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文檔簡介
1/1CEAsiRNA載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染人食管癌EC9706細胞的沉默作用CEAsiRNA載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染人食管癌EC9706細胞的沉默作用【摘要】目的:
應(yīng)用RNA干擾技術(shù),構(gòu)建針對CEA的siRNA載體,抑制人食管癌EC9706細胞CEA基因的表達.方法:
依據(jù)設(shè)計siRNA的原則,針對人CEA的mRNA序列,設(shè)計并合成編碼siRNA的兩對寡核苷酸序列,經(jīng)退火成互補雙鏈,克隆入載體pRNATU6.2中構(gòu)建重組體pRNATU6.2CEA,篩選、鑒定.然后轉(zhuǎn)染重組體至人食管癌EC9706細胞中,經(jīng)G418篩選,獲得陽性克隆,并以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和未進行轉(zhuǎn)染的EC9706作對照,運用PCR和WesternBlot檢測CEA的表達.結(jié)果:
測序鑒定證實目的寡核苷酸片斷已被克隆到pRNATU6.2載體中,pRNATU6.2CEA轉(zhuǎn)染人食管癌EC9706細胞后,CEA基因表達在mRNA和蛋白質(zhì)水平都受到顯著抑制.結(jié)論:
成功構(gòu)建了針對人食管癌EC9706細胞的siRNA載體,可有效抑制CEA的表達,為進一步從分子水平探討CEA的功能奠定了基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】EC9706細胞系干擾RNA癌胚抗原0引言CEA(carcinoembryonicantigen)屬于非器官特異性腫瘤相關(guān)抗原,它不僅作為一種單純的腫瘤標志物存在,而且是與腫瘤惡性化有關(guān)的一種復(fù)雜的分子.但目前對于CEA分子水平的研究主要集中在腫瘤治療前、治療中、治療后CEA表達的變化及其與腫瘤診斷、治療、預(yù)后的關(guān)系[1-3].CEA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有無內(nèi)在聯(lián)系,對治療過程有什么影響,文獻中未見深入報道.本研究利用RNA干擾技術(shù),構(gòu)建針對CEA的小分子干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)表達載體,并轉(zhuǎn)染EC9706細胞,旨在實現(xiàn)對CEA表達的抑制,為進一步從分子水平探討CEA功能及對治療的影響打下基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料人食管癌EC9706細胞系由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室惠贈.大腸桿菌Top10,pRNATU6.2質(zhì)粒由鄭州大學免疫與微生物教研室提供.限制性內(nèi)切酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RealTimePCR擴增試劑盒均為TaKaRa產(chǎn)品.鼠抗人CEA及actinmAb和酶標羊抗鼠IgG為Sigma公司產(chǎn)品.CEA基因RNAi寡核苷酸,CEA基因和actin基因PCR引物均由上海生物工程公司合成測序.1.2方法1.2.1引物設(shè)計在GenBank中查找人CEA的mRNA全序列,通過Blast軟件確定與其它非相關(guān)基因無同源性,按照pRNATU6.2載體的要求設(shè)計編碼siRNA的寡核苷酸鏈.設(shè)計的siRNA兩對寡核苷酸序列如下:
SCEA1上游引物為5TGATGGCAACCGTCAAATTATTCAAGAGATAATTTGACGGTTGCCATCTTTTTTC3,下游引物為5TCGAGAAAAAAGATGGCAACCGTCAAATTATCTCTTGAATAATTTGACGGTTGCCATCA3;SCEA2上游引物為5TGATGTAGGACCCTATGAGTTTCAAGAGAACTCATAGGGTCCTACATCTTTTTTC3,下游引物為5TCGAGAAAAAAGATGTAGGACCCTATGAGTTCTCTTGAAACTCATAGGGTCCTACATCA3.RealTimePCR一對引物5ACCACAGTCACGACGATCAC3,5CGCTGTGGTCAACACTTAAT3.1.2.2siRNA表達載體的構(gòu)建將合成的寡核苷酸單鏈稀釋后退火成雙鏈,連接到siRNA載體pRNATU6.2,將重組載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細菌(Top10),篩選,PCR驗證后提取質(zhì)粒,并做雙酶切和測序鑒定.1.2.3細胞轉(zhuǎn)染取pRNATU6.2SCEA1,SCEA2重組體及空載體分別轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的EC9706細胞,轉(zhuǎn)染方法參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明進行,轉(zhuǎn)染24h后用G418(濃度400mg/L)篩選,待細胞穩(wěn)定后收集,同時收集同批未進行轉(zhuǎn)染的EC9706作為陰性對照,分別命名為干擾1組、干擾2組、空載體組及對照組.1.2.4RealTimePCR分析Trizol法提取轉(zhuǎn)染細胞和對照細胞的總RNA(方法按試劑盒說明),逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈(Gbico公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒及說明).標準曲線的建立:
將actin質(zhì)粒標準品原液按梯度稀釋成0.1,0.05,0.025,0.0125,0.00625拷貝/L.使用RealTimePCR擴增儀進行熒光定量PCR檢測,反應(yīng)條件中加入溶解曲線的制備.1.2.5WesternBlot檢驗CEA蛋白的表達培養(yǎng)細胞蛋白質(zhì)樣品的制備:
收集各組細胞,用細胞裂解液和蛋白保護液裂解細胞,經(jīng)渦旋離心后取上清,紫外分光光度計測定蛋白濃度備用;制備SDSPAGE凝膠,并做預(yù)電泳;每孔加樣品40g,Marker加10L,電泳;染色和脫色,切膠.電轉(zhuǎn);封閉,加1抗孵育,TBST洗后加酶標2抗;TBST洗后,顯影,定影;用actin作內(nèi)參照驗證蛋白的含量.統(tǒng)計學處理:
組間比較采用單因素方差分析,Plt;0.05認為差異有統(tǒng)計學意義.2結(jié)果2.1重組體鑒定結(jié)果2.1.1酶切鑒定重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切后得到大于2000bp的條帶和小于100bp的條帶,與質(zhì)粒和目的條帶的大小相符(圖1).1:
pRNATU6.2SCEA1;2:
pRNATU6.2SCEA2;3:
marker.圖1重組載體的雙酶切鑒定2.1.2測序鑒定經(jīng)過篩選的重組體pRNATU6.2SCEA1,SCEA2測序結(jié)果,與設(shè)計靶向CEA的寡核苷酸序列比較完全一致(圖2).圖2重組體插入片斷(SCEA1,2)的測序結(jié)果2.2CEAsiRNA轉(zhuǎn)染EC9706細胞的RealTimePCR鑒定2.2.1標準曲線的建立和回歸方程用SPSS11.0軟件對actin質(zhì)粒稀釋濃度的對數(shù)和相應(yīng)的拷貝數(shù)進行直線回歸分析.得到的直線回歸方程為lgY=-0.575-0.397X.模板的溶解曲線顯示為單峰,且峰值單一,說明產(chǎn)物特異(圖3).圖3RealTimePCR熔解曲線2.2.2樣品的定量檢測分別以CEA和actin為引物擴增樣本,其CT值代入標準曲線方程,求出相應(yīng)的mRNA含量,并求出樣本中CEAmRNA對actinmRNA的相對含量,對照、空載體(pRNATU6.2)、干擾1(pRNATU6.2SCEA1)及干擾2(pRNATU6.2SCEA2)分別為:
0.180.11,0.190.10,0.060.02,0.050.03.干擾1組、干擾2組與對照組及空載體組相比,都有顯著統(tǒng)計學意義(Plt;0.01).2.3CEAsiRNA轉(zhuǎn)染EC9706細胞的WesternBlot鑒定干擾1組和干擾2組與對照組、空載體組相比蛋白條帶明顯減弱(圖4).1:
對照;2:
空載體;3:
干擾1;4:
