高三生物二輪復習專項練習課件PCR中引物專題

PCR技術中“引物”分析1.引物存在的必要性2.引物的設計原則3.PCR循環(huán)時與引物相關的計算4.引物的選擇和互補鏈的判斷5.引物與PCR反應時復性溫度和時間的關系6.引物設計與定點突變

突破一、引物存在的必要性1.DNA復制為什么需要引物？課前反饋：（1）PCR反應體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達式________（能、不能）正確反映DNA聚合酶的功能，這是因為_______。（2）若用PCR技術擴增HMA3基因，需要在PCR擴增儀中加入_________種引物，其作用是_______________________。利用PCR技術擴增基因HMA3時，設計引物序列的主要依據(jù)是___________。（1）不能DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸結合到已有的引物鏈（核酸單鏈）上

（2）2使耐高溫的DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸

HMA3基因兩端的部分核苷酸序列。優(yōu)化P1421.(2023·浙江卷)某研究小組利用轉基因技術,將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只,交配以期獲得Gata3-GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型,設計了引物1和引物2用于PCR擴增,PCR產(chǎn)物電泳結果如圖乙所示。圖甲圖乙下列敘述正確的是(

)A.Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因的表達B.翻譯時先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白C.2號條帶的小鼠是野生型,4號條帶的小鼠是Gata3-GFP基因純合子D.若用引物1和引物3進行PCR,能更好地區(qū)分雜合子和純合子B例1、為研究水稻D基因的功能，研究者將T-DNA插入到D基因中，致使該基因失活，失活后的基因記為d。（1）運用農(nóng)桿菌轉化法時，為鑒定篩選出的(農(nóng)桿菌）菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設計引物進行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應位置，PCR鑒定時應選擇的一對引物是__________。某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴增出了400bp片段，原因是________________________。乙丙目的基因的反向連接突破一、引物存在的必要性圖2T-DNA目的基因乙小結：利用PCR鑒定目的基因是否插入到質(zhì)粒上時，一個引物與質(zhì)粒DNA互補結合，另一個引物與目的基因DNA互補結合，這樣只有以重組DNA為模板才能獲得擴增產(chǎn)物。實驗思路：隨機選取F2植株若干，提取各植株的總DNA。分別用引物“Ⅰ+Ⅲ”組合及

“Ⅱ+Ⅲ”組合進行PCR，檢測是否擴增。預期結果：若兩種引物組合均可完成擴增，則相應植株的基因型為Dd；

若只有“Ⅰ+Ⅲ”組引物可完成擴增，則相應植株的基因型為dd;

若只有“Ⅱ+Ⅲ”組引物可完成擴增，則相應植株的基因型為DD;（2）（改編題）現(xiàn)以野生植株和突變植株作為親本進行雜交實驗，為探究F2植株基因型。研究者根據(jù)D基因，T-DNA的序列，設計了3種引物，如圖所示。請利用PCR技術設計實驗，寫出實驗思路和預期試驗結果。（提示：完整的T-DNA過大，不能完成PCR）思維拓展1：1.若構建基因表達載體時，基因反接，可抑制相關基因的表達，簡述其原理。2.選擇下圖中的引物__________組合可擴增出兩側的未知序列。轉錄出的mRNA與原mRNA堿基互補配對，抑制基因的翻譯過程①④優(yōu)化P13010.設計引物是PCR技術關鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理(如圖),請分別說明理由。提示

引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效,引物Ⅰ'自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效突破二、引物的設計與應用引物設計一般要遵循以下原則：（1）典型的引物長度為18-30個堿基。短的引物（15個核苷酸以下）能非常高效地結合---但是它們的專一性

。非常長的引物能提高專一性，但是復性效率

，從而導致PCR產(chǎn)物量

。（2）引物設計應避免兩個引物互補結合。（3）引物本身不能折疊配對差低低突破二、引物的設計與應用優(yōu)化P144

(2022·山東卷)(1)為構建重組載體,需先設計引物,通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是______________________________________

。為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割,需在引物上添加相應的限制酶識別序列,該限制酶識別序列應添加在引物的

(填“3'端”或“5'端”)。

突破二、引物的設計與應用能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對、短單鏈核酸5'端原則（4）引物的延伸是從

