RNA干擾Nucleostemin基因?qū)θ耸彻馨〦ca109細(xì)胞株增殖影響的實驗研究-2

1/1RNA干擾Nucleostemin基因?qū)θ耸彻馨〦ca109細(xì)胞株增殖影響的實驗研究RNA干擾Nucleostemin基因?qū)θ耸彻馨〦ca109細(xì)胞株增殖影響的實驗研究作者：

鄭學(xué)芝，劉桂蓮，李麗，孫衛(wèi)，念紅，胡靜,蔡子微【摘要】目的篩選NS基因特異性siRNA陽性細(xì)胞克隆，研究NS基因特異性RNA干擾對Eca109細(xì)胞株體外增殖能力的影響。

方法用脂質(zhì)體法將NS特異性siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，Zeocin抗生素壓力篩選后用PCR方法鑒定陽性克隆；MTT法檢測各組細(xì)胞的生長增殖情況，RTPCR方法檢測NS基因表達(dá)量的變化情況。

結(jié)果與對照組比較，silencer組腫瘤細(xì)胞趨于分化，細(xì)胞增殖抑制率超過80%(P0.01)，差異具有顯著性；NS基因表達(dá)量下降。

結(jié)論NS基因特異性RNA干擾抑制人食管癌Eca109細(xì)胞株體外增殖，使NS基因表達(dá)量下降。

【關(guān)鍵詞】Nucleostemin（NS）;RNA干擾；食管癌；基因表達(dá)；細(xì)胞增殖Abstract：

ObjectiveToscreenNSgenespecificpositivecellclones,andinvestigatetheeffectofhumanesophaguscancerEca109cellsproliferationinvitrobyNSgenespecificRNAinterference.MethodsTheNSsiRNAexpressionvectorwastransfectedintohumanesophaguscancerEca109cellsusingLIPOFECTAMINETMXXXX年新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)核因子［1］，該基因在干細(xì)胞及人類的數(shù)種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)豐度很高，但在分化的成體組織中，該基因卻不表達(dá)。

二位學(xué)者提出干細(xì)胞與癌細(xì)胞均由相同的蛋白質(zhì)－NS來決定其細(xì)胞自我復(fù)制的能力，NS可能是干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞通過G2/S檢驗點的特異性調(diào)控因子。

本文將以人食管癌Eca109細(xì)胞株為實驗材料探討NS基因特異性RNA干擾對食管癌Eca109細(xì)胞株體外增殖能力的影響。

1材料和方法1.1材料人食管癌Eca109細(xì)胞購于上海細(xì)胞所；1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶為Gibco公司；PCDNA4/CNSsilencer質(zhì)粒[2]；MTT、DMSO、Zeocin、LipofectamineTM2000Reagent：

Invitrogen公司;RNA、DNA試劑盒;RTPCR試劑盒：

TaKaRa公司;引物合成：

上海申能博彩生物科技有限公司。

1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及NS基因轉(zhuǎn)染人食管癌Eca109細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2潮濕空氣的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

脂質(zhì)體法將PCDNA4/CNSsilencer質(zhì)粒及空載體PCDNA4/Cvector質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，分別命名為silencer組、vector組，未轉(zhuǎn)染的Eca109細(xì)胞記為normal組。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行Zeocin抗生素篩選；陽性細(xì)胞克隆繼續(xù)在含Zeocin抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2陽性細(xì)胞克隆的鑒定提取克隆細(xì)胞基因組DNA，以Zeocin基因為目的基因，通過PCR方法進(jìn)行細(xì)胞克隆外源基因整合陽性鑒定，同時以normal組腫瘤細(xì)胞作對照。

其引物序列為：

上游引物5atggccaagttgaccagtgc；下游引物為5tcagtcctgctcctcggcca。

PCR反應(yīng)條件為：

94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30循環(huán)，最后72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物大小約370bp。

1.2.3生長曲線的繪制[3]將三組細(xì)胞傳到24孔板上（1104細(xì)胞/孔），每組18復(fù)孔，分別于24h、48h、72h、96h、120h、144h用計數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，繪出各組細(xì)胞的生長曲線。

1.2.4細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化情況。

1.2.5MTT比色法測定細(xì)胞增殖抑制率[3]在96孔培養(yǎng)板上接種三組細(xì)胞，每組24復(fù)孔（1103細(xì)胞/孔），分別于24h、48h、72h三個時間段進(jìn)行MTT測定，以培養(yǎng)液做空白對照并調(diào)零，用酶標(biāo)儀測定490nm處的吸光度值（OD值），每次每組測定8復(fù)孔。

細(xì)胞增殖抑制率＝1-細(xì)胞存活率即細(xì)胞增殖抑制率＝（1-silencer組OD值/Normal組OD值）100%1.2.6各組腫瘤細(xì)胞NS基因表達(dá)水平檢測提取腫瘤細(xì)胞總RNA，用RTPCR方法驗證各組腫瘤細(xì)胞NS基因表達(dá)情況。

