低氧微環(huán)境促進(jìn)人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖

低氧微環(huán)境促進(jìn)人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及其機(jī)制的研究Thestudyofhypoxicmicroenvironmentpromotingolfactorymucosamesenchymalstemcells(OM-MSCs)toproliferateanditsmechanism背景—干細(xì)胞春天

干細(xì)胞移植治療神經(jīng)損傷及修復(fù)一直是神經(jīng)學(xué)科界研究的熱點(diǎn)。目前，有研究證實(shí)胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、多能干細(xì)胞等均對(duì)神經(jīng)修復(fù)治療有效，而這些細(xì)胞仍然存在著一些如：倫理、免疫排異及細(xì)胞來(lái)源不足等問(wèn)題。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）背景—間充質(zhì)干細(xì)胞

種子細(xì)胞Seedwhatisit?背景—OM-MSCs2008年研究者在人鼻嗅黏膜中發(fā)現(xiàn)嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞（olfactorymucosamesenchymalstemcells，OM-MSCs）[1]，也稱為外胚間充質(zhì)干細(xì)胞(OE-MSC)，同時(shí)又被稱為固有層間充質(zhì)干細(xì)胞(LP-MSC)。Lindsay,S.L.,Riddell,J.S.,andBarnett,S.C.(2010).Olfactorymucosafortransplant-mediatedrepair:acomplextissueforacomplexinjury.Glia58,125–134.Lindsay,S.L.,Johnstone,S.A.,Mountford,J.C.,Sheikh,S.,Allan,D.B.,Clark,L.,andBarnett,S.C.(2013).HumanmesenchymalstemcellsisolatedfromolfactorybiopsiesbutnotboneenhanceCNSmyelinationinvitro.Glia61,368–382.OM-MSCs可表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物，同時(shí)也具有自己的特點(diǎn)基因聚類(lèi)分析提示，OM-MSCs與BMSCs是密切相關(guān)，具有同源性的。Delorme,B.,Nivet,E.,Gaillard,J.,Haupl,T.,Ringe,J.,Deveze,A.,Magnan,J.,Sohier,J.,Khrestchatisky,M.,Roman,F.S.,etal.(2010).Thehumannoseharborsanicheofolfactoryectomesenchymalstemcellsdisplayingneurogenicandosteogenicproperties.StemCellsDev.19,853–866.Lindsay,S.L.,Johnstone,S.A.,Mountford,J.C.,Sheikh,S.,Allan,D.B.,Clark,L.,andBarnett,S.C.(2013).HumanmesenchymalstemcellsisolatedfromolfactorybiopsiesbutnotboneenhanceCNSmyelinationinvitro.Glia61,368–382.OM-MSC背景—OM-MSCs脂肪組織、骨組織誘導(dǎo)Lindsay,S.L.,Johnstone,S.A.,Mountford,J.C.,Sheikh,S.,Allan,D.B.,Clark,L.,andBarnett,S.C.(2013).HumanmesenchymalstemcellsisolatedfromolfactorybiopsiesbutnotboneenhanceCNSmyelinationinvitro.Glia61,368–382.Delorme,B.,Nivet,E.,Gaillard,J.,Haupl,T.,Ringe,J.,Deveze,A.,Magnan,J.,Sohier,J.,Khrestchatisky,M.,Roman,F.S.,etal.(2010).Thehumannoseharborsanicheofolfactoryectomesenchymalstemcellsdisplayingneurogenicandosteogenicproperties.StemCellsDev.19,853–866.相比BMSC，OM-MSCs展現(xiàn)出更強(qiáng)大的增殖效率和更短的倍增時(shí)間。背景—OM-MSCs增殖迅速背景—OM-MSCs分布廣泛OM-MSCs不受獲取部位的影響，廣泛獲取上鼻甲、中鼻甲、下鼻甲、鼻中隔，皆可培養(yǎng)出OM-MSCs，且培養(yǎng)出的細(xì)胞生物學(xué)特性沒(méi)有差異。aged10–19yearsaged20–39yearsaged40–59yearsaged60–75years10–19y

