飼料中赭曲霉毒素A的測定 編制說明

1《飼料中赭曲霉毒素A的測定》編制說明根據(jù)《國家標準化管理委員會關于下達下達202際癌癥研究機構（InternationalAg表1-真菌毒素健康指導值（HBGVs）2ARfD（DON，3-Ac--DON，15-Ac現(xiàn)有證據(jù)不能對人類致癌性進行分類；TDI，每日耐受攝入量；PMTDI，臨時每日最大耐受攝入量；AR20H18ClNO6溶液，微溶于水，其苯溶劑化物熔點94℃~96℃,二甲苯中結晶熔極性不同而有別，在乙醇溶液中最大吸收波長為213nm和332nm。有很高的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。赭曲霉毒素A是由多種生長在糧3衛(wèi)生標準》、中華人民共和國農業(yè)農村部公告第20圖1赭曲霉毒素A化學結構式2024年1月，廣州匯標檢測技術心接到國家標準制訂任務后，表2標準主要起草人員和任務分工42024年初，標準編制小組查閱了國內外有關標準文獻資料，制圖2標準修訂技術路線圖5法和儀器方法的研究，并確定了最終的液相色譜-串聯(lián)質譜法的前處2024年8月，標準編制工作小組在方法實驗過程中認真學習了料中赭曲霉毒素A》標準文本及編制說明征求意見稿。在2024年76二、標準編制原則和主要技術內容確定的依據(jù)的結構和起草規(guī)則》、GB/T20001.4－2015《標準編制規(guī)則第4部標準制定結合國內外檢測技術發(fā)展趨勢和我國飼料行業(yè)發(fā)展現(xiàn)7表3標準主要技術內容修訂說明No.章條編號原標準修訂后修訂原因1前言“本標準.....”“本文件按照GB/T1.1-2020....——本次為第一次修訂。”按照GB/T1.1-2020要求重新整理。3OA)的薄層色譜測定方法和酶聯(lián)免疫吸附測定方法。本標準適用于配合飼料、飼用谷物原料中OA的測定。本文件描述了飼料中赭曲霉毒素A（OchratoxinA，以下簡稱OTA）的測定方法。本標文件適用于飼用谷物原料、配合飼料、濃縮飼料、精料補充料、寵物添加劑預混合飼料中OTA的測標準范圍增加了液相色譜-串聯(lián)質譜法，并重新進行描述。4薄層色譜測定方法的最低檢測量為2ng,酶聯(lián)免疫吸附測定方法的最低檢測量為0.05ng。。本文件第一法的定量限為4ug/kg，第二法的定量限為1ug/kg。52規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T6682-1992分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法GB/T14699.1飼料采樣方法下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T20195動物飼料試樣的制備按照GB/T1.1-2020和GB/T20001.4-2015規(guī)定要求。增加試樣制備的標準。63術語和定義無，原標準3為薄層色譜法刪除薄層色譜法，新增章節(jié)“本文件沒有需要界定的術語和定義?！卑凑誈B/T1.1-2020《標準準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定補充。8No.章條編號原標準修訂后修訂原因74.1方法的檢測依據(jù)是抗原-抗體反應。將OA抗體的羊抗體吸附在固相載體表面，加入OA抗體、酶標OA結合物、OA標準或試樣液，在OA抗體與固相載體表面羊抗體結合的同時，游離的OA、酶標OA結合物與結合在固體表面OA抗體競爭，未結合的酶標OA結合物洗滌除去。加入酶底物，在結合酶的催化作用下，無色底物降解產生有藍色物質。加入終止劑后顏色轉變?yōu)辄S色。通過酶標檢測儀，在450nm波長處測吸收值。吸光強度與試樣中OA的濃度成反比。試樣用甲醇-水提取，采用抗原-抗體免疫競爭性反應，OTA含量與試樣最終顏色深淺成反比，外標法定量。根據(jù)新方法重新進行了規(guī)范性描述。84.4樣品試樣制備按GB/T14699.1飼料采樣方法取得試樣，四分法濃縮減取約200g,經粉碎，混勻，裝入磨口瓶中備用。按照GB/T20195規(guī)定制備試樣，至少200g，粉碎使其全部過1mm試驗篩，混合均勻，裝入密閉容器中，備用。按照GB/T1.1-2020和GB/T20001.4-2015規(guī)定要求。9驟分析步驟4.5.1試樣溶液的制備、4.5.2測定進行編寫。4.6.2定量法百分吸收值：所得的標準或試樣的吸收值除以第一個標準(0標準)的吸收值再乘以100,作為百分吸收值A%,按式(3)計算。式中：A——標準品或試樣的吸收值；A?