干擾2.圖4WesternBlot鑒定結(jié)果3討論CEA是一種胚胎性致癌抗原,主要存在于胎兒消化道上皮組織、胰腺和肝臟中,成人消化道可產(chǎn)生少量CEA,在膽道、羊水、肺、乳腺等組織中也可見少量CEA.約95%的結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、大多數(shù)非小細胞型肺癌、頭頸鱗癌及約50%的乳腺癌有CEA表達[4].Nakashima等[5]用RTPCR方法對54例食管癌外周血CEAmRNA進行檢測,發(fā)現(xiàn)陽性率為57.4%,且陽性患者的腫瘤復(fù)發(fā)率明顯高于陰性患者.我們在研究復(fù)制選擇性溶瘤腺病毒時發(fā)現(xiàn)CEA在對溶瘤病毒敏感和不敏感腫瘤細胞中的表達有較大差異,同時檢測到CEA在人食管癌EC9706細胞中高表達,而且食管癌對溶瘤腺病毒敏感性不高.因此,希望通過RNA干擾技術(shù)構(gòu)建CEAsiRNA載體來降低EC9706細胞中CEA的表達,以進一步探討CEA的內(nèi)在功能及對溶瘤腺病毒抗食管癌的效果有無改善.RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要基因沉默技術(shù),又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)[6].RNAi技術(shù)近年來發(fā)展迅速,已成為分子生物學研究的主要技術(shù)手段之一,在功能基因組研究、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究及基因治療方面顯示出巨大的前景.研究表明,利用質(zhì)?;虿《据d體體內(nèi)合成的siRNA,體內(nèi)抑制目的基因的效果與合成siRNA相似,但卻花費低、成本小,還可克服合成siRNA可能造成的RNase的污染[7].本研究利用pRNATU6.2載體,構(gòu)建的重組體轉(zhuǎn)染細胞后,siRNA將持續(xù)產(chǎn)生,并通過識別、降解具有同源序列的mRNA最終干擾目的基因的表達,同時載體上帶有免疫熒光標記利于觀察重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率.本實驗構(gòu)建的針對CEA的siRNA表達載體成功的轉(zhuǎn)染EC9706細胞,用RealTimePCR及WesternBlot方法從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測表明轉(zhuǎn)染特異的siRNA能夠抑制人食管癌EC9706細胞中CEA的表達,基因沉默的效果顯著.這證實我們可以通過RNAi技術(shù)調(diào)控CEA表達,為進一步探討CEA的功能及對溶瘤腺病毒的殺傷效果有無影響及作用機制奠定了基礎(chǔ).【參考文獻】[1]SunuchiK,MachinamiR,MoriM,etal.Clinicalimpactofcarcinoembryonicantigenmessengerribonucleicacidexpressionintumordrainingveinbloodonpostoperativelivermetastasisinpatientswithcolorectalcarcinoma:Aprospective,cohortstudy[J].DisColonRectum,2003,46(4):467-473.[2]徐秀云.CEA與CA50聯(lián)合檢測鑒別消化系統(tǒng)良惡性疾?。跩].第四軍醫(yī)大學學報,2002,3(14):1314.[3]張建華,鐘懷印,薛承巖.CEAmRNA2CEAp系統(tǒng)在良惡性腹水中表達差別的臨床意義[J].第四軍醫(yī)大學學報,2005,26(24):2277-2279.[4]GuadagniF,KantorJ,AloeS,etal.DetectionofbloodbornecellsincolorectalcancerpatientsbynestedreversetranscriptionpolymerasechainreactionforcarcinoembryonicantigenmessengerRNA:Longitudinalanalysesanddemonstrationofitspotentialimportanceasanadjuncttomultipleserummarkers[J].CancerRes,2001,61(6):2523-2532.[5]NakashimaS,NatsugoeS,MatsumotoM,etal.Clinicalsignificanceofcirculatingtumorcellsinbloodbymoleculardetectionandtumormarkersinesophagealcancer[J].Surgery,2003,133(2):162-169.
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