.1.2.1陰性對照：無Ct值，無典型擴增曲線，在熔解曲線Tm值在83.3℃±0.9℃范圍內(nèi)未出現(xiàn)熔解峰。9.1.2.2陽性對照：Ct值<30.0，并出現(xiàn)典型的擴增曲線，且熔解曲線Tm值在83.3℃±0.9℃出現(xiàn)熔解峰，參見附錄C（圖C.2）。9.1.2.3若陰、陽性對照組結(jié)果不成立，則視為無效檢驗。9.2陰陽性結(jié)果的判定9.2.1豬瘟病毒疫苗弱毒9.2.1.1若檢測樣品無Ct值并且無典型的擴增曲線，在熔解曲線Tm值為81.5℃±0.5℃范圍內(nèi)未出現(xiàn)熔解峰，則判為豬瘟病毒疫苗弱毒核酸陰性。9.2.1.2若檢測樣品Ct值≤30.0，出現(xiàn)典型的擴增曲線，且熔解曲線Tm值為81.5℃±0.5℃出現(xiàn)熔解峰，則判為豬瘟病毒疫苗弱毒核酸陽性。9.2.1.3若檢測樣品30.0＜Ct值≤35.0，出現(xiàn)典型的擴增曲線，且熔解曲線Tm值為81.5℃±0.5℃出現(xiàn)熔解峰，則判為可疑?？梢蓸颖具M行雙孔重復(fù)試驗，若任一孔或兩孔重復(fù)試驗結(jié)果為陽性者判為豬瘟病毒疫苗弱毒核酸陽性，否則為陰性。9.2.2豬瘟病毒強毒9.2.2.1若檢測樣品無Ct值并且無典型的擴增曲線，在熔解曲線Tm值為83.3℃±0.9℃范圍內(nèi)未出現(xiàn)熔解峰，則判為豬瘟病毒強毒陰性。9.2.2.2若檢測樣品Ct值≤30.0，出現(xiàn)典型的擴增曲線，且熔解曲線Tm值在83.3℃±0.9℃出現(xiàn)熔解峰，則判為豬瘟病毒強毒核酸陽性。9.2.2.3若檢測樣品30.0＜Ct值≤35.0，出現(xiàn)典型的擴增曲線，且熔解曲線Tm值在83.3℃±0.9℃出現(xiàn)熔解峰，則判為可疑。可疑樣本進行雙孔重復(fù)試驗，若任一孔或兩孔重復(fù)試驗結(jié)果為陽性者判為豬瘟病毒強毒核酸陽性，否則為陰性。4附錄A（規(guī)范性）A.1引物名稱和序列見表A.1表A.1引物名稱和序列引物名稱引物序列（5′—3′）豬瘟病毒疫苗弱毒上游引物GGTCTCCACAGGGGGGGT豬瘟病毒疫苗弱毒下游引物ACTATTCTGTAACCTGTCTCATTT豬瘟病毒強毒上游引物TGGCACATGGAGTTGAATCAT豬瘟病毒強毒下游引物TGCGTCTCATTGAAAAACTCTA注：引物用DEPC水溶解并稀釋至100μmol/L后，-20℃保存?zhèn)溆?；根?jù)需要配制10μmol/L工作液，-20℃保存供檢測使用。′5附錄B熒光RT-PCR反應(yīng)體系配制B.1豬瘟病毒疫苗弱毒熒光RT-PCR反應(yīng)體系配制見表B.1表B.1豬瘟病毒疫苗弱毒熒光RT-PCR反應(yīng)體系試劑1個檢