《第08講 基因工程的基本操作程序》預(yù)習(xí)講義

學(xué)而優(yōu)·教有方PAGEPAGE1第08講基因工程的基本操作程序【學(xué)習(xí)目標(biāo)】【基礎(chǔ)知識(shí)】一、目的基因的篩選和獲取1.篩選合適的目的基因：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一，如Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因。2.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（1）獲取目的基因的方法a.人工合成（基因堿基序列是已知的） b.PCR技術(shù)擴(kuò)增（已知基因兩側(cè)的堿基序列） c.從基因文庫中獲?。ㄔ松铮?）PCR技術(shù)PCR的含義：是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)?；緱l件場所：需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行，其中一般要添加Mg2+ 模板：已知兩側(cè)堿基序列的DNA母鏈 原料：4種脫氧核苷酸酶：耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）引物：是2種與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸反應(yīng)過程變性：加熱超過90℃，雙鏈DNA解旋為單鏈復(fù)性：溫度下降至50℃左右，兩種引物與互補(bǔ)單鏈DNA結(jié)合延伸：溫度上升到72℃左右，四種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶作用下合成子鏈DNA結(jié)果：兩引物間固定長度的DNA序列呈指數(shù)擴(kuò)增（即2n）鑒定PCR產(chǎn)物：用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定注：1.含脫氧核苷酸鏈等長的DNA分子數(shù)為2n-2n2.第三輪出現(xiàn)兩條鏈等長的DNA片段3.兩種引物之間需要滿足的是：不能堿基互補(bǔ)配對(duì)，是防止引物之間結(jié)合形成雙鏈，降低引物與DNA模板鏈結(jié)合的效率。歸納總結(jié)蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白）為什么對(duì)人畜無害的原因：Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體，不能穿透細(xì)胞膜殺死細(xì)胞?；蛭膸斓母拍睿簩⒑心撤N生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，成為基因文庫。cDNA概念：以mRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄形成的DNA6、cDNA文庫和基因組文庫的比較：文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動(dòng)子無有基因中內(nèi)含子無有基因多少某種基因的部分基因某種生物的全部基因7、獲取目的基因的三種方法：①人工合成獲?。虎趶幕蛭膸飓@?。虎弁ㄟ^PCR技術(shù)獲取8、PCR技術(shù)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分和反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。9、引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。①體內(nèi)復(fù)制的引物為RNA單鏈；②體外復(fù)制的引物一般為DNA單鏈10、PCR反應(yīng)的條件：需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行，需提供模板、引物、脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）；同時(shí)需要控制溫度11、運(yùn)用PCR技術(shù)時(shí)，緩沖液中需要加入一定的Mg2+，激活DNA聚合酶10、DNA體內(nèi)復(fù)制的條件：11、DNA體外復(fù)制（PCR）的條件PCR擴(kuò)增的過程：名稱具體內(nèi)容變性目的基因DNA受熱變性后形成單鏈復(fù)性（退火）引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合延伸以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶將溶液中四種脫氧核苷酸根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的子鏈PCR擴(kuò)增的結(jié)果：每次循環(huán)后目的基因的量增加一倍，計(jì)算公式：2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)擴(kuò)增循環(huán)n次所需要的引物：計(jì)算公式：2n+1-2，至少需要經(jīng)過3次擴(kuò)增以后才能得到目的基因，且擴(kuò)增第3次后能得到2個(gè)目的基因PCR產(chǎn)物鑒定方法：采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的a.讓目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代b.使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用2.基因表達(dá)載體的構(gòu)成：目的基因+標(biāo)記基因+啟動(dòng)子+終止子啟動(dòng)子：位于DNA上.在基因的上游，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，軀動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，有時(shí)為了滿足應(yīng)用需要，會(huì)在載體中人工構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。終止子：也位于DNA上在基因的下游，終止轉(zhuǎn)錄起始密碼子和終止密碼子：位于mRNA上，決定翻譯的開始和結(jié)束3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程（P80-圖3-6）（1）首先用一定的限制酶切割載體（2）然后用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA片段再利用DNA連接酶將含目的基因的DNA片段拼接到載體的切口處注意：選擇限制酶的三大原則一大要求（題干特定要求）不能破壞目的基因如圖甲，可選擇PstⅠ而不選擇SmaⅠ不能破壞質(zhì)粒中的重要元件（如復(fù)制原點(diǎn).啟動(dòng)子.終止子.標(biāo)記基因（至少保留一個(gè)））質(zhì)粒與目的基因形成相同的黏性末端（一般使用雙酶切，優(yōu)點(diǎn)是可以防止質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化以及目的基因與載體的反向連接）歸納總結(jié)1.基因表達(dá)載體的功能：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，使目的基因能夠復(fù)制和發(fā)揮作用2.表達(dá)載體的組成：①復(fù)制原點(diǎn)；②目的基因；③標(biāo)記基因；④啟動(dòng)子；終止子（諧音記憶：一元買兩雞子）3.啟動(dòng)子：位于基因的上游一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生所需的mRNA。