參照genebank中NS和GAPDH的基因序列及參考文獻(xiàn)[4]設(shè)計引物如下:NS基因上游P1：

5atgaaaaggcctaagttaaagaaagc，下游P2：

5gctctccaaattctcctttggta；GAPDH上游為P3：

5ggtggacctgacctgccgtctaga，下游P4：

5ttactccttggaggccatgtggg；擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為570bp和280bp，在同一體系內(nèi)反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30循環(huán)，最后72℃延伸10min。

1.2.7統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)以s表示，統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.5軟件，進(jìn)行t檢驗。

2結(jié)果2.1PCR法鑒定陽性細(xì)胞克隆抗Zeocin的細(xì)胞克隆部分PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1；silencer組與vector組皆檢測到Zeocin基因條帶，而normal組無，即細(xì)胞克隆外源基因整合陽性。

2.2細(xì)胞生長曲線的繪制各時間段silencer組細(xì)胞數(shù)目低于對照vector組（P0.01）和normal組（P0.01），差異具有顯著性；細(xì)胞生長曲線見圖2。

2.3各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化silencer組細(xì)胞與對照vector組和normal組相比體積變小并趨向于均一，多數(shù)細(xì)胞由梭形趨向變圓，核質(zhì)比變小，瘤巨細(xì)胞減少，細(xì)胞趨于分化。

2.4MTT比色法測定細(xì)胞增殖能力細(xì)胞培養(yǎng)24h后，silencer組細(xì)胞增殖抑制率分別為normal組（P0.01）的94%和vector組（P0.01）的93%；細(xì)胞培養(yǎng)48h后，silencer組細(xì)胞增殖抑制率分別為normal組（P0.01）的80%和vector組（P0.01）的78%；細(xì)胞培養(yǎng)72h后，silencer組細(xì)胞增殖抑制率分別為normal組（P0.01）的88%和vector組（P0.01）的87%；細(xì)胞增殖曲線見圖3。

2.5各組腫瘤細(xì)胞NS基因表達(dá)水平silencer組腫瘤細(xì)胞NS基因表達(dá)水平明顯低于對照vector組和normal組，見圖4。

3討論NS基因是一種p53結(jié)合蛋白，主要存在于核仁中，在核質(zhì)中也有低量表達(dá)；在干細(xì)胞處于早期多潛能狀態(tài)時該基因的表達(dá)豐度很高，而在分化開始時，這個基因的表達(dá)卻突然幾乎完全消失[1]。

本室與中科院遺傳發(fā)育研究所合作證實了多種腫瘤組織中都有NS基因的表達(dá)[5，6]，運用siRNA真核表達(dá)載體，使宮頸癌Hella細(xì)胞的增殖被抑制，細(xì)胞內(nèi)NS基因的表達(dá)量下降[7，8]。

本實驗將PCDNA4/CNSsilence載體轉(zhuǎn)染人食管癌Eca109細(xì)胞，同步轉(zhuǎn)染PCDNA4/Cvector空載體作對照。

經(jīng)過Zeocin抗生素壓力篩選獲得陽性細(xì)胞克隆，并通過PCR方法驗證克隆細(xì)胞外源基因整合陽性。

與對照組vector和normal組比較，silencer組細(xì)胞的腫瘤生物學(xué)行為發(fā)生了顯著的變化，細(xì)胞增殖明顯變慢，趨向于分化；MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制率測定顯示silencer組細(xì)胞的增殖速率明顯低于兩對照組；細(xì)胞增殖抑制率大于80%；各組細(xì)胞RTPCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示silencer組腫瘤細(xì)胞中NS基因表達(dá)量明顯下降。

實驗結(jié)果表明，我們構(gòu)建的針對NS基因的特異性siRNA的表達(dá)載體PCDNA4/CNSsilencer是成功并有效用的，將其轉(zhuǎn)染入人食管癌細(xì)胞后，通過RNA干擾機(jī)制使部分NS基因沉默，從而產(chǎn)生了抑制Eca109細(xì)胞分裂、增殖的效應(yīng)。

同時提示調(diào)節(jié)NS基因活性可能對腫瘤有防治作用，NS基因能夠預(yù)測腫瘤的發(fā)展趨勢，有可能成為一種新的腫瘤標(biāo)記物。

但是NS蛋白活動的精確分子機(jī)制尚不完全清楚，這仍然需要大量的實驗工作去證實。

運用RNA干擾技術(shù)對NS基因進(jìn)行深入研究可能會揭示或部分揭示干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增殖之迷，為腫瘤的早期診斷、基因治療和預(yù)后及以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程等提供理論依據(jù)和工作基礎(chǔ)。

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