端開始的，不能進行任何修飾。3′

若想在DNA兩側添加限制酶識別序列，可利用PCR技術對DNA進行擴增時，在

引物A、B的

端分別添加限制酶識別序列。5’引物A引物B3’5’3’5’引物A引物B5’5’第1次第2次第3次引物A引物B5’5’引物A引物B3’3’引物A引物B引物A引物B引物A引物A引物B引物B“最長原則”1．（2023·浙江·二模）下列有關生物技術與工程中所用技術操作與原理的敘述，錯誤的是（

）A．動物細胞培養(yǎng)——應用酶的專一性原理可對所需材料用胰蛋白酶進行處理B．制備單克隆抗體——應用細胞膜流動性原理對脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合C．PCR技術的退火（復性）——應用堿基互補配對原理使引物結合在DNA模板鏈的5'端D．細胞核移植——細胞質(zhì)可調(diào)控細胞核基因表達，選用卵細胞質(zhì)使重組細胞表現(xiàn)出全能性引物A引物Ba鏈b鏈C突破二、引物的設計與應用專題突破練P2184.(2)①為保證雙功能醇醛脫氫酶基因(Adh)能通過雙酶切以正確方向插入質(zhì)粒,需設計引物1和引物2,其中引物1的序列為5'-

-3'。

GGTACCGTACCTTTGT考前增分練P237

1.(1)研究者進行PCR擴增前根據(jù)epEGF基因設計了一對引物,據(jù)圖1分析,該對引物序列的設計要求是_________________________________________________________________________________________________________________和____________________________________________________________________。

突破二、引物的設計與應用引物之間以及引物自身不能發(fā)生堿基互補配對,為了防止出現(xiàn)非特異性擴增片段,其長度不能過短,通常為20~30個核苷酸序列在兩個引物的5'端分別添加上限制酶BamHⅠ和XhoⅠ的識別序列圖1圖2考前增分練P238

2.(2)培育“超級菌”。對菌株WZ改造后的CD3D基因進行研究,把CD3D基因和His標簽基因(His標簽由6個組氨酸組成)連接起來構建融合基因,并構建重組基因表達載體,下圖為載體、CD3D基因的結構、不同限制酶的識別序列及切割位點,欲將標簽基因連接在CD3D基因編碼區(qū)的末端,已知組氨酸的密碼子為CAU,終止密碼子為UAG。①寫出His的基因編碼鏈的堿基序列5‘-

-3'。②為構建融合基因并將其插入載體,科研人員設計了一對與CD3D基因編碼區(qū)兩端序列互補配對的引物,設計時需在引物

(填“A”或“B”)的5'端增加相應的限制酶識別序列和His基因的編碼序列,請寫出該引物開頭的12個堿基序列:5'-

-3'。CATCATCATCATCATCATTAGBCTCGAGCTAATG考前增分練P238

3.(1)為使甘藍具有抗除草劑能力,科研人員將除草劑草甘膦抗性基因轉入甘藍植株,獲得抗草甘膦轉基因甘藍。(1)草甘膦抗性基因一條鏈的兩端序列如下,采用PCR技術獲取和擴增草甘膦抗性基因,應選用的引物組合為(

)A.5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3'B.5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TAAGTTGTCT-3'C.5'-ATTCAACAGA-3'和5'-ATCATCCAAG-3'D.5'-ATTCAACAGA-3'和5'-GAACCTACTA-3'A突破三

引物的選擇和互補鏈的判斷優(yōu)化P142

3.(2023·福建廈門模擬)下圖表示PCR過程中某個階段反應體系的情況,①②③④表示相關物質(zhì),L、R表示方向。下列敘述正確的是()A.②鏈從L到R的方向為3'→5',①②鏈均可作為子鏈合成的模板B.PCR過程需要通過解旋酶斷開氫鍵,且為邊解旋邊復制C.以1個DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)需消耗8個引物③D.物質(zhì)③的5'端添加了某序列,至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得該序列的雙鏈產(chǎn)物D突破四PCR循環(huán)時與引物相關的計算引物A引物B目的基因引物A引物B目的基因引物A引物B目的基因（1）（2）（3）Q1：在DNA擴增過程中，由于半保留復制，至少經(jīng)過