4.終止子：位于基因的下游的一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，終止轉(zhuǎn)錄5.啟動(dòng)子與起始密碼子、終止子與終止密碼子的區(qū)分：項(xiàng)目啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子位置基因的上游基因的下游mRNA上mRNA上化學(xué)本質(zhì)DNA序列DNA序列RNA序列RNA序列作用RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄終止基因的轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)合成開始的信號(hào)(起點(diǎn))終止蛋白質(zhì)合成(終點(diǎn))6.構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)只能用同一種限制酶切割目的基因和載體嗎？不是，切割目的基因和載體并非只能用同一種限制酶，如果兩種不同的限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA連接酶的作用下目的基因和載體也可以連接起來。三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.轉(zhuǎn)化的概念（重點(diǎn)）：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。2.常用的轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用）受體是體細(xì)胞或受精卵花粉管通道法（我國獨(dú)創(chuàng)）如抗蟲棉導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞：最常用的方法是顯微注射技術(shù)受體細(xì)胞多是受精卵導(dǎo)入微生物細(xì)胞：常以大腸桿菌作為受體細(xì)胞一般先用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)（即感受態(tài)），然后再將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中。3.重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有基因表達(dá)載體受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá)農(nóng)桿菌的特點(diǎn)：農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。歸納總結(jié)1.轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。2.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法：生物類型方法受體細(xì)胞過程特點(diǎn)轉(zhuǎn)基因植物花粉管通道法受精卵植物受粉一段時(shí)間后剪去柱頭→滴加DNA溶液(含目的基因)→目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞(胚囊)→目的基因表達(dá)我國獨(dú)創(chuàng)的一種方法轉(zhuǎn)基因植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法體細(xì)胞或受精卵將目的基因插入到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T－DNA片段上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→用農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞→目的基因整合到植物細(xì)胞染色體DNA上→目的基因表達(dá)適用于雙子葉植物和裸子植物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物顯微注射法受精卵提純含目的基因的表達(dá)載體→取卵(受精卵)→顯微注射→胚胎早期發(fā)育，移植→獲得具有新性狀的動(dòng)物目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最有效的方法轉(zhuǎn)基因微生物Ca2＋處理法微生物細(xì)胞用Ca2＋處理微生物細(xì)胞→處于能吸收DNA分子的狀態(tài)(即感受態(tài)細(xì)胞)→基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→在一定溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子簡便、經(jīng)濟(jì)、有效四、目的基因的表達(dá)與檢測1.分子水平的檢測1）通過PCR等技術(shù)檢測受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因 2）利用PCR技術(shù)檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 3）用相應(yīng)抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)等2.個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定：抗蟲.抗病接種試驗(yàn)等總結(jié)-基因工程的基本操作流程（P82-圖3-7）歸納總結(jié)類型檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子水平的檢測目的基因是否插入受體細(xì)胞DNA上PCR技術(shù)是否擴(kuò)增出目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNAPCR技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原－抗體雜交(蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間)是否顯示出雜交帶個(gè)體生物學(xué)水平的檢測是否具有抗性及抗性程度對(duì)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行抗性接種實(shí)驗(yàn)是否賦予了預(yù)期抗性五、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)驗(yàn)原理：1.DNA片段的擴(kuò)增：PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解旋與結(jié)合。2.瓊脂糖凝膠電泳P54（1）帶電粒子：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基因可以帶上正電荷或負(fù)電荷。（2）電泳：在電場的作用下，帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳。（3）遷移速率：在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度.DNA分子的大小和構(gòu)象有關(guān)。（4）檢測：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來3.操作提示P85注意（1）為避免外源DNA等因素的污染，PCR試驗(yàn)中使用的微量離心管.槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。