基因工程原理與技術(shù)培訓(xùn)課件

基因工程原理與技術(shù)二、用于構(gòu)建基因組文庫(kù)的載體

1、λ噬菌體載體

2基因工程原理與技術(shù)2、黏粒載體

3基因工程原理與技術(shù)3、酵母人工染色體載體

轉(zhuǎn)化酵母4基因工程原理與技術(shù)3、基因組DNA片段與載體的連接(重組DNA分子的構(gòu)建)連接效率主要受插入片段與載體的摩爾數(shù)比以及DNA片段總濃度的影響。因此，應(yīng)通過(guò)連接預(yù)試驗(yàn)確定連接反應(yīng)中載體臂和插入片段的用量。

1.0μgλ噬菌體載體臂需要插入片段的用量連接效率低的解決措施：①調(diào)整載體與插入片段的用量；

②使用新鮮購(gòu)置的連接酶；③重新純化基因組DNA片段；④重新提取和制備基因組DNA片段。

6基因工程原理與技術(shù)4、重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞對(duì)于λ噬菌體載體、黏粒載體，重組DNA分子在體外包裝成噬菌體顆粒，以噬菌體感染的方式將重組的DNA分子導(dǎo)入到大腸桿菌中。效率高，達(dá)1.8×108pfu/μgDNA。對(duì)于YAC載體，采用電激法導(dǎo)入重組DNA分子。5、轉(zhuǎn)化體的篩選培養(yǎng)及基因組文庫(kù)的獲得6、基因組文庫(kù)的擴(kuò)增、分裝及保存

基因組文庫(kù)擴(kuò)增的方法：液體培養(yǎng)增殖法、影印濾膜培養(yǎng)法。

基因組文庫(kù)擴(kuò)增的問(wèn)題：由于克隆的不均衡生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致相應(yīng)克隆的丟失，導(dǎo)致基因組文庫(kù)的代表性變差。小包裝保存，4℃保存半年、-80℃保存幾年而滴度保持穩(wěn)定。

7基因工程原理與技術(shù)第二節(jié)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建cDNA文庫(kù)是指某生物、組織或細(xì)胞所有cDNA的的克隆群體。包括組織特異性cDNA文庫(kù)、區(qū)域特異性cDNA文庫(kù)。一、用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)的載體及載體片段制備質(zhì)粒載體、λ噬菌體載體，能滿足0.5~10kbcDNA克隆。二、mRNA的提取及其完整性的確定1、mRNA的來(lái)源(取材)目標(biāo)mRNA為高豐度的材料2、mRNA的提取

olig(dT)n-纖維素柱層析法

olig(dT)n-磁珠分離法8基因工程原理與技術(shù)3、mRNA完整性的確定無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)檢測(cè)法(麥胚抽提物、免網(wǎng)狀細(xì)胞裂解物)蛙卵檢測(cè)法凝膠電泳檢測(cè)法(根據(jù)28srRNA與18srRNA的條帶亮度判定)4、mRNA的富集

特別是低豐度mRNA。瓊脂糖凝膠電泳法：回收率較低變性蔗糖密度梯度離心法：回收率高現(xiàn)在，一般是進(jìn)行cDNA富集。操作煩瑣、時(shí)間長(zhǎng)9基因工程原理與技術(shù)三、cDNA克隆片段的制備1、cDNA第一鏈的合成

AAAAAAAAAGppp引物(OligdT17)退火AAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTT逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTT鳥(niǎo)類骨髓細(xì)胞白血病病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶：RNaseH活性強(qiáng)莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶：RNaseH活性較弱，有利于全長(zhǎng)cDNA合成。Supscript逆轉(zhuǎn)錄酶：缺失RNaseH活性，反應(yīng)溫度較高(45℃)10基因工程原理與技術(shù)2、cDNA第二鏈的合成

①自身引導(dǎo)合成法

AAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTT煮沸NaOHTTTTTTTTTTTTTTTTTT形成發(fā)夾環(huán)DNA聚合酶TTTTTTTTTAAAAAAATTTTTTTTTAAAAAAAAS1核酸酶造成5’端缺失11基因工程原理與技術(shù)②置換合成法

AAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTRNaseHAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTPolIAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTDNA連接酶優(yōu)點(diǎn)：a、效率高；b、不需純化cDNA第一鏈；c、僅缺失5’端幾個(gè)核苷酸。12基因工程原理與技術(shù)③PCR合成法

優(yōu)點(diǎn)：a、靈敏度高，對(duì)起始材料少、低豐度mRNA特別具有優(yōu)勢(shì)；b、不需純化mRNA，避免了純化過(guò)程中信息的丟失；c、不會(huì)丟失5’端信息13基因工程原理與技術(shù)3、雙鏈cDNA的末端處理及甲基化修飾

①加同聚物尾

14基因工程原理與技術(shù)②接上人工接頭首先補(bǔ)平cDNA末端及甲基化修飾，然后再接上人工接頭。連接子(linker)15基因工程原理與技術(shù)銜接頭(adaptor)16基因工程原理與技術(shù)四、cDNA克隆片段與載體片段的連接及檢測(cè)1、平頭末端連接法，無(wú)法回收插入片段2、同聚物接尾法，接dA/dT，通過(guò)局部變性和S1處理來(lái)回收3、人工接頭法五、重組cDNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞如構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)，要有高質(zhì)量的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(109pfu/μgDNA)六、轉(zhuǎn)化體篩選培養(yǎng)及cDNA文庫(kù)生成七、cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增、分裝及保存值得注意的是：在構(gòu)建cDNA文庫(kù)時(shí)，如果用人工接頭法，在酶切之前要用甲基化酶保護(hù)cDNA中的相應(yīng)酶切位點(diǎn)。

一般情況下無(wú)需構(gòu)建原核細(xì)菌的cDNA文庫(kù)。

17基因工程原理與技術(shù)第三節(jié)目的基因的獲得

獲得目的基因的主要途徑：①篩選基因組文庫(kù)；②篩選cDNA文庫(kù)；③PCR擴(kuò)增目的基因；④人工合成法；⑤差異克隆法；⑥圖位克隆法；⑦轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法；⑧T-DNA標(biāo)簽法序列已知的基因未知序列的基因⑨基因組計(jì)劃18基因工程原理與技術(shù)一、從文庫(kù)中分離已知序列的基因1、核酸雜交法(菌落/噬菌斑原位雜交)

利用部分同源探針可以分離不同種屬的相同基因或同一基因家族的不同成員。

如果只知基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，可以設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并探針予以篩選。19基因工程原理與技術(shù)2、PCR篩選法

特點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便。

程序：文庫(kù)→多孔培養(yǎng)板

→一列或一行培養(yǎng)物于一PCR管中擴(kuò)增→凝膠電泳檢測(cè)

→陽(yáng)性列或行分裝培養(yǎng)

→第二輪PCR

→

→

→

→陽(yáng)性克隆3、免疫學(xué)篩選

特點(diǎn)：篩選表達(dá)文庫(kù)

程序：與核酸雜交篩選相似。見(jiàn)右圖

20基因工程原理與技術(shù)二、從文庫(kù)中分離未知序列的基因1、染色體步移法(圖位克隆法)markerTargetgeneChromosomeFirstcloneTargetclone2、減法雜交克隆法（扣除雜交文庫(kù)法）將一種組織的cDNA與生物素標(biāo)記的另一種組織的m