——空白的吸收值。試樣中赭曲霉毒素A的含量，以質量分數(shù)wi計，單位為微克每千克(μg/kg）按公式（1）計算：wi=m…………………（1）ρ1—從標準曲線查得的試樣溶液中OA質量濃度，單位為微克每升(μg/L）；進行編寫。9No.章條編號原標準修訂后修訂原因標準曲線的繪制：所計算的百分吸收值對應OA濃度(μg/L)的半對數(shù)坐標作標準曲線圖，曲線在1ng/kg～8ng/kg范圍內應當成線性。根據(jù)試樣的百分吸收值，通過標準曲線，查得相對應濃度。試樣中OA的含量(X)以微克每千克(μg/kg)表示，可按式(4)計算。式中：……………(4)c——從標準曲線上查得相對應試樣提取液(4.5.1)中OA濃度，單位為微克每升(μg/L);V——試樣提取液(4.5.1)體積，單位為毫升(mL);n——試樣稀釋倍數(shù)；m——試樣質量，單位為克(g)。計算結果表示到小數(shù)點后一位有效數(shù)字。V—提取液的總體積，單位為毫升（mLm—試樣質量，單位為克（g）；n—超出標準曲線范圍后的稀釋倍數(shù)。測定結果以平行測定的算術平均值表示，保留3位有效數(shù)字。4.7精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測試結果的相對差值不大在重復性條件下，兩次獨立測試結果與其算術平均值的絕對差值不大于該算術平均值的15%。進行編寫。聯(lián)質譜法無增加液相色譜-串聯(lián)質譜法內容根據(jù)新的方法按規(guī)范，進行描述。物酶標記放大結合信號。根據(jù)酶標抗體的不同可分為直接法和間接法。直接法即辣根過氧化物酶標記赭曲霉毒素A抗體，酶標抗體與作為抗原，赭曲霉毒素A抗體作為一抗，赭曲霉毒素A抗抗體作為通過對比國內外OTA試劑盒產品，可知根據(jù)表4酶聯(lián)免疫法試劑盒1523455675813395560%和70%甲醇作提取液，制成添加水平分別為4μg/kg、2μg/kg和圖3不同提取稀釋組合對回收率的影響表5不同品牌試劑盒說明書提出液濃度//圖4不同品牌試劑盒提取液比較取液為70%甲醇，與原標準一致。為增強方法的通用性，本標準使用磷酸鹽緩沖液（Phosphate料各5.0g，分別加入25mL濃度為70%甲醇作提取液，制成添加水圖5PBS稀釋液比較了標曲最低和最高點以契合實際生產檢測需求。OTA的標準系列溶適用于空白樣品為非零響應值的檢測方法的檢測限估算方法有應的濃度即為估算檢出限。二是根據(jù)GB/T334表6檢測限確認123456789空白標準溶液吸光度值2.1762.0442.0482.0242.0502.2182.3642.1022.041飼料衛(wèi)生規(guī)定》（第20號公告）中規(guī)定，在寵物配合飼料、寵物添加劑預混合飼料和其它寵物飼料中赭曲霉毒素A限量為10μg/kg；法+一步法，預包被二抗；結果見表7-表9，在不同添加水平下，回準偏差為0.52-15.23%；符合GB5009.295-2023《化學分析方法驗證表7品牌A試劑盒回收率測定結果樣品名稱添加水平(μg/kg）添加回收率%平均回收率%RSD%豆粕481.174.788.175.989.290.683.38.40867.472.362.975.661.862.767.18.554091.092.789.5豬配合料495.794.68.74883.378.388.789.777.64404.44蝦配合料487.897.279.378.598.585.287.79.79883.782.784.787.281.582.583.72.4240雞濃縮料483.981.886.182.679.685.883.32.98888.788.489.186.485.291.488.22.46402.09牛精料補充料496.583.186.0885.392.179.078.372.983.681.98.13403.40貓配合料476.467.586.585.262.883.076.9866.560.872.765.461.575.767.18.954076.081.371.072.183.476.276.66.40兔配合料465.660.374.675.160.579.069.2898.15.544092.173.286.074.390.387.0兔預混料40.52884.976.894.076.085.792.885.08.974098.994.397.492.994.496.94.13表8品牌B試劑盒回收率測定結果樣品名稱添加水平(μg/kg）添加回收率%平均回收率%RSD%豆粕494.176.380.690.592.5892.190.589.091