（2）緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前所需試劑從冰箱拿出放在冰塊上緩慢融化。（3）添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。（4）在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。4.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)（1）未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的原因a.TaqDNA聚合酶失活b.引物出現(xiàn)質(zhì)量問題c.Mg2+濃度過低d.變性時(shí)的溫度低，變性時(shí)間短（2）出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶的主要原因a.模板DNA出現(xiàn)污染b.引物特異性不強(qiáng)（過短）或形成引物二聚體c.Mg2+濃度過高d.復(fù)性時(shí)的溫度過高附圖：【考點(diǎn)剖析】考點(diǎn)一：目的基因的篩選與獲取例1．2020年3月16日，中國科學(xué)家陳薇院士團(tuán)隊(duì)研制的重組新冠疫苗通過臨床研究注冊(cè)審評(píng)，獲批進(jìn)入臨床試驗(yàn)。重組新冠疫苗的制備流程如圖。回答下列問題。(1)步驟②需要作為原料。步驟③需要的工具酶主要是。(2)被用作載體的Ad5應(yīng)具有的特點(diǎn)是(答出1點(diǎn)即可)。(3)步驟④是。(4)重組疫苗注入志愿者體內(nèi)后，S蛋白基因指導(dǎo)合成的S蛋白作為，刺激機(jī)體產(chǎn)生能與之相結(jié)合的抗體，抗體的分泌量可作為檢測疫苗對(duì)志愿者免疫效果的指標(biāo)。參加臨床試驗(yàn)的志愿者需要滿足的條件之一是(填“有”或“無”)SARS－CoV－2感染史，理由是。(5)為探究疫苗的注射劑量對(duì)志愿者產(chǎn)生的免疫效果，需進(jìn)一步試驗(yàn)，請(qǐng)寫出試驗(yàn)思路：?！敬鸢浮?1)脫氧核苷酸Taq酶(2)能自我復(fù)制(或有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、有標(biāo)記基因位點(diǎn)、對(duì)受體細(xì)胞無害)(3)基因表達(dá)載體的構(gòu)建(4)抗原無有SARS－CoV－2感染史的志愿者血清中存在一定量的相應(yīng)抗體，會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾(5)給不同組志愿者分別注射不同劑量的疫苗，一段時(shí)間后采集血樣并檢測相應(yīng)抗體的水平【解析】(1)步驟②為逆轉(zhuǎn)錄過程，合成的產(chǎn)物是cDNA，因此需要脫氧核苷酸作為原料。步驟③為利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得S蛋白基因的過程，該過程需要的酶是Taq酶(耐高溫的DNA聚合酶)。(2)Ad5作為載體應(yīng)具有的特點(diǎn)是能自我復(fù)制、有多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、有標(biāo)記基因、在宿主細(xì)胞中可以存活并表達(dá)、對(duì)宿主細(xì)胞無害等。(3)步驟④為構(gòu)建目的基因表達(dá)載體的過程，即重組新冠疫苗的過程。(4)重組疫苗注入志愿者體內(nèi)后，S蛋白基因指導(dǎo)合成的S蛋白可作為抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫過程，使機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生能與之相結(jié)合的抗體，抗體的分泌量可作為檢測疫苗對(duì)志愿者免疫效果的指標(biāo)。參加臨床試驗(yàn)的志愿者需要滿足無SARS－CoV－2感染史的條件，即未感染過新冠病毒的志愿者，因?yàn)楦腥具^新冠病毒的人體內(nèi)含有相應(yīng)的記憶細(xì)胞，若注射疫苗，則會(huì)出現(xiàn)二次免疫的特征，即體內(nèi)的記憶細(xì)胞會(huì)迅速增殖分化，產(chǎn)生大量的漿細(xì)胞，漿細(xì)胞合成并分泌大量的抗體，從而導(dǎo)致無法檢測出該疫苗的真正效果。(5)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑樘骄恳呙绲淖⑸鋭┝繉?duì)志愿者產(chǎn)生的免疫效果，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康目芍?，該?shí)驗(yàn)的自變量為疫苗的注射劑量，因變量為抗體產(chǎn)生量，因此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)如下：將同性別且年齡相當(dāng)?shù)闹驹刚唠S機(jī)分成若干組，然后給不同組別的志愿者注射不同劑量的疫苗，一段時(shí)間之后，檢測志愿者體內(nèi)的抗體產(chǎn)生量，作好記錄并進(jìn)行比較、分析，從而得出結(jié)論。考點(diǎn)二：表達(dá)載體的構(gòu)建例2．大腸桿菌β-半乳糖苷酶(Z酶)可催化底物(X-gal)水解產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。在pUC18質(zhì)粒中，lacZ′編碼Z酶氨基端的一個(gè)片段(稱為α-肽)，該質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及限制酶識(shí)別位點(diǎn)如圖甲所示。已知α-肽、缺失α-肽的Z酶片段單獨(dú)存在時(shí)均無Z酶活性，共同存在時(shí)就會(huì)表現(xiàn)出Z酶活性。利用圖乙中的DNA片段與pUC18質(zhì)粒進(jìn)行基因工程操作。(1)限制酶能催化雙鏈DNA分子中(填化學(xué)鍵名稱)的斷裂。本實(shí)驗(yàn)可使用限制酶處理pUC18質(zhì)粒和圖乙中的DNA片段，再通過DNA連接酶連接，獲得含目的基因的重組質(zhì)粒。(2)用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后將大腸桿菌接種到含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，由于未發(fā)生轉(zhuǎn)化的大腸桿菌沒有該質(zhì)粒，因而不具有，在該培養(yǎng)基上不能生長。從功能上劃分，該培養(yǎng)基屬于培養(yǎng)基。(3)當(dāng)上述培養(yǎng)基中含有X-gal時(shí)，生長出的菌落有藍(lán)色和白色兩種類型，其中含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌的菌落顏色為，這是因?yàn)開________________________________________________________________________________________________________。為保證能通過菌落顏色辨別出含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，本實(shí)驗(yàn)作為受體細(xì)胞的大腸桿菌中Z酶基因應(yīng)滿足的條件是______________________________________?！敬鸢浮?1)磷酸二酯鍵SalⅠ(2)氨芐青霉素抗性選擇(3)白色目的基因與質(zhì)粒連接后使lacZ′被破壞，不能合成α-肽編碼α-肽的DNA序列缺失，其他序列正常【解析】(1)限制酶能催化雙鏈DNA分子中特定部位磷酸二酯鍵的斷裂，將DNA斷開。