20–39y40–59y60–75y志愿者的年齡不會(huì)影響OM-MSCs的增殖活力和生物學(xué)特性Hwang,S.H.,Park,S.H.,Choi,J.,Lee,D.C.,Oh,J.H.,Yeo,U.C.,Kim,S.W.,andSun,D.I.(2013).Age-relatedcharacteristicsofmultipotenthumannasalinferiorturbinate-derivedmesenchymalstemcells.PLoSOne8,e74330.背景—OM-MSCs安全性Shafiee,A.,Kabiri,M.,Ahmadbeigi,N.,Yazdani,S.O.,Mojtahed,M.,Amanpour,S.,andSoleimani,M.(2011).Nasalseptum-derivedmultipotentprogenitors:apotentsourceforstemcell-basedregenerativemedicine.StemCellsDev.20,2077–2091.通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染后>98%細(xì)胞轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白。體內(nèi)和體外致瘤的實(shí)驗(yàn)，在體外的軟瓊脂。OM-MSCs不會(huì)在軟瓊脂增殖，而MKN45腫瘤細(xì)胞系會(huì)出現(xiàn)典型的細(xì)胞克隆球。在體外注射OM-MSCs和MKN45腫瘤細(xì)胞系到免疫缺陷的小鼠上，MKN45細(xì)胞可出現(xiàn)明顯的腫瘤發(fā)生，而OM-MSCs注射部位未見(jiàn)明顯腫瘤發(fā)生。OM-MSCs作為新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞，不僅具有間充質(zhì)干細(xì)胞的一般特性，相比BMSC還具有以下優(yōu)點(diǎn)[2]

:1)具有更高的增殖效率和更短的傳代時(shí)間2)來(lái)源于外胚層，相當(dāng)于BMSC、ADSC等細(xì)胞來(lái)源于中胚層，OM-MSCs來(lái)源于外胚層無(wú)需跨胚層分化為神經(jīng)元3)來(lái)源穩(wěn)定，嗅粘膜可終身更新，廣泛分布鼻腔內(nèi)，易于取材4)不受年齡限制，其生物學(xué)活性不隨年齡的增長(zhǎng)而改變5)安全性高，染色體核組分析和腫瘤基因分析顯示體外無(wú)限傳代后沒(méi)有基因變異背景—OM-MSCs

目前，我們于國(guó)內(nèi)首次成功培養(yǎng)出了OM-MSCs并做了相關(guān)鑒定及成功建立了OM-MSCs培養(yǎng)體系。已發(fā)表與OM-MSCs培養(yǎng)鑒定相關(guān)文章背景—OM-MSCs有研究已證實(shí)了低氧能顯著影響B(tài)M-MSCs與人胚胎干細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子的分泌功能常規(guī)細(xì)胞體外培養(yǎng)的氧氣濃度約為21%，C02濃度約為5%，而人體正常組織和組織間隙中的氧氣濃度為3%-9%對(duì)于細(xì)胞增殖、功能都有著極為重要的作用2RenH,CaoY,ZhaoQ,etal.Proliferationanddifferentiationofbonemarrowstromalcellsunderhypoxicconditions.BiochemBiophysResCommun.2006.347(1):12-21.ForristalCE,WrightKL,HanleyNA,OreffoRO,HoughtonFD.Hypoxiainduciblefactorsregulatepluripotencyandproliferationinhumanembryonicstemcellsculturedatreducedoxygentensions.Reproduction.2010.139(1):85-97.背景—低氧微環(huán)境

通常將小于10%的氧氣濃度稱為低氧，但此濃度仍比人體正常組織及組織間隙的氧氣濃度要高，人體正常組織及組織間隙中的氧氣濃度約為3%-9%，血液中氧濃度約為1%-13%，而骨髓腔內(nèi)氧氣濃度僅1%-7%，所以本實(shí)驗(yàn)我們選取3%O2的微環(huán)境來(lái)培養(yǎng)OM-MSCs，同時(shí)觀察研究低氧對(duì)其細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞活性的影響。

