和?；铙w采卵體外受精胚胎生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

1和?；铙w采卵/體外受精胚胎生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程本文件確立了和?；铙w采卵/體外受精胚胎生產(chǎn)技術(shù)流程，規(guī)定了供體的選擇與飼養(yǎng)管理、活體采卵、體外成熟、體外受精、體外培養(yǎng)及胚胎質(zhì)量鑒定、胚胎玻璃化冷凍與解凍技術(shù)要求，描述了證實(shí)方法。本文件適用于和?；铙w采卵/體外受精胚胎生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4143牛冷凍精液GB/T25881牛胚胎GB/T26938牛體內(nèi)胚胎生產(chǎn)與移植技術(shù)規(guī)程GB/T30396牛冷凍精液包裝、標(biāo)簽、貯存和運(yùn)輸GB/T31582牛性控冷凍精液3術(shù)語(yǔ)和定義GB/T25881和GB/T26938界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1活體采卵ovumpickup運(yùn)用超聲波輔助采卵法收集牛卵母細(xì)胞的過(guò)程。3.2卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體cumulus-oocytecomplexes卵母細(xì)胞被卵丘細(xì)胞包裹形成的復(fù)合體。3.3體外成熟invitromaturation卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體在體外適宜條件下培養(yǎng)，使卵母細(xì)胞發(fā)育成熟，排出第一極體并具有受精能力的過(guò)程。3.4體外受精invitrofertilization精子和成熟卵母細(xì)胞在體外環(huán)境下完成受精的過(guò)程。3.5受精卵zygote精子進(jìn)入成熟卵母細(xì)胞后，激活卵母細(xì)胞排出第二極體形成的合子。3.6體外培養(yǎng)invitroculture2受精卵在體外適宜環(huán)境下培養(yǎng)的過(guò)程。3.7玻璃化冷凍vitrification利用高濃度的冷凍保護(hù)劑和提高冷凍速率阻止冰晶形成的一種胚胎冷凍方法。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。COCs：卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulusoocytecomplex)DPBS：磷酸緩沖鹽溶液（dulbecco'sphosphatepuffered）IVC：體外胚胎培養(yǎng)(invitrocultore)IVF：體外受精（invitrofertilization）IVM：體外成熟(invitromaturation)OCM：卵子培養(yǎng)基(ovumculturemedia）OPU：活體采卵（ovumpickup）5基本要求5.1操作間環(huán)境應(yīng)保持干凈衛(wèi)生，宜配備潔凈室。采卵室和撿卵室應(yīng)用紫外燈照射消毒1h～2h，操作臺(tái)應(yīng)用75%酒精擦拭消毒。5.2所用儀器設(shè)備、試劑和培養(yǎng)微滴的準(zhǔn)備應(yīng)符合附錄A的相關(guān)規(guī)定。6技術(shù)流程和?；铙w采卵/體外受精胚胎生產(chǎn)技術(shù)包括供體的選擇與飼養(yǎng)管理、活體采卵、體外成熟、體外受精、體外培養(yǎng)及胚胎質(zhì)量鑒定、胚胎玻璃化冷凍與解凍。和?；铙w采卵/體外受精胚胎生產(chǎn)技術(shù)流程見圖1。和?；铙w采卵/體外受精胚胎生產(chǎn)技術(shù)操作流程應(yīng)保留各環(huán)節(jié)的記錄表、照片和影像等。3圖1和?；铙w采卵/體外受精胚胎生產(chǎn)技術(shù)流程圖7供體的選擇和飼養(yǎng)管理7.1供體的選擇供體應(yīng)滿足以下條件：a)符合和牛品種標(biāo)準(zhǔn)，和牛種牛評(píng)分應(yīng)達(dá)到80分以上，和牛種牛評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合附錄B的規(guī)b)6月齡～10歲。c)體質(zhì)健康，生殖器官和繁殖機(jī)能正常，無(wú)遺傳缺陷和傳染性疾病。d)宜進(jìn)行全基因組檢測(cè)，計(jì)算雪花大理石紋基因組育種值，胴體重基因組育種值，眼肌基因組育種值，12月齡體重基因組育種值，純繁育種指數(shù)>1.0。