從圖中可知，酶HindⅢ可破壞目的基因，而質(zhì)粒和目的基因兩側(cè)都有酶SalⅠ識(shí)別位點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)可使用限制酶SalⅠ處理pUC18質(zhì)粒和圖乙中的DNA片段。(2)重組質(zhì)粒上有氨芐青霉素抗性基因，由于未發(fā)生轉(zhuǎn)化的大腸桿菌沒有該質(zhì)粒，因而不具有氨芐青霉素抗性，在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上不能生長。從功能上劃分，該培養(yǎng)基屬于選擇培養(yǎng)基，選擇了含重組質(zhì)粒的大腸桿菌。(3)從圖中可知，重組質(zhì)粒是用酶SalⅠ分別處理過的質(zhì)粒和目的基因片段形成的，重組質(zhì)粒的lacZ′基因被破壞，不能合成β-半乳糖苷酶(Z酶)，不能催化底物(X-gal)水解產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，故呈菌落白色。已知α-肽、缺失α-肽的Z酶片段單獨(dú)存在時(shí)均無Z酶活性，共同存在時(shí)就會(huì)表現(xiàn)出Z酶活性，為保證能通過菌落顏色辨別出含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，本實(shí)驗(yàn)作為受體細(xì)胞的大腸桿菌中Z酶基因應(yīng)滿足的條件是編碼α-肽的DNA序列缺失，其他序列正常?？键c(diǎn)三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞例3．乙烯具有促進(jìn)果實(shí)成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄細(xì)胞內(nèi)合成乙烯的兩個(gè)關(guān)鍵酶。利用反義基因技術(shù)(原理如圖1)，可以抑制這兩個(gè)基因的表達(dá)，從而使番茄具有耐儲(chǔ)存、宜運(yùn)輸?shù)膬?yōu)點(diǎn)。圖2為融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反義基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖1反義基因技術(shù)圖2反義基因表達(dá)載體(1)圖2中的2A11為特異性啟動(dòng)子，則2A11應(yīng)在番茄的(填器官名稱)中表達(dá)。(2)從番茄成熟果實(shí)中提取作為模板，利用反轉(zhuǎn)錄法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，對(duì)它們進(jìn)行拼接構(gòu)成融合基因并擴(kuò)增。(3)合成出的ACC氧化酶基因兩端分別含限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)，ACC合成酶基因兩端含SacⅠ和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)，用限制酶對(duì)上述兩個(gè)基因進(jìn)行切割后，再將它們拼接成融合基因，相應(yīng)的Ti質(zhì)粒和融合基因均使用限制酶進(jìn)行切割，以確保融合基因能夠插入載體中。(4)為了實(shí)現(xiàn)圖1中反義基因的效果，應(yīng)將融合基因(填“正向”或“反向”)插入啟動(dòng)子2A11的下游即可構(gòu)成反義融合基因。(5)在檢測番茄細(xì)胞中是否存在反義融合基因時(shí)，(填“能”或“不能”)用放射性物質(zhì)標(biāo)記的ACC氧化(合成)酶基因片段作探針進(jìn)行檢測，理由是?！敬鸢浮?1)果實(shí)(2)RNA(3)XbaⅠBamHⅠ和SacⅠ(4)反向(5)不能番茄細(xì)胞內(nèi)本來就存在ACC氧化(合成)酶基因，能與ACC氧化(合成)酶基因探針發(fā)生分子雜交【解析】(1)番茄食用的是果實(shí)，因此，啟動(dòng)子2A11應(yīng)在番茄的果實(shí)中表達(dá)。(2)從番茄成熟果實(shí)中提取RNA作為模板，利用反轉(zhuǎn)錄法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因。(3)使用限制酶XbaⅠ對(duì)合成出的ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因進(jìn)行切割后，兩種基因有相同的黏性末端，可將二者拼接形成融合基因。相應(yīng)的Ti質(zhì)粒和融合基因均使用限制酶BamHⅠ和SacⅠ進(jìn)行切割，然后再連接，可以確保融合基因能夠插入載體中。(4)為了實(shí)現(xiàn)圖1中反義基因的效果，應(yīng)將融合基因反向插入啟動(dòng)子2A11的下游。(5)番茄細(xì)胞內(nèi)本來就存在ACC氧化(合成)酶基因，能與ACC氧化(合成)酶基因探針發(fā)生分子雜交，因此，不能用放射性物質(zhì)標(biāo)記的ACC氧化(合成)酶基因作為探針進(jìn)行檢測。四、目的基因的檢測與鑒定例4．通過把編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入酵母菌細(xì)胞中，使之充分表達(dá)，再經(jīng)純化可制得乙型肝炎疫苗?；卮鹣铝袉栴}：(1)人體接種乙型肝炎疫苗后，該疫苗可作為刺激機(jī)體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。乙型肝炎疫苗先后需要接種多次，其目的是。(2)如果已知乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列，則可以推測出相應(yīng)目的基因的核苷酸序列，但推測出的目的基因核苷酸序列并不是唯一的，其原因是。(3)將編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因?qū)虢湍妇?xì)胞之前需要構(gòu)建基因表達(dá)載體，這一過程中需要的工具酶主要有。構(gòu)建的基因表達(dá)載體中，編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因應(yīng)該位于之間。(4)將編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因?qū)虢湍妇?xì)胞時(shí)，使該基因在酵母菌細(xì)胞中得以穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是。【答案】(1)抗原使人體產(chǎn)生更多的抗體和記憶細(xì)胞(2)決定氨基酸的密碼子具有簡并性(或決定一種氨基酸的密碼子往往不是只有一種)(3)限制酶和DNA連接酶啟動(dòng)子和終止子(4)確保編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因插入到酵母菌細(xì)胞的染色體DNA上【解析】(1)乙型肝炎疫苗可作為抗原引起人體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。乙型肝炎疫苗需先后接種多次的目的是使人體產(chǎn)生更多的抗體和記憶細(xì)胞，以發(fā)揮最大的免疫效果。(2)由于mRNA上的密碼子具有簡并性，根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測出的mRNA的核苷酸序列不是唯一的，所以推測出的基因的核苷酸序列不是唯一的。(3)在構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中，需要用限制酶切割目的基因片段與載體，再用DNA連接酶把目的基因與載體連接起來。構(gòu)建的基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子和終止子分別是基因表達(dá)中轉(zhuǎn)錄起始和終止的調(diào)控序列，目的基因需要插在啟動(dòng)子和終止子之間。