低氧裝置WangY,YangJ,LiH,etal.HypoxiapromotesdopaminergicdifferentiationofmesenchymalstemcellsandshowsbenefitsfortransplantationinaratmodelofParkinson'sdisease.PLoSOne.2013.8(1):e54296.背景—低氧微環(huán)境IsolationandCultureofhOM-MSCs.ExperimentalDesignRNAExtractionandRT-PCR.ELISA.OM-MSChypoxemiaHIF-1α技術(shù)路線圖結(jié)果Fig.1OM-MSCs的形態(tài)學(xué)特征.A:貼壁細(xì)胞從組織塊中爬出，并顯示出紡錘形外觀及放射狀的排列順序；.B-C:免疫熒光結(jié)果顯示：細(xì)胞表達(dá)MSC標(biāo)志物：Nestin、STRO。Scalebars:(a)50μm;(b)200μm;(c)200μm.CBFig.1OM-MSCs的形態(tài)學(xué)特征.D:流式細(xì)胞學(xué)術(shù)鑒定；細(xì)胞表達(dá)MSC標(biāo)記物：CD73,CD90,andCD105,不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物：CD34andCD45。結(jié)果結(jié)果

3％O2組3％O2組+YC-1組常氧組（21％O2）Fig.2：三組均在各自環(huán)境下培養(yǎng)光鏡圖。A-C：B圖的細(xì)胞數(shù)量顯著增多，A圖細(xì)胞數(shù)介于中間，C圖細(xì)胞數(shù)最少，說(shuō)明低氧環(huán)境下能促進(jìn)OM-MSCs的增殖。Fig.2：三組均在各自環(huán)境下培養(yǎng)后細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。D：細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖（**代表P<0.01，*代表P<0.05）。結(jié)果DFig.3：低氧微環(huán)境促進(jìn)OM-MSCs增殖的細(xì)胞周期流式檢測(cè)。A：為各組細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果；結(jié)果AFig.3：低氧微環(huán)境促進(jìn)OM-MSCs增殖的細(xì)胞周期流式檢測(cè)。B：百分比統(tǒng)計(jì)結(jié)果表格，其中PI（增殖系數(shù)）={(S+G2/M)÷(GO/1+S+G2/M)}×100％；結(jié)果顯示3％O2組的PI值大于21％O2組（**代表P<0.01，*代表P<0.05）n=3。C：統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖（*代表P<0.05）n=3。結(jié)果BCFig.4：三組均在各自環(huán)境下培養(yǎng)72h后對(duì)其細(xì)胞的增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）進(jìn)行Westernblot檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示:3％O2組中PCNA蛋白表達(dá)最高，3％O2+YC-1組的表達(dá)介于中間，而常氧組的表達(dá)最少，B圖為A圖的統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析圖。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了低氧具有促進(jìn)OM-MSCs增殖的作用（**代表P<0.01，*代表P<0.05）。結(jié)果A3％O221％O23％O2+YC-1PCNAActinBFig.5：用細(xì)胞流式檢測(cè)各組OM-MSCs的凋亡情況。A：為各組細(xì)胞流式凋亡結(jié)果圖，B：為統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析，結(jié)果顯示各組存活細(xì)胞及凋亡細(xì)胞比例無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（**代表P<0.01，*代表P<0.05）。A結(jié)果B結(jié)果ABFig.6：HIF-1α及下游靶基因TWIST的Q-PCR檢測(cè)A：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Q-PCR檢測(cè)各組HIF-1αmRNA表達(dá)情況顯示：低氧組中HIF-1α表達(dá)量最高，加了HIF-1α抑制劑的抑制劑組中HIF-1α表達(dá)僅為B組的一半，常氧組中HIF-1α表達(dá)則明顯最低。B：TWIST表達(dá)與HIF-1α一致。結(jié)果CDFig.6：HIF及下游靶基因TWIST的westernblot檢測(cè)C：低氧組中HIF-1α表達(dá)量最高，加了HIF-1α抑制劑的抑制劑組中HI