elisa的檢測原理及步驟1

第頁ElisaKit使用方法檢測原理:本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA法?？谷薎L-4單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的IL-4會及單抗結(jié)合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素。生物素及親和素特異性結(jié)合；抗人IL-4抗體及結(jié)合在單抗上的人IL-4結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應(yīng)孔中有IL-4，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃。在450nm處測OD值，IL-4濃度及OD450值之間呈正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IL-4的濃度。試劑盒組成：1．抗體預(yù)包被酶標(biāo)板（8×12或8×6）2．凍干標(biāo)準(zhǔn)品（2/1支；0.5ng/支）3．標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液（橙蓋瓶）（1瓶；20ml/12ml）4．濃縮生物素化抗體（紫蓋瓶）（1支）5．生物素化抗體稀釋液（藍(lán)蓋瓶）（1瓶；16ml/10ml）6．濃縮酶結(jié)合物（棕蓋瓶）（1支）7．酶結(jié)合物稀釋液（紫蓋瓶）（1瓶；16ml/10ml）8．濃縮洗滌液20×（白蓋瓶）（1瓶；50ml/25ml）9．顯色底物（TMB）（棕蓋瓶）（1瓶；12ml/6ml）10．反應(yīng)終止液（紅蓋瓶）（1瓶；12ml/6ml）11．封板膠紙（6/3張）12．產(chǎn)品說明書（1份）標(biāo)本收集:1.收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。2.血漿抗凝劑推薦使用EDTA。避免使用溶血，高血脂標(biāo)本。3.標(biāo)本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。4.標(biāo)本收集后若不及時(shí)檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃，-70℃電冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融，3-6月內(nèi)檢測。5.如果您的樣本中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù))。注意事項(xiàng):1.試劑盒使用前請保存在2-8℃。復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)分裝后，將其放在-20～-70℃貯存。2.濃縮生物素化抗體，濃縮酶結(jié)合物體積小，運(yùn)輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。3.從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,屬于正?，F(xiàn)象，微加熱至40℃使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液。（加熱溫度不要超過50℃）使用時(shí)洗滌液應(yīng)為室溫。4.若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次用量分裝，將其放在-20～-70℃貯存。避免反復(fù)凍融。5.不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外）。6.充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用最低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。7.在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測時(shí)建議作雙孔檢測。8.試驗(yàn)中所用的試管和吸頭均為一次性使用，嚴(yán)禁在不同的液體之間混用！否則將影響試驗(yàn)結(jié)果。9.試驗(yàn)中請穿著試驗(yàn)服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作。特別是檢測血液或者其他體液標(biāo)本時(shí)，請按國家生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條列執(zhí)行。檢測前準(zhǔn)備工作:1.請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。2.將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:20)。未用完的放回4℃。3.標(biāo)準(zhǔn)品:加入標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本稀釋液0.5ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為1000pg/ml)。然后根據(jù)需要進(jìn)行稀釋。(建議標(biāo)準(zhǔn)曲線使用以下濃度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0pg/ml)。復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)品原液（1000pg/ml）若未用完請分裝后放入-20℃以下電冰箱內(nèi)保存，保存兩個(gè)月。已稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品請廢棄。4.生物素化抗體工作液：按當(dāng)次試驗(yàn)所需要得用量，使用前20分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:30)成工作濃度。當(dāng)日使用。若實(shí)驗(yàn)次數(shù)過多導(dǎo)致生物素化抗體量不足，可向我們公司單獨(dú)購買生物素化抗體。（須提供抗體批號）5.酶結(jié)合物工作液：按當(dāng)次試驗(yàn)所需要得用量，使用前20分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物(1:30)成工作濃度。當(dāng)日使用。若實(shí)驗(yàn)次數(shù)過多導(dǎo)致濃縮酶結(jié)合物量不足，可向我們公司單獨(dú)購買濃縮酶結(jié)合物。（須提供酶結(jié)合物批號）洗滌方法:1.自動(dòng)洗板機(jī)：要求注入的洗滌液為350ul，注入及吸出間隔15－30秒。洗板5次。2.手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350ul，靜置30秒后甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干。洗板5次。操作步驟:1．從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗(yàn)所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內(nèi)壓實(shí)自封條，密封口袋，放回4℃。2．空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液，其余相應(yīng)孔中加標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100ul/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱孵育90分鐘。3．提前20分鐘準(zhǔn)備生物素化抗體工作液。4．洗板5次。5．空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱孵育60分鐘。6．提前20分鐘準(zhǔn)備酶結(jié)合物工作液。避光室溫(22-25)℃放置。7．洗板5次。8．空白孔加酶結(jié)合物稀釋液，其余孔加入酶結(jié)合物工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱，避光孵育30分鐘。9．打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測程序。10．洗板5次。11．加入顯色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分鐘。12．加入終止液100ul/孔,混勻后即刻測量OD450值(3分鐘內(nèi))。在儀器保存讀數(shù)結(jié)果并打印一份紙質(zhì)結(jié)果。13．實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回電冰箱保存至有效期結(jié)束。建議保存酶標(biāo)板框，以備下次或者今后試驗(yàn)使用。結(jié)果判斷:1.每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去空白孔的OD值。2.手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。3.若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。靈敏度、特異性和重復(fù)性:●靈敏度：最小可測人IL-4達(dá)7pg/ml?！裉禺愋裕翰患癐L－1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反應(yīng)?！裰貜?fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%。IL-4簡介：IL-4是一種由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，以往稱為B細(xì)胞生長因子1。在B細(xì)胞生長的早期活化B細(xì)胞，并使被抗原、抗IgM或脂多糖活化的B細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期G1期。IL-4增強(qiáng)MHCII類抗原的表達(dá)和CD23（FceRII）在B細(xì)胞上的表達(dá)，誘導(dǎo)同種型（isotype）轉(zhuǎn)換，如促使小鼠B細(xì)胞從分泌IgM、IgG3、IgG2b轉(zhuǎn)變成分泌IgG1、IgG2a、