(4)真核細(xì)胞分裂時(shí)細(xì)胞質(zhì)DNA隨機(jī)分配，應(yīng)將目的基因插入到酵母菌細(xì)胞的染色體DNA上，以確保目的基因在酵母菌細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳。【真題演練】1.（2021湖北,16）某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對(duì)）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對(duì)）。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是（）A.增加模板DNA量 B.延長熱變性的時(shí)間C.延長延伸的時(shí)間 D.提高復(fù)性的溫度2.（2020北京生物高考題）12.為了對(duì)重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HMA3）基因與外源高效啟動(dòng)子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中（如圖）。為檢測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，同時(shí)避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)選擇的引物組合是（）A.①+③ B.①+② C.③+② D.③+④3.（2021湖北，16）某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對(duì)）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對(duì)）。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是（）A.增加模板DNA量 B.延長熱變性的時(shí)間C.延長延伸的時(shí)間 D.提高復(fù)性的溫度4.（2020?北京）為了對(duì)重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HMA3）基因與外源高效啟動(dòng)子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中（如圖）。（注：①、②、③、④表示引物）為檢測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，同時(shí)避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)選擇的引物組合是（）A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④5.（2019?北京）篩選淀粉分解菌需使用以淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基。接種培養(yǎng)后，若細(xì)菌能分解淀粉，培養(yǎng)平板經(jīng)稀碘液處理，會(huì)出現(xiàn)以菌落為中心的透明圈（如圖），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表。菌種菌落直徑：C（mm）透明圈直徑：H（mm）H/C細(xì)菌Ⅰ5.111.22.2細(xì)菌Ⅱ8.113.01.6有關(guān)本實(shí)驗(yàn)的敘述，錯(cuò)誤的是（）A．培養(yǎng)基除淀粉外還含有氮源等其他營養(yǎng)物質(zhì) B．篩選分解淀粉的細(xì)菌時(shí)，菌液應(yīng)稀釋后涂布 C．以上兩種細(xì)菌均不能將淀粉酶分泌至細(xì)胞外 D．H/C值反映了兩種細(xì)菌分解淀粉能力的差異6.（2017?北京）為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1），擬將其與質(zhì)粒（圖2）重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖牵ǎ〢．用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒 B．用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞 C．在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞 D．用分子雜交方法檢測C基因是否整合到菊花染色體上7.（2021?北京）新冠病毒（SARS﹣CoV﹣2）引起的疫情仍在一些國家和地區(qū)肆虐，接種疫苗是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多種，其中我國科學(xué)家已研發(fā)出的腺病毒載體重組新冠病毒疫苗（重組疫苗）是一種基因工程疫苗，其基本制備步驟是：將新冠病毒的S基因連接到位于載體上的腺病毒基因組DNA中，重組載體經(jīng)擴(kuò)增后轉(zhuǎn)入特定動(dòng)物細(xì)胞，進(jìn)而獲得重組腺病毒并制成疫苗。（1）新冠病毒是RNA病毒，一般先通過得到cDNA，經(jīng)獲取S基因，酶切后再連接到載體。（2）重組疫苗中的S基因應(yīng)編碼。A.病毒與細(xì)胞識(shí)別的蛋白B.與病毒核酸結(jié)合的蛋白C.催化病毒核酸復(fù)制的酶D.幫助病毒組裝的蛋白（3）為保證安全性，制備重組疫苗時(shí)刪除了腺病毒的某些基因，使其在人體中無法增殖，但重組疫苗仍然可以誘發(fā)人體產(chǎn)生針對(duì)新冠病毒的特異性免疫應(yīng)答。該疫苗發(fā)揮作用的過程是：接種疫苗→→→誘發(fā)特異性免疫反應(yīng)。（4）重組疫苗只需注射一針即可完成接種。數(shù)周后，接種者體內(nèi)仍然能檢測到重組腺病毒DNA，但其DNA不會(huì)整合到人的基因組中。請(qǐng)由此推測只需注射一針即可起到免疫保護(hù)作用的原因。8.（2019?北京）光合作用是地球上最重要的化學(xué)反應(yīng)，發(fā)生在高等植物、藻類和光合細(xì)菌中。（1）地球上生命活動(dòng)所需的能量主要來源于光反應(yīng)吸收的。在碳（暗）反應(yīng)中，RuBP羧化酶（R酶）催化CO2與RuBP（C5）結(jié)合，生成2分子C3．影響該反應(yīng)的外部因素，除光照條件外還包括（寫出兩個(gè)）；內(nèi)部因素包括（寫出兩個(gè)）。（2）R酶由8個(gè)大亞基蛋白（L）和8個(gè)小亞基蛋白（S）組成。高等植物細(xì)胞中L由葉綠體基因編碼并在葉綠體中合成，S由細(xì)胞核基因編碼并在中由核糖體合成后進(jìn)入葉綠體，在葉綠體的中與L組裝成有功能的酶。（3）研究發(fā)現(xiàn)，原核生物藍(lán)藻（藍(lán)細(xì)菌）R酶的活性高于高等植物。有人設(shè)想通過基因工程技術(shù)將藍(lán)藻R酶的S、L基因轉(zhuǎn)入高等植物，以提高后者的光合作用效率。研究人員將藍(lán)藻S、L基因轉(zhuǎn)入某高等植物（甲）的葉綠體DNA中，同時(shí)去除甲的L基因。轉(zhuǎn)基因植株能夠存活并生長。檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株中的R酶活性高于未轉(zhuǎn)基因的正常植株。①由上述實(shí)驗(yàn)?zāi)芊竦贸觥稗D(zhuǎn)基因植株中有活性的R酶是由藍(lán)藻的S、L組裝而成”的推測？請(qǐng)說明理由。。②基于上述實(shí)驗(yàn)，下列敘述中能夠體現(xiàn)生物統(tǒng)一性的選項(xiàng)包括。a．藍(lán)藻與甲都以DNA作為遺傳物質(zhì)b．藍(lán)藻與甲都以R酶催化CO2的固定c．藍(lán)藻R酶大亞基蛋白可在甲的葉綠體中合成d．在藍(lán)藻與甲的葉肉細(xì)胞中R酶組裝的位置不同9.（2021天津）16.乳酸菌是乳酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)菌，但耐酸能力較差，影響產(chǎn)量。釀酒酵母耐酸能力較強(qiáng)，但不產(chǎn)生乳酸。研究者將乳酸菌的乳酸脫氫酶基因（LDH）導(dǎo)入釀酒酵母，獲得能產(chǎn)生乳酸的工程菌株。下圖1為乳酸和乙醇發(fā)酵途徑示意圖，圖2為構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)所需的關(guān)鍵條件。

