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ICS71.100.70CCSY42DB61Technicalspecificationforcomesticsanti-wrinklingeffic陜西省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB61/T1814—2024前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14基本要求 25測(cè)試準(zhǔn)備 36測(cè)試 47數(shù)據(jù)處理 58測(cè)試報(bào)告 59質(zhì)量保證 5DB61/T1814—2024本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由陜西省藥品監(jiān)督管理局提出并歸口。本文件起草單位:陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院、陜西博溪通用檢測(cè)科技有限公司、陜西省藥品和疫苗檢查中心、陜西省藥品技術(shù)審評(píng)中心、咸陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心。本文件主要起草人:馮潤(rùn)東、曹涵博、蔡虎、劉海靜、盧永波、楊文娟、李瀟、吳小勇、王莉芳、黨琳琳、羅阿利、張若冰、李曉春、孫若曦。本文件首次發(fā)布。本文件由陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院負(fù)責(zé)解釋。聯(lián)系信息如下:?jiǎn)挝唬宏兾魇∈称匪幤窓z驗(yàn)研究院電話址:陜西省西安市高新區(qū)科技五路21號(hào)郵編:7100651DB61/T1814—2024化妝品抗皺功效測(cè)試技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了化妝品抗皺功效測(cè)試的基本要求、測(cè)試準(zhǔn)備、測(cè)試、數(shù)據(jù)處理、測(cè)試報(bào)告和質(zhì)量保證的要求。本文件適用于化妝品體外成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白含量的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T622化學(xué)試劑鹽酸GB/T646化學(xué)試劑氯化鉀GB/T678化學(xué)試劑乙醇(無(wú)水乙醇)GB/T1263化學(xué)試劑十二水合磷酸氫二鈉(磷酸氫二鈉)GB/T1266化學(xué)試劑氯化鈉GB/T1274化學(xué)試劑磷酸二氫鉀GB/T3102.6光及有關(guān)電磁輻射的量和單位GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T21395二甲基亞砜SN/T3899化妝品體外替代試驗(yàn)良好細(xì)胞培養(yǎng)和樣品制備規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義SN/T3899界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用本文件。3.1抗皺anti-wrinkle有助于減緩皮膚皺紋產(chǎn)生或使皺紋變得不明顯。3.2紫外光輻照強(qiáng)度ultravioletlightirradiance入射到某一表面的紫外光(如UVA)的強(qiáng)度,單位為瓦每平方米(W/m2)或毫瓦每平方厘米(mW/cm2)。2DB61/T1814—20243.3紫外光輻照劑量ultravioletlightirradiationdose入射到某一表面的紫外光(如UVA)的量(強(qiáng)度×?xí)r間),單位為焦耳每平方米(J/m2)或焦耳每平方厘米(J/cm2)。3.4酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA將抗原或抗體結(jié)合在固相載體表面,利用抗原抗體的特異性結(jié)合以及抗體或者抗原上標(biāo)記的酶催化特定底物發(fā)生顯色反應(yīng),實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物檢測(cè)的免疫分析方法。4基本要求4.1環(huán)境要求4.1.1與細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行,潔凈度應(yīng)達(dá)到100級(jí)要求,環(huán)境溫度應(yīng)控制在20℃~24℃,環(huán)境濕度應(yīng)控制在50%~70%,防震動(dòng),防電磁干擾。4.1.2其他試驗(yàn)操作應(yīng)在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行,生物安全等級(jí)達(dá)到一級(jí)要求。4.2耗材和試劑4.2.1一般要求所用試劑應(yīng)為分析純,試驗(yàn)用水應(yīng)按GB/T6682的要求進(jìn)行制備。與細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑、耗材應(yīng)作無(wú)菌處理。