.593.588.890.94081.069.287.886.568.079.378.6豬配合料484.785.290.899.2865.672.780.662.874.079.072.49.784066.374.984.565.571.782.074.2蝦配合料487.290.894.586.489.593.590.33.64888.280.974.387.382.014080.272.265.162.975.181.772.9雞濃縮料4889.588.04079.874.268.978.474.067.273.76.81牛精料補充料479.695.283.876.594.790.4889.364.767.275.676.270.273.94087.360.688.770.675.782.777.6貓配合料481.275.470.067.969.580.774.17.91867.262.392.970.580.682.576.04087.860.186.878.575.786.679.2兔配合料497.775.794.578.774.276.782.9860.361.162.062.163.761.661.84094.367.176.993.768.275.279.2兔預混料487.297.586.385.495.7899.384.185.280.986.592.04060.962.263.568.369.570.865.96.35表9品牌C試劑盒回收率測定結果樣品名稱添加水平(μg/kg）添加回收率%平均回收率%RSD%豆粕493.691.689.188.787.892.590.52.57870.772.068.262.568.567.568.24.814086.098.689.391.183.891.87.93豬配合料488.487.789.289.0882.168.378.780.777.694092.393.4蝦配合料469.675.664.868.571.972.770.55.31887.179.279.268.479.283.979.57.984087.087.097.5雞濃縮料470.371.172.969.270.667.770.32.50882.585.472.079.579.278.479.55.644095.568.888.489.989.180.085.3牛精料補充料459.961.962.858.557.360.960.23.47882.479.468.869.885.587.678.94089.99.60貓配合料483.489.779.669.571.576.578.49.65861.562.472.973.577.069.569.49.064065.569.568.171.373.266.669.04.17兔配合料466.364.561.663.862.563.863.72.54886.585.185.486.585.487.686.14082.179.286.589.184.83兔預混料472.073.578.976.969.271.573.74.94876.369.883.578.569.782.876.77.894088.882.568.777.481.782.480.28.38b)柱溫：30℃;表10液相色譜梯度洗脫條件時間（min）A冰乙酸-水(2+100)（%）B乙腈（%）0.0203.020307090902020.020圖7OTA溶劑標準溶液（50ug/L）譜圖圖8豆粕色譜圖），表11飼料基質樣品本底含量檢測濃度（ng/mL）1豆粕N.D.N.D.2N.D.N.D.3N.D.N.D.4PetssionRichinFreshChick5N.D.N.D.67N.D.N.D.8N.D.N.D.引起基線波動大，OTA的目標響應峰相對較小，造成積分計算存在表12豆粕基質加標回收結果加標水平樣品名樣品含量（ug/kg）加標回收率（%）平均回收率RSD檢出限水平（1ug/kg）1.0258102.58107.055.9中水平（10ug/kg）加標2-1加標2-28.474410.142684.74101.4393.08圖910ug/L濃度下溶劑標準溶液及基質加標樣品疊加色譜圖圖10豆粕基質加標（1ug/kg）色譜圖圖11豆粕基質加標（10ug/kg）色譜圖圖12魚苗膨化飼料基質空白（左）及50ug/L基質標（右）色譜圖圖13小雞料基質空白（左）及50ug/L基質標（右）色譜圖圖14貓糧基質空白（左）及50ug/L基質標（右）色譜圖圖15豬配合飼料基質空白（左）及50ug/L基質標（右）色譜圖圖16麩皮基質空白（左）及50ug/L基質標（右）色譜圖圖17玉米基質空白（左）及50ug/L基質標（右）色譜圖采用LC-MS/MS對赭曲霉毒素標準溶液進行母離子掃描，根據(jù)表13選擇離子參數(shù)設定表被測物名稱監(jiān)測離子對（m/z）錐孔電壓碰撞能量赭曲霉毒素A402.1>358.12020402.1>166.9a2035a為定量離子。