47.2供體的飼養(yǎng)管理按照GB/T26938的規(guī)定執(zhí)行。7.3供體的處理7.3.1非超數(shù)排卵直接采卵，2次采集間隔時(shí)間宜大于3d。7.3.2超數(shù)排卵按照GB/T26938的規(guī)定執(zhí)行。8活體采卵8.1采卵前準(zhǔn)備保定供體，用2%利多卡因在薦椎和第一尾椎結(jié)合處進(jìn)行尾椎硬膜外腔麻醉，劑量根據(jù)供體體重為每頭牛2mL～5mL。麻醉后固定牛尾，清除直腸內(nèi)宿便，清洗劑消毒陰部及外陰。8.2采卵過(guò)程a)操作人員一只手將活體采卵儀的超聲波探頭插入供體陰道至穹隆處，另一只手通過(guò)直腸把握將一側(cè)卵巢隔著陰道壁緊貼超聲波探頭。b)超聲波探頭確定卵巢上卵泡位置。調(diào)整超聲波探頭與卵巢的相對(duì)位置，使卵泡位于進(jìn)針線上，開啟真空泵并推進(jìn)穿刺針穿刺卵泡，采集卵泡液和COCs。c)采用同樣的方法對(duì)另一側(cè)卵巢進(jìn)行COCs采集。d)采集所有2mm～8mm卵泡后，沖洗穿刺針及采卵管，使COCs進(jìn)入離心管。e)采卵過(guò)程如有血液凝固阻塞采卵針或采卵管，應(yīng)將穿刺針撤出并提高負(fù)壓，抽OPU沖卵液以疏通采卵針和采卵管。f)將采集的卵泡液和COCs轉(zhuǎn)移到集卵杯過(guò)濾液體，在38.5℃恒溫臺(tái)上，體視顯微鏡下收集COCs，并轉(zhuǎn)移到預(yù)熱38.5℃的OPU沖卵液中。g)采集完后挑選可用COCs進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。h)應(yīng)填寫OPU記錄表，見附錄D中表D.1。8.3分級(jí)篩選使用DPBS稀釋采卵液，通過(guò)細(xì)胞篩過(guò)濾，沖洗到90皿中，將其放在在體視顯微鏡下，分區(qū)檢查，檢出采集的所有卵，進(jìn)行分級(jí)鑒定，選出符合培養(yǎng)條件的COCs，用提前預(yù)熱好的IVM液體洗3滴。COCs分級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合附錄E的規(guī)定。應(yīng)填寫OPU-IVM記錄表，見附錄D中表D.2。9體外成熟將洗凈的A級(jí)和B級(jí)COCs放入含有成熟培養(yǎng)液并覆蓋礦物油的四孔板中，每孔培養(yǎng)30枚～50枚，培養(yǎng)22h～24h。10體外受精510.1精液的要求10.1.1種公牛的選擇種公牛應(yīng)滿足以下條件：a)三代系譜完整，檢疫合格，遺傳性能穩(wěn)定，生產(chǎn)性能優(yōu)秀。b)宜進(jìn)行全基因組測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果和育種目標(biāo)，避免遺傳缺陷純和，近交系數(shù)宜>0.3；宜依據(jù)“高雪花+高雪花”強(qiáng)強(qiáng)結(jié)合原則或“高日增重+高雪花”互補(bǔ)原則進(jìn)行生產(chǎn)性能的選配。10.1.2質(zhì)量要求10.1.2.1常規(guī)冷凍精液質(zhì)量按照GB4143的規(guī)定執(zhí)行。10.1.2.2性控冷凍精液質(zhì)量按照GB/T31582的規(guī)定執(zhí)行。10.1.3貯存要求按照GB/T30396的規(guī)定執(zhí)行。10.2精液的準(zhǔn)備a)精液解凍：從液氮罐中取出一支精子在空中停留5s，立即放入37℃熱水解凍45s，用紗布擦去精子外壁上的水漬，并用酒精擦拭兩端。b)精子洗滌：將解凍的精子兩端剪開，緩慢倒進(jìn)3ml的洗精液中進(jìn)行離心（離心力300G，5min棄上清。再加3ml洗精液離心5min，用移液槍棄上清，留50μl～100μl液體，加等體積IVF10.3卵子的準(zhǔn)備將COCs在提前預(yù)熱的IVF液體中洗滌3次后移入50μl受精滴中，每滴放15枚COCs。10.4受精用精子密度儀測(cè)量精子密度，使用IVF液體調(diào)整精子濃度約為2×106個(gè)/ml，加入4μl～10μl精液到受精滴中，放回CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育16h～20h。應(yīng)填寫IVF記錄表，見附錄D中表D.3。11體外培養(yǎng)及胚胎質(zhì)量鑒定11.1體外培養(yǎng)a)將受精16h～20h后的受精卵從IVF液體中取出，置于含有OCM的1.5ml離心管內(nèi)，震蕩2min，直至卵丘細(xì)胞基本脫落，選取胞質(zhì)均勻，透明帶輪廓清楚的受精卵，在IVC1液中洗3滴，放入提前預(yù)熱的IVC1液滴中，放入三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。