（1）乳酸脫氫酶在轉(zhuǎn)基因釀酒酵母中參與厭氧發(fā)酵的場所應(yīng)為___________。（2）獲得轉(zhuǎn)基因釀酒酵母菌株的過程如下：①設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增乳酸脫氫酶編碼序列。為使擴(kuò)增出的序列中編碼起始密碼子的序列由原核生物偏好的GTG轉(zhuǎn)變?yōu)檎婧松锲玫腁TG，且能通過雙酶切以正確方向插入質(zhì)粒，需設(shè)計(jì)引物1和2。其中引物1的5′端序列應(yīng)考慮___________和___________。②將上述PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒重組后，導(dǎo)入大腸桿菌，篩選、鑒定，擴(kuò)增重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒上有____________，所以能在大腸桿菌中擴(kuò)增。啟動(dòng)子存在物種特異性，易被本物種的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)識(shí)別并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，因此重組質(zhì)粒上的乳酸脫氫酶編碼序列___________（能/不能）在大腸桿菌中高效表達(dá)。③提取重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入不能合成尿嘧啶的釀酒酵母菌株，在___________的固體培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)基因釀酒酵母，并進(jìn)行鑒定。（3）以葡萄糖為碳源，利用該轉(zhuǎn)基因釀酒酵母進(jìn)行厭氧發(fā)酵，結(jié)果既產(chǎn)生乳酸，也產(chǎn)生乙醇。若想進(jìn)一步提高其乳酸產(chǎn)量，下列措施中不合理的是___________（單選）。A.進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件 B.使用乳酸菌LDH基因自身的啟動(dòng)子C.敲除釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶基因 D.對(duì)轉(zhuǎn)基因釀酒酵母進(jìn)行誘變育種10.（2021福建）21.微生物吸附是重金屬廢水的處理方法之一。金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在于動(dòng)植物中的金屬結(jié)合蛋白，具有吸附重金屬的作用。科研人員將棗樹的MT基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建工程菌?；卮鹣铝袉栴}：（1）根據(jù)棗樹的MTcDNA的核苷酸序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物（圖1甲），通過PCR擴(kuò)增MT基因。已知A位點(diǎn)和B位點(diǎn)分別是起始密碼子和終止密碼子對(duì)應(yīng)的基因位置。選用的引物組合應(yīng)為___________。（2）本實(shí)驗(yàn)中，PCR所用的DNA聚合酶擴(kuò)增出的MT基因的末端為平末端。由于載體E只有能產(chǎn)生黏性末端的酶切位點(diǎn)，需借助中間載體P將MT基因接入載體E。載體P和載體E的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的酶切序列如圖乙所示。①選用___________酶將載體P切開，再用___________（填“T4DNA或“E·coli81DNA”）連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。②載體P′不具有表達(dá)MT基因___________和___________。選用___________酶組合對(duì)載體P′和載體E進(jìn)行酶切，將切下的MT基因和載體E用DA連接酶進(jìn)行連接，將得到的混合物導(dǎo)入到用___________離子處理的大腸桿菌，篩出MT工程菌。（3）MT基因在工程菌的表達(dá)量如圖2所示。結(jié)果仍無法說明已經(jīng)成功構(gòu)建能較強(qiáng)吸附廢水中重金屬的MT工程菌，理由是___________。11.(2021山東高考25)人類γ基因啟動(dòng)子上游調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對(duì)γ基因表達(dá)的抑制，可對(duì)某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。（1）為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需在引物末端添加限制酶識(shí)別序列。據(jù)圖可知，在F1～F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是____，在R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是_____。本實(shí)驗(yàn)中，從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過程共需要____種酶。（2）將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光的原因是____。（3）向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，而含F(xiàn)5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對(duì)應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列，據(jù)此結(jié)果可推測，BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于_____，理由是___。12.（2021北京）16.新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的疫情仍在一些國家和地區(qū)肆虐，接種疫苗是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多種，其中我國科學(xué)家已研發(fā)出的腺病毒載體重組新冠病毒疫苗（重組疫苗）是一種基因工程疫苗，其基本制備步驟是：將新冠病毒的S基因連接到位于載體上的腺病毒基因組DNA中，重組載體經(jīng)擴(kuò)增后轉(zhuǎn)入特定動(dòng)物細(xì)胞，進(jìn)而獲得重組腺病毒并制成疫苗。（1）新冠病毒是RNA病毒，一般先通過_______得到cDNA，經(jīng)_______獲取S基因，酶切后再連接到載體。（2）重組疫苗中的S基因應(yīng)編碼________。A.病毒與細(xì)胞識(shí)別的蛋白 B.與病毒核酸結(jié)合的蛋白C.催化病毒核酸復(fù)制的酶 D.幫助病毒組裝的蛋白（3）為保證安全性，制備重組疫苗時(shí)刪除了腺病毒的某些基因，使其在人體中無法增殖，但重組疫苗仍然可以誘發(fā)人體產(chǎn)生針對(duì)新冠病毒的特異性免疫應(yīng)答。