質譜條件如下：402.1>166.9zhequmeidusu2.2423198.74547420zhequmeidusu2.2423198.7454742014132.64%min20240728_119Smooth(Mn,1x2)MRMof2channels,ES-STD-5402.1>358.17.609e+005zhequmeidusu7.609e+0052.2332939.5776049514279.76*%min1.251.501.752.002.252.502.753.003.253.503.754.00圖18OTA母離子掃描及MRM質譜圖OTA為弱酸性化合物，且本方法采用ESI-模式采集，乙腈可以圖19純水/甲醇體系洗脫梯度zhequmeidusu-05010-4675-chunshui10-May-202419:07:55 圖20純水/甲醇體系下豬配合飼料（10.0μg/kg）色譜圖圖21水（含有0.1%乙酸）/甲醇體系洗脫梯度zhequmeidusu-05010-467510-May-202419:18:4420240510021MRMof2ChannelsES-1003.193.35402.1>358.1(zhequmeidusu) 2.10e5 l3.48 0--———————----·、-2.502.753.003.253.503.754.004.2520240510021MRMof2ChannelsES-3.36100 402.1>166.9(zhequmeidusu)1.46e53.36100 0Time2.502.753.003.253.503.754.004.25圖22水（含有0.1%乙酸）/甲醇體系下豬配合飼料（10.0μg/kg）色譜圖圖23純水/甲醇體系洗脫梯度zichangfangfaXEVO-TQScronos#QGB028710-May-202419zichangfangfaXEVO-TQScronos#QGB0287zichangfangfaXEVO-TQScronos#QGB028710-May-202419:32:18202405100222.834100 MRMof2ChannelsES-02.1>358.1(zhequmeidusu)202405100222.834100 3.21 3.572.242.50 3.571.502.002.503.003.502024051002210020240510022100 3.03402.1>166.9(zhequmeidusu)1.88e5 Time1.502.002.503.003.50圖24純水/甲醇體系下豬配合飼料（10.0μg/kg）色譜圖圖25純水/乙腈體系洗脫梯度zichangfangfaXEVO-TQScronos#QGB028710-May-202419:43:52 zichangfangfaXEVO-TQScronos#QGB028710-May-202419:43:5220240510023220100.53 MRMof2Channels20240510023220100.53 l2.292.6610110101.502.002.503.003.504.002024051002320240510023MRMof2ChannelsES-402.1>166.9(zhequmeidusu)2.09e5 100 0Time2.190Time1.502.002.503.003.504.00圖26純水/乙腈體系下豬配合飼料（10.0μg/kg）色譜圖表14流動相梯度表0.075250.57525202.05.0953.55.0953.775256.57525柱均可，沒有明顯差異，本實驗采用ACQUITYUPLCBEHC18，50表15儲備液（100ug/mL）保存有效期實驗表16中間液（1.0μg/mL）保存有效期試驗圖27不同提取液甲醇濃度提取效率表17分次提取的回收率使用不同pH的提取液進行加標實驗，直接過柱后用不同酸比例的洗脫液進行洗脫。發(fā)現(xiàn)最佳凈化條件為pH≥8，洗脫液酸含量為表18pH對回收效率的影響提取液pH洗脫液酸比例平均回收率%圖28洗脫液酸含量對回收率的影響），實驗，分別取豆粕、貓糧、牛精補料飼料、豬配合飼料5g，分別用混合型陰離子交換固相萃取柱（MAX）、強陰離子交換固相萃取柱（SAX）、弱陰離子交換固相萃取柱（WAX）、混合型弱陰離子交換固相萃取柱（PWAX）富集凈化后，制成添加濃度10ng/別取豆粕、貓糧、牛精補料飼料、豬配合飼料5g，分別用上述三種表19不同陰離子固相萃取小柱回收率實驗圖29不同規(guī)格MAX柱回收率準工作液使用不同的溫度進行氮吹，用1mL復溶液進行復溶，上機測試。