3.2基因工程的基本操作程序第2課時(shí)高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修三

3.2基因工程的基本操作程序【補(bǔ)充】基因的結(jié)構(gòu)DNA片段基因1基因2基因3放大基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段能編碼特定的蛋白質(zhì)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游能轉(zhuǎn)錄出mRNA，進(jìn)一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)。不轉(zhuǎn)錄、不翻譯不轉(zhuǎn)錄、不翻譯非編碼區(qū)：含有能調(diào)控遺傳信息表達(dá)的DNA序列，如啟動(dòng)子、終止子啟動(dòng)子終止子獲取目的基因一般獲取哪一部分的DNA片段？基因編碼區(qū)獲取了足夠量的Bt基因后，下一步就是要讓基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；同時(shí)，使Bt基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用這就是需要構(gòu)建基因表達(dá)載體。這也是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的核心工作1.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的：2.基因表達(dá)載體的組成思考：要各個(gè)部分有什么作用？（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。（核心步驟）02目的基因：能控制表達(dá)所需要的特殊性狀必須插到啟動(dòng)子和終止子之間復(fù)制原點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)終止子：本質(zhì)：有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位置：基因的下游功能：終止轉(zhuǎn)錄四環(huán)素抗性基因、熒光蛋白基因等啟動(dòng)子：本質(zhì)：有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA標(biāo)記基因：鑒別或篩選含有重組DNA分子的受體細(xì)胞（如：已成功轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞具有某種抗性基因，可在相應(yīng)選擇培養(yǎng)基中生長）02基因表達(dá)載體的構(gòu)建

當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：普通的細(xì)菌一般是對(duì)抗生素______（敏感/不敏感）的，在含有青霉素或四環(huán)素的培養(yǎng)基中______（能/不能）生長。如果給普通細(xì)菌導(dǎo)入一個(gè)含有四環(huán)素抗性基因的質(zhì)粒，四環(huán)素抗性基因的____________可使細(xì)菌獲得抵抗四環(huán)素的性狀。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是被導(dǎo)入了載體的受體細(xì)胞。敏感不能表達(dá)產(chǎn)物【思考】如何利用標(biāo)記基因篩選呢？啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子【區(qū)分兩組概念】位于DNA上位于mRNA上啟動(dòng)翻譯終止翻譯啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄(本身不轉(zhuǎn)錄)決定氨基酸不決定氨基酸對(duì)比啟動(dòng)子起始密碼子終止子終止密碼子所在位置DNAmRNADNAmRNA作用RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)。翻譯的起始點(diǎn)AUG(甲硫氨酸）GUG（纈氨酸）轉(zhuǎn)錄的終點(diǎn)翻譯的終點(diǎn)（UAA、UGA、UAG)02基因表達(dá)載體的構(gòu)建重組DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位點(diǎn)獲取目的基因DNA連接酶基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖限制酶啟動(dòng)子限制酶切割位點(diǎn)終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)質(zhì)粒同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶？基因表達(dá)載體3.構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程限制酶目的基因限制酶切割位點(diǎn)獲取目的基因限制酶重組DNA分子DNA連接酶啟動(dòng)子終止子質(zhì)粒限制酶切割位點(diǎn)①用限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口；②用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，獲取目的基因；③用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體缺口處，形成重組DNA分子。目的基因與質(zhì)粒載體缺口的末端相同，便于連接（重組質(zhì)粒）3.構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程基因表達(dá)載體基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心步驟）02基因表達(dá)載體重組DNA分子目的基因DNA限制酶限制酶DNA連接酶載體②能自我復(fù)制,或整合到受體DNA上隨受體DNA同步復(fù)制①有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)③具有標(biāo)記基因

④對(duì)受體細(xì)胞無毒載體應(yīng)具備條件：限制酶切割位點(diǎn)標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)載體的種類：質(zhì)粒（常用）、噬菌體、動(dòng)植物病毒目的基因DNA限制酶切割位點(diǎn)標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)質(zhì)粒載體與基因表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。基因表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因。【問題探究】請結(jié)合下圖，回答問題：（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？不能因?yàn)镾maⅠ切割會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。質(zhì)粒上的抗性基因是標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無法進(jìn)一步篩選。（2）只使用EcoRⅠ分別切割質(zhì)粒和外源DNA，能否構(gòu)建基因表達(dá)載體？能會(huì)出現(xiàn)以下產(chǎn)物：①目的基因——載體連接物②載體——載體連接物③目的基因——目的基因連接物②③分別叫做載體的自身環(huán)化和目的基因的自身環(huán)化×活動(dòng)一：用同一種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，用DNA連接酶連接后會(huì)出現(xiàn)幾種產(chǎn)物(只考慮兩兩結(jié)合)？