4.2.2耗材耗材應(yīng)滿足下列要求:a)細(xì)胞培養(yǎng)瓶為25cm2、75cm2培養(yǎng)瓶;b)細(xì)胞培養(yǎng)板為6孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板;c)無(wú)菌離心管規(guī)格為1.5mL、15mL、50mL;d)移液器槍頭規(guī)格為10μL、200μL、1000μL;e)過(guò)濾器孔徑為0.22μm。4.2.3試劑試劑應(yīng)滿足下列要求:a)低糖Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium培養(yǎng)基(DMEM);b)新生牛血清應(yīng)符合SN/T3899的要求;c)磷酸二氫鉀(KH2PO4)應(yīng)符合GB/T1274的要求;d)十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)應(yīng)符合GB/T1263的要求;e)氯化鈉(NaCl)應(yīng)符合GB/T1266的要求;f)氯化鉀(KCl)應(yīng)符合GB/T646的要求;g)鹽酸(HCl)應(yīng)符合GB/T622的要求;h)無(wú)水乙醇應(yīng)符合GB/T678的要求;i)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)粉末純度≥95%;3DB61/T1814—2024j)二甲基亞砜應(yīng)符合GB/T21395的要求;k)酶聯(lián)免疫試劑盒:用于檢測(cè)人Ⅰ型膠原蛋白含量,靈敏度<0.188ng/mL,檢測(cè)范圍0.313ng/mL~20ng/mL。4.3試劑配制試劑配制應(yīng)滿足以下要求:a)細(xì)胞培養(yǎng)液:取90mLDMEM培養(yǎng)液,添加10mL新生牛血清,混合均勻,冷藏保存,有效b)磷酸鹽緩沖溶液(0.1M,pH7.4稱(chēng)定0.27g磷酸二氫鉀、2.87g十二水合磷酸氫二鈉、8.00g氯化鈉和0.20g氯化鉀加水800mL溶解,用鹽酸調(diào)pH至7.4,并加水定容至1000mL,過(guò)濾除菌,冷藏保存,有效期14d;c)TGF-β1溶液(100ng/mL):稱(chēng)定0.002mgTGF-β1,溶于1mL細(xì)胞培養(yǎng)液中,配置成0.002mg/mL的母液,使用0.22μm過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌,冷凍保存,有效期28d,使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成100ng/mL的TGF-β1溶液;d)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法相關(guān)試劑應(yīng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制所需溶液。4.4儀器設(shè)備儀器設(shè)備應(yīng)符合下列要求:a)細(xì)胞培養(yǎng)箱條件為37℃,5%CO2,95%相對(duì)濕度;b)超凈工作臺(tái)潔凈度達(dá)到100級(jí);c)分析天平精度為0.0001g;d)超低溫冰箱溫度為-40℃~-86℃;e)倒置顯微鏡放大倍數(shù)為100倍~400倍;f)酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為200nm~999nm;g)UVA輻照儀波長(zhǎng)范圍為315nm~400nm;h)紫外線照度計(jì)量?jī)x的光譜效應(yīng)范圍應(yīng)包含315nm~400nm;i)高速冷凍離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000r/min~14000r/min,可制冷至4℃;j)微孔板振蕩器速度為0r/min~1000r/min;k)移液器量程為2μL~20μL、20μL~200μL、100μL~1000μL;l)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)量范圍為5×104個(gè)細(xì)胞/mL~1×107個(gè)細(xì)胞/mL。5測(cè)試準(zhǔn)備5.1細(xì)胞準(zhǔn)備5.1.1應(yīng)采用人源皮膚的原代成纖維細(xì)胞,以含10%新生牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5.1.2測(cè)試前,宜取冷凍保存的成纖維細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng),傳代培養(yǎng)到P7代時(shí),以2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每個(gè)試驗(yàn)組準(zhǔn)備3個(gè)復(fù)孔。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h±2h后用于試驗(yàn)。5.2樣品制備5.2.1受試物的配制4DB61/T1814—2024應(yīng)根據(jù)受試物理化特性選擇合適的溶劑配置成受試物工作液,配制要求如下:a)水溶性物質(zhì):宜選細(xì)胞培養(yǎng)液作為溶劑,配置成高濃度母液(母液中受試物的濃度應(yīng)為試驗(yàn)濃度的10倍~1000倍),過(guò)濾除菌,然后使用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到試驗(yàn)濃度;b)非水溶性物質(zhì):宜選二甲基亞砜或無(wú)水乙醇作為溶劑,配置成高濃度母液(母液中受試物的濃度應(yīng)為試驗(yàn)濃度的100倍~11000倍),過(guò)濾除菌,其中二甲基亞砜或無(wú)水乙醇的體積在溶液中應(yīng)當(dāng)?shù)陀?