該疫苗發(fā)揮作用的過程是：接種疫苗→________→_________→誘發(fā)特異性免疫反應(yīng)。（4）重組疫苗只需注射一針即可完成接種。數(shù)周后，接種者體內(nèi)仍然能檢測到重組腺病毒DNA，但其DNA不會(huì)整合到人的基因組中。請(qǐng)由此推測只需注射一針即可起到免疫保護(hù)作用的原因________。13.（2021遼寧,24）PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動(dòng)物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡稱phb2基因），大小為0．9kb（1kb=1000堿基對(duì)），利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白?；卮鹣铝袉栴}：（1）為獲取phb2基因，提取該動(dòng)物肝臟組織的總RNA，再經(jīng)__________過程得到cDNA，將其作為PCR反應(yīng)的模板，并設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物來擴(kuò)增目的基因。（2）圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見下表。為使phb2基因（該基因序列不含圖1中限制酶的識(shí)別序列）與載體正確連接，在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入__________和__________兩種不同限制酶的識(shí)別序列。經(jīng)過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用__________（填“E．coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）。相關(guān)限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)HindⅢA↓AGCTTTTCGA↑AEcoRIG↓AATTCCTTAA↑GPvitⅡCAG↓CTGGTC↑GACPstICTGC↓AGGA↑CGTCKpnIG↓GTACCCCATG↑GBamHIG↓GATCCCCTAG↑G注：箭頭表示切割位點(diǎn)（3）轉(zhuǎn)化前需用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于__________的生理狀態(tài)，以提高轉(zhuǎn)化效率。（4）將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑取菌落（分別編號(hào)為1、2、3、4）培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用（2）中選用的兩種限制酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電分離，結(jié)果如圖2，________號(hào)菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。注：M為指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物；小于0．2kb的DNA分子條帶未出現(xiàn)在圖中（5）將純化得到的PHB2蛋白以一定濃度添加到人宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24小時(shí)后，檢測處于細(xì)胞周期（示意圖見圖3）不同時(shí)期的細(xì)胞數(shù)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4。分析該蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖可能的原因是將細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的__________（填“G1”或“S”或“G2/M”）期。14.（2021·全國甲卷高考真題）PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌，醫(yī)生進(jìn)行了相關(guān)操作：①分析PCR擴(kuò)增結(jié)果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴(kuò)增DNA片段；④采集病人組織樣本?；卮鹣铝袉栴}：（1）若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是_________（用數(shù)字序號(hào)表示）。（2）操作③中使用的酶是_________，PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、________三步，其中復(fù)性的結(jié)果是_______。（3）為了做出正確的診斷，PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與_______特異性結(jié)合。（4）PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是指_______。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面?！具^關(guān)檢測】1.基因工程操作中,需要篩選和獲取目的基因。下列關(guān)于目的基因的說法,錯(cuò)誤的是()A.目的基因是指用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因B.目的基因都有自我復(fù)制能力C.可以根據(jù)相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物,從序列數(shù)據(jù)庫中尋找目的基因D.目的基因可以人工合成,也可以利用PCR快速獲取或擴(kuò)增2.下列不屬于獲取目的基因的方法的是 ()A.從基因組文庫中獲取目的基因B.利用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增目的基因C.利用逆轉(zhuǎn)錄法獲取目的基因D.利用DNA連接酶復(fù)制目的基因3.擴(kuò)增特定DNA片段可利用PCR技術(shù),下列有關(guān)描述錯(cuò)誤的是 ()A.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)不需要解旋酶,但需要耐高溫的DNA聚合酶B.引物是子鏈合成和延伸的基礎(chǔ),子鏈沿著模板鏈的3'→5'方向延伸C.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí),需知道目的基因的全部核苷酸序列D.復(fù)性溫度過高,可能導(dǎo)致PCR得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物4.如圖為某質(zhì)粒限制酶酶切圖譜。某基因不含圖中限制酶識(shí)別序列。為使PCR擴(kuò)增的該基因重組進(jìn)該質(zhì)粒,則擴(kuò)增的該基因兩端需分別引入哪兩種限制酶的識(shí)別序列 ()A.NdeⅠ和BamHⅠ B.NdeⅠ和XbaⅠC.XbaⅠ和BamHⅠ D.EcoRⅠ和KpnⅠ5.基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心步驟,下列有關(guān)說法錯(cuò)誤的是()A.構(gòu)建基因表達(dá)載體需要用到限制酶和DNA連接酶B.用不同載體構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),載體的處理方法相同C.