單酶切只用一種限制酶切割的時(shí)候可能會(huì)出現(xiàn)什么問題？質(zhì)粒與目的基因反向連接單酶切缺點(diǎn):質(zhì)粒重新環(huán)化目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒與目的基因反向連接02基因表達(dá)載體的構(gòu)建（3）與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)是什么？①可以防止質(zhì)粒、目的基因的自身環(huán)化連接；②還可以防止目的基因與載體的反向連接。所以如何防止目的基因和載體的自身環(huán)化以及目的基因的反向連接？雙酶切（產(chǎn)生不同的黏性末端）用兩種不同的限制酶同時(shí)對(duì)目的基因和載體進(jìn)行切割【問題探究】請結(jié)合下圖，回答問題：雙酶切用兩種不同的限制酶同時(shí)對(duì)目的基因和載體進(jìn)行切割【實(shí)戰(zhàn)】圖解限制酶的選擇原則（1）不破壞目的基因：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SamⅠ。（2）保留標(biāo)記基因（至少保留1個(gè)完整的標(biāo)記基因）、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。（3）確保載體和目的基因出現(xiàn)相同黏性末端：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中PstⅠ；（4）為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和目的基因反向連接到載體，可選用什么限制酶？可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種不同的限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒。1.轉(zhuǎn)化指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程，此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。2.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞冠癭瘤農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤等。（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法②農(nóng)桿菌特點(diǎn)：a.能在自然條件下侵染_____________和___________，而對(duì)大多數(shù)____________沒有侵染能力。雙子葉植物裸子植物單子葉植物b.農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有______，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將___

___上的____

__（____________）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其________________________Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒T-DNA可轉(zhuǎn)移的DNA整合到該細(xì)胞的染色體DNA上將目的基因插入__________________中，通過農(nóng)桿菌的________作用，就可以使目的基因__________________并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩(wěn)定和表達(dá)。③利用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化的思路：Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物細(xì)胞（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞--農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。載體：農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒（T-DNA)03閱讀P81資料卡，完成以下填空：T-DNA目的基因構(gòu)建表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞表現(xiàn)出新性狀的植物植物細(xì)胞將目的基因插入染色體DNA中？植物組織培養(yǎng)非人工操作非人工操作（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞--農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法過程雙子葉、裸子植物受損傷口分泌酚類物質(zhì)和糖類物質(zhì)吸引農(nóng)桿菌向受傷組織集中將Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞中，并且將其整合到該細(xì)胞染色體DNA上。激活Vir區(qū)基因，導(dǎo)致T-DNA加工和轉(zhuǎn)移（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞--農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法過程(1)第一次拼接______________________________________________________________________(2)第二次拼接______________________________________________________________________(3)第一次導(dǎo)入_____________________________________________________________________(4)第二次導(dǎo)入____________________________________________________________________將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上（非人工操作）兩兩將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞（非人工操作）03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞據(jù)圖回答問題：03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第1次拼接第2次拼接第1次導(dǎo)入第2次導(dǎo)入該過程經(jīng)過____次拼接、____次導(dǎo)入？1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA與目的基因是什么關(guān)系？T-DNA不是目的基因，但它將來會(huì)被整合到宿主細(xì)胞染色體的DNA上，只要將目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以隨T-DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞并整合到宿主細(xì)胞的染色體上。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，目的基因只能進(jìn)入植物的一個(gè)體細(xì)胞中，但基因工程最終要的是一個(gè)轉(zhuǎn)基因植株，如何實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)？

得到含有目的基因的植物細(xì)胞后進(jìn)行植物組織培養(yǎng)思考討論：03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片__________________，然后________________，并_____________。受體細(xì)胞為_______與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成植株體細(xì)胞b.可以將_______直接浸沒在___________________中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得_______，再進(jìn)行________、_________等。受體細(xì)胞為_______花序含有農(nóng)桿菌的溶液種子篩選鑒定受精卵（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞--農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①用______________將________________________直接注入_______中。微量注射器含目的基因的DNA溶液子房②在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去______，將____________滴加在_________上，使目的基因借助________________進(jìn)入_______。柱頭DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊受體細(xì)胞：受精卵子房花粉柱頭花粉管精子卵細(xì)胞胚囊（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞--花粉管通道法我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的將Bt基因?qū)朊藁?xì)胞的方法花粉管通道法是我國科學(xué)家周光宇在1987年獨(dú)創(chuàng)的。將重組DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道內(nèi)，進(jìn)入卵細(xì)胞、合子或早期胚胎細(xì)胞中。此方法直接、簡便且經(jīng)濟(jì)，已應(yīng)用于水稻、小麥、棉花、大豆等多種植物中。03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞②操作過程：為什么常選受精卵作為受體細(xì)胞呢？（2）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞--顯微注射法①體積大，易操作。②全能性高，易培養(yǎng)成完整個(gè)體。構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動(dòng)物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植（移植到同期發(fā)情的母畜子宮內(nèi)）獲得具有新性狀的動(dòng)物①受體細(xì)胞：受精卵拓展：【其他方法】科學(xué)家也用病毒DNA

與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動(dòng)物細(xì)胞，也能使目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞內(nèi)。如慢病毒載體、腺病毒載體等。（2）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞03選