%。5.2.2受試物濃度的選擇應(yīng)通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定受試物安全濃度范圍,以受試物處理細(xì)胞后細(xì)胞活力≥90%時(shí)的濃度為安全濃度的最高濃度,在安全濃度范圍內(nèi),選擇1個(gè)~3個(gè)濃度作為受試物試驗(yàn)濃度。5.3試驗(yàn)分組試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)按如下要求分組:a)空白對(duì)照組:使用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,不進(jìn)行UVA輻照;b)陰性對(duì)照組:使用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,進(jìn)行30J/cm2的UVA輻照劑量輻照;c)陽(yáng)性對(duì)照組:使用含有陽(yáng)性物的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,進(jìn)行30J/cm2的UVA輻照劑量輻照,陽(yáng)性物宜選擇具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白的活性物,如100ng/mLTGF-β1;d)受試物組:使用含有一定濃度的受試物的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,進(jìn)行30J/cm2的UVA輻照劑量輻照。5.4儀器準(zhǔn)備UVA輻照儀開(kāi)關(guān)打開(kāi)后應(yīng)穩(wěn)定15min±2min。使用紫外線照度計(jì)量?jī)x對(duì)UVA輻照儀的輻照強(qiáng)度進(jìn)行校準(zhǔn),確保UVA輻照儀輻照強(qiáng)度穩(wěn)定。6測(cè)試6.1受試物孵育應(yīng)棄掉培養(yǎng)孔中的細(xì)胞培養(yǎng)液,更換新的培養(yǎng)液,操作過(guò)程按照5.3要求進(jìn)行,各試驗(yàn)組細(xì)胞孵育時(shí)間宜為24h±2h。6.2UVA輻照6.3UVA輻照過(guò)程應(yīng)在無(wú)菌操作環(huán)境下進(jìn)行,清洗并更換細(xì)胞培養(yǎng)液為磷酸鹽緩沖溶液,每孔添加量為1mL。按照5.3試驗(yàn)分組進(jìn)行UVA輻照,輻照劑量宜為30J/cm2。照射時(shí)間計(jì)算見(jiàn)式(1t=H/E.....................................................................................(1)式中:t——照射時(shí)間,單位為秒(s);H——輻照劑量,單位為毫焦每平方厘米(mJ/cm2E——輻照強(qiáng)度,單位為毫瓦特每平方厘米(mW/cm2)。6.4換液UVA輻照結(jié)束后,應(yīng)將磷酸鹽緩沖液更換為新的培養(yǎng)液,各試驗(yàn)組細(xì)胞孵育時(shí)間宜為24h±2h。5DB61/T1814—20246.5細(xì)胞上清液收集及保存孵育培養(yǎng)結(jié)束后,每孔應(yīng)收集不少于1mL細(xì)胞培養(yǎng)液,用于檢測(cè);如需儲(chǔ)存應(yīng)儲(chǔ)存于超低溫冰箱,有效期90d。6.6檢測(cè)應(yīng)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液離心,離心轉(zhuǎn)速宜為12000r/min、時(shí)間不小于10min。離心后收集上清液,按照Ⅰ型膠原蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)所述方法進(jìn)行稀釋及測(cè)定。7數(shù)據(jù)處理7.1Ⅰ型膠原蛋白含量計(jì)算按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的計(jì)算方法計(jì)算,每組應(yīng)取3個(gè)復(fù)孔的平均值作為檢測(cè)結(jié)果,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)。7.2統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)應(yīng)使用t檢驗(yàn)分析顯著性差異,雙尾檢驗(yàn)。與陰性對(duì)照組相比,p<0.05則認(rèn)為其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。7.3精密度試驗(yàn)中每組3個(gè)復(fù)孔的檢測(cè)數(shù)據(jù)間的變異系數(shù)(CoefficientofVariation,C.V)應(yīng)≤20%。變異系數(shù)計(jì)算見(jiàn)式(2式中:C.V——變異系數(shù);SD

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