b)體外培養(yǎng)72h后，選出并丟棄未受精的卵和2細(xì)胞胚胎，換出1/3液滴的IVC液體，繼續(xù)培育4細(xì)胞以上的胚胎。c)應(yīng)填寫IVC記錄表，見附錄D中表D.4。11.2胚胎質(zhì)量鑒定按照GB/T25881的規(guī)定執(zhí)行。612胚胎玻璃化冷凍與解凍12.1玻璃化冷凍12.1.1胚胎的要求胚胎質(zhì)量應(yīng)為A級(jí)或B級(jí)。12.1.2冷凍程序應(yīng)在室溫（24℃~25℃)下，按以下操作程序冷凍胚胎：a)基礎(chǔ)液中平衡胚胎5min～10min。b)冷凍液1中平衡胚胎5min。c)冷凍液2中平衡胚胎5min。d)冷凍液3中平衡胚胎35s～45s。e)裝入冷凍細(xì)管，直接投入液氮。12.1.3冷凍胚胎的保存按照GB/T26938規(guī)定執(zhí)行。應(yīng)填寫胚胎冷凍記錄表，見附錄D中表D.5。12.2玻璃化解凍12.2.1解凍程序應(yīng)按以下操作程序解凍胚胎：a)解凍液1中平衡胚胎1min，38℃。b)解凍液2中平衡胚胎5min，室溫（24℃~25℃)。c)基礎(chǔ)液中平衡胚胎5min，室溫（24℃~25℃)。12.2.2記錄應(yīng)填寫胚胎解凍記錄表，見附錄D中表D.6。13證實(shí)方法13.1過(guò)程記錄查驗(yàn)環(huán)節(jié)的記錄表、照片、影像以及記錄等。包括：OPU記錄表；OPU-IVM記錄表；IVF記錄表；IVC記錄表；胚胎質(zhì)量鑒定與分級(jí)的記錄及照片；胚胎冷凍和解凍記錄表。13.2胚胎發(fā)育率包括卵裂率和囊胚率。a)卵裂率按式（1）計(jì)算。7式中：CLR——卵裂率，單位為百分率（%n1——受精時(shí)卵母細(xì)胞數(shù)，單位為個(gè)；n2——卵裂胚胎數(shù)，單位為個(gè)。b)囊胚率按式（2）計(jì)算。式中：BLR——囊胚率，單位為百分率（%n1——受精時(shí)卵母細(xì)胞數(shù)，單位為個(gè)；n3——囊胚數(shù)，單位為個(gè)。1主要儀器設(shè)備、試劑的準(zhǔn)備A.1儀器設(shè)備CO2培養(yǎng)箱、三氣培養(yǎng)箱、高溫滅菌鍋、純水機(jī)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、超凈臺(tái)、液氮管、低速離心機(jī)、體式顯微鏡、恒溫試管架、pH酸度計(jì)、旋渦混合儀、超凈工作臺(tái)、滲透壓儀、恒溫平板、超聲波B超儀器、OPU收集管、OPU管線、注射器、針頭、移液器。A.2試劑OPU沖卵液、IVM液體、洗精液、IVF液體、IVC液體、胚胎冷凍液、胚胎解凍液。A.3液體配方A.3.1IVM液體配方見表A.1。表A.1IVM液體配方A.3.2洗精液配方見表A.2。表A.2洗精液配方MgCl·6HOKHPONaHCO2表A.2洗精液配方（續(xù)）A.3.3IVF液體配方見表A.3。表A.3IVF液體配方MgCl·6HOKHPONaHCOA.3.4IVC液體配方見表A.4。表A.4IVC液體配方ONaHCOKHPO3A.3.5冷凍解凍基礎(chǔ)液方見表A.5。表A.5基礎(chǔ)液配方A.3.6胚胎冷凍液配方見表A.6。表A.6胚胎冷凍液配方—A.3.7胚胎解凍液配方見表A.7。表A.7胚胎解凍液配方2A.4培養(yǎng)微滴A.4.1體外成熟培養(yǎng)微滴的準(zhǔn)備在四孔板中制作500μL～1000μL的IVM微滴，用礦物油覆蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中，平衡4h以上待用。A.4.2體外受精微滴的準(zhǔn)備在四孔板中制作50μL～100μL的IVF微滴，用礦物油覆蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中，平衡4h以上待A.4.3體外培養(yǎng)培養(yǎng)微滴的準(zhǔn)備在四孔板中制作50μL～100μL的IVC微滴，用礦物油覆蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中，平衡4h以上待1和牛種牛評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)B.1和牛種牛評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表B.1。表B.1和牛種牛評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)--2和?；铙w采卵體外受精胚胎生產(chǎn)記錄表C.1OPU記錄表見表D.1。表C.1OPU記錄表C.2OPU-IVM記錄表見表D.2。表C.2OPU-IVM記錄表C.3IVF記錄表見表D.3。C.4IVC記錄表見表