次循環(huán)，才有可能獲取與目的基因等長的片段。引物A引物B目的基因（1）第1次引物A引物B第2次引物A引物B引物B引物A第3次引物B引物A引物A引物B若目的基因在DNA片段中間，則在DNA擴增過程中，由于半保留復制，至少經(jīng)過

次循環(huán)，才有可能獲取與目的基因等長的片段。3每次都選長度最短的DNA單鏈作為PCR模板“最短原則”引物A引物B目的基因（2）第1次引物A引物B目的基因第2次引物A引物B若目的基因在DNA片段一側，則在DNA擴增過程中，由于半保留復制，至少經(jīng)過

次循環(huán)，才有可能獲取與目的基因等長的片段。22．（2024·黑龍江牡丹江·一?！す?jié)選）“中天楊”是由我國科學家采用生物轉基因技術，歷經(jīng)8年時間培育成功的抗鹽堿、耐干旱的楊樹新品種。如圖為培育“中天楊”的操作流程，①～⑥表示操作過程，該過程中可能用到的限制酶如表所示?；卮鹣铝袉栴}。注：Ti質(zhì)粒中的Tetr為四環(huán)素抗性基因，Ampr為氨芐青霉素抗性基因限制酶BclIEcoRIXbaISau3AIBamHI切割位點T↓GATCAG↓AATTCT↓CTAGA↓GATCG↓GATCC(3)采用PCR技術擴增目的基因時，在PCR反應體系中需加入引物，引物的作用是

，至少經(jīng)過

次循環(huán)，可獲取與目的基因等長的DNA單鏈。PCR完成以后，常采用

法來鑒定PCR的產(chǎn)物。(4)培育轉基因楊樹的核心工作是

，在進行該工作時，應在mtl-D基因的兩側添加限制酶

的識別序列。使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸2瓊脂糖凝膠

電泳基因表達載體的構建XbaI、BclI突破五

PCR定點突變技術PCR定點突變技術是最常用的基因定點突變技術，通過設計含有非特異性配對堿基的引物，再通過PCR將突變位點引入產(chǎn)物中。PCR定點突變技術具有突變回收率高、可在任何位點引入突變、材料和試劑容易獲得、操作簡單等優(yōu)點，它又可以分為重疊延伸PCR、大引物PCR等。重疊延伸PCR大引物PCR金版

2．(2022·遼寧東北育才學校)重疊延伸PCR技術是一種通過寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，通過多次PCR擴增，從而獲得目的基因的方法。該技術在擴增較長片段的DNA、不同來源的DNA片段拼接、基因的定點誘變等方面具有廣泛的應用前景。下圖是利用重疊延伸PCR技術擴增某目的基因的過程。下列分析不正確的是(

)CA．第一階段過程中的產(chǎn)物是依賴引物1、引物2和引物3、引物4擴增的結果B．引物2和引物3上均含有與模板鏈不能互補的堿基C．PCR過程中需要先加熱至90℃以上后再冷卻至72℃左右D．第三階段需要利用引物1和引物4獲得目的基因否則引物2和引物3會發(fā)生互補，導致引物失效重疊延伸PCR重疊延伸PCR是發(fā)展最早的PCR定點突變技術。該技術要使用四條引物。其中引物2和3的×處代表與模板鏈不能互補的突變位點，而這兩條引物有部分堿基（包括突變位點）是可以互補的。因此，分別利用引物1和2，引物3和4進行PCR后，得到的DNA片段可以通過引物2和3互補的堿基雜交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成為一條完整的DNA片段。最后，用引物1和4進行擴增得到含有突變位點的DNA片段。通過測序可以檢驗定點突變是否成功。專題突破練P219

2.(1)在定點誘變獲取突變基因時,PCR1中使用的引物有

,PCR2中使用的引物有

。PCR1和PCR2不能在同一個反應體系中進行,原因是

。圖1引物A、引物C引物B、大引物b引物之間能結合,會干擾引物和模板鏈的結合,影響PCR過程大引物PCR大引物PCR需要用到三條引物進行兩輪PCR，這三條引物分別是突變上游引物、常規(guī)上游引物和常規(guī)下游引物。該技術的流程如圖所示。第一輪PCR利用突變上游引物和常規(guī)下游引物進行擴增，