基因表達(dá)載體中啟動(dòng)子位于基因的上游,是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位D.抗生素抗性基因的作用是作為標(biāo)記基因,用于鑒別受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因6.下列將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法,不合理的是 ()A.利用顯微注射法將目的基因?qū)胧芫?培育了超級(jí)小鼠B.我國利用花粉管通道法培育了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉C.可利用含目的基因的噬菌體侵染玉米細(xì)胞來培育轉(zhuǎn)基因玉米D.用Ca2+處理大腸桿菌,有利于大腸桿菌細(xì)胞吸收環(huán)境中的DNA7.根癌農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí),其Ti質(zhì)粒上的T-DNA片段能轉(zhuǎn)入植物的基因組中,因此可利用農(nóng)桿菌以Ti質(zhì)粒作為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作。下列相關(guān)敘述正確的是 ()A.目的基因應(yīng)插入T-DNA片段外,以防止破壞T-DNAB.用Ca2+處理農(nóng)桿菌,以利于其感染植物細(xì)胞C.Ti質(zhì)粒是一種環(huán)狀DNA分子,屬于細(xì)菌的擬核DNAD.T-DNA片段有利于介導(dǎo)外源DNA整合到植物染色體DNA中8.下列哪一種方法不能用于檢測目的基因是否成功導(dǎo)入或表達(dá) ()A.在顯微鏡下直接觀察受體細(xì)胞中是否含有目的基因B.通過PCR等技術(shù)檢測受體細(xì)胞的DNA分子上是否含有目的基因C.提取受體細(xì)胞合成的相應(yīng)蛋白質(zhì),利用抗原—抗體雜交技術(shù)進(jìn)行檢測D.抗蟲基因?qū)胫参锛?xì)胞后,檢測植物是否具有抗蟲特性9.科學(xué)家將蘇云金桿菌中的Bt基因(抗蟲基因)導(dǎo)入棉花的愈傷組織細(xì)胞,并進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得棉花植株。經(jīng)棉鈴蟲飼喂實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)該棉花植株并無抗蟲性狀,科學(xué)家提取棉花葉片細(xì)胞中的有關(guān)成分進(jìn)行了如下操作,下列分析錯(cuò)誤的是 ()A.提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì),采用抗原—抗體雜交技術(shù)進(jìn)行檢測,若能檢測到Bt抗蟲蛋白,則可能是抗蟲基因表達(dá)效率低B.若經(jīng)A檢測確定細(xì)胞中無Bt抗蟲蛋白,可采用PCR等技術(shù)檢測細(xì)胞中的RNA,若檢測到Bt抗蟲蛋白的mRNA,則可能是抗蟲基因不能正常轉(zhuǎn)錄和翻譯C.若經(jīng)B檢測確定細(xì)胞中無Bt抗蟲蛋白的mRNA,可采用核酸分子雜交技術(shù)檢測細(xì)胞中的DNA,若能檢測到抗蟲基因,則可能是抗蟲基因反向插入載體DNA分子中D.若經(jīng)C檢測確定細(xì)胞中無抗蟲基因,則可能是將沒有目的基因的載體DNA分子導(dǎo)入了受體細(xì)胞10.下列關(guān)于PCR操作過程的敘述,錯(cuò)誤的是()A.PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行滅菌B.PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份,并在-20℃儲(chǔ)存C.將PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出,放在高溫環(huán)境中迅速融化D.在向微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí),每吸取一種試劑后,移液器上的槍頭都必須更換11.以下關(guān)于活動(dòng)“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”的敘述,錯(cuò)誤的是 ()A.4種脫氧核苷酸為PCR擴(kuò)增提供原料B.凝膠載樣緩沖液中的電泳指示劑可使核酸顯色C.帶有負(fù)電荷的核酸需要加在電泳槽的負(fù)極D.不同大小的核酸在相同電場力的作用下遷移速率不同,從而實(shí)現(xiàn)其分離12.用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時(shí),得到以下電泳圖譜。其中1號(hào)為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液(Marker),10號(hào)為蒸餾水。PCR時(shí)加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此作出的分析,不合理的是()A.PCR產(chǎn)物的分子大小在250~500bp之間B.3號(hào)樣品為不含目的基因的載體DNAC.9號(hào)樣品對(duì)應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株D.10號(hào)可確定反應(yīng)體系等對(duì)結(jié)果沒有干擾13.MAP30蛋白存在于苦瓜的果實(shí)和種子中。實(shí)驗(yàn)表明MAP30蛋白具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等功能,近年來引起了人們的廣泛關(guān)注。MAP30蛋白基因可作為基因工程中的目的基因,下列敘述錯(cuò)誤的是 ()A.可從苦瓜果實(shí)或種子中提取mRNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄法獲取目的基因B.對(duì)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物,一般需要通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定C.檢測MAP30蛋白基因是否成功表達(dá),可用抗原—抗體雜交技術(shù)D.直接將MAP30蛋白基因?qū)腭R鈴薯受體細(xì)胞,可獲得轉(zhuǎn)基因幼苗14.如圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細(xì)胞的流程。①~④表示相關(guān)的操作,EcoRⅠ、BamHⅠ為限制酶,它們的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)如表所示。下列說法正確的是 ()A.過程①依據(jù)的原理是DNA的半保留復(fù)制B.在過程③中T-DNA可整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上C.為方便后續(xù)的剪切和連接,可在兩種引物的一端分別加上GAATTC和GGATCC序列D.過程④中,科研人員最終未能檢測到干擾素基因,其原因可能是干擾素基因未能成功導(dǎo)入人參愈傷組織細(xì)胞中15.科學(xué)家將海魚的抗凍蛋白基因用PCR技術(shù)擴(kuò)增,如圖1是擴(kuò)增的目的基因的示意圖。為尋找合適的載體,科學(xué)家對(duì)某載體用EcoRⅠ和SmaⅠ兩種限制酶進(jìn)行酶切后,再利用瓊脂糖凝膠電泳得到圖2所示圖譜(其中1號(hào)泳道是標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品的電泳結(jié)果,2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)泳道分別是EcoRⅠ單獨(dú)處理、SmaⅠ單獨(dú)處理、兩種酶