分別取豆粕、豬配合飼料5g，經MAX小柱富集凈化后，使用不同的溫度進行氮吹，用1mL復溶液進行復溶，制成添加濃度5ng/mL的樣液，上機測試。通過對不同氮吹溫度的考察，見表20，表明45℃氮吹回收率最好，因此本方法選用45℃作為氮吹溫度。表20不同氮吹溫度回收率影響實驗（%）氮吹溫度樣品名稱氮吹溫度樣品名稱或類型振蕩提取5min，8000r/min提取液5mL加入固相萃取柱，調節(jié)流速以1滴/s~2滴/s的速度通過干，用1mL復溶液（乙腈-2%乙酸水溶液：50+50）溶解，過0.22μm表21赭曲霉毒素A標準曲線的線性范圍與相關系數(shù)y=204.668*x+34.425r2=0.999573r2=0.998392r2=0.999966r2=0.999411r2=0.999907r2=0.998990r2=0.999947r2=0.999298圖30牛精料補充料標準曲線圖31雞濃縮料標準曲線圖32犬糧標準曲線Compoundname:zhequmeidusuCorrelationcoefficient:r=0.999953,r^2=0.999907Calibrationcurve:193.099*x+12.4753Responsetype:ExternalStd,AreaCurvetype:Linear,Origin:Exclude,Weighting:Null,AxisResponseResponse800600400200-0ng/mL-0.01.02.03.0圖34豆粕標準曲線圖35豬配合飼料標準曲線Compoundname:zhequmeidusuCorrelationcoefficient:r=0.999974,r^2=0.999947Calibrationcurve:200.225*x+1.72352Responsetype:ExternalStd,AreaCurvetype:Linear,Origin:Exclude,Weighting:Null,Axistrans:None2000200018001600140012001000800600400200ResponseResponse-0ng/mL-0.01.02.0圖36貓糧標準曲線圖37玉米標準曲線添加量為1～10倍定量限水平添加時，OTA的回收率為77.41%~27417-2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》要求，表明使用液相色譜-串聯(lián)質譜法適用于飼用谷物原料、配合飼料、濃縮飼料、精料補充料、寵物添加劑預混合飼料中赭曲霉毒素A的測定。表22方法加標回收率和精密度 料圖38牛精料補充料空白樣品色譜圖圖39牛精料補充料添加回收（10.0μg/kg）色譜圖l\l\圖40雞濃縮飼料空白樣品色譜圖20240718_016Smooth(Mn,1x2)MRMof2channels,ES-chicken-kb-STD-5zhequmeidusu94945952.1330-6-6min20240718_016Smooth(Mn,1x2)MRMof2channels,ES-chicken-kb-STD-5402.1>358.1zhequmeidusuzhequmeidusu94947966.67204.50-6min1.201.401.601.802.002.202.402.602.803.003.203.403.603.80圖41雞濃縮飼料添加回收（10.0μg/kg）色譜圖圖42犬糧空白樣品色譜圖圖43犬糧添加回收（10.0μg/kg）色譜圖圖44兔預混料空白樣品色譜圖圖45兔預混料添加回收（10.0μg/kg）色譜圖圖46豆粕空白樣品色譜圖圖47豆粕添加回收（10.0μg/kg）色譜圖圖48豬配合飼料空白樣品色譜圖圖49豬配合飼料添加回收（10.0μg/kg）色譜圖圖50貓糧空白樣品色譜圖圖51貓糧添加回收（10.0μg/kg）色譜圖20240803_238Smooth(Mn,1x2)MRMof2channels,ES-KOHYUMI-kb402.1>166.94.064e4.064e+0021.601.601.661.742.472.61 2.082.082.16%2.9632.963.193.263.363.453.664.034.184.264.38-1min-120240803_238Smooth(Mn,1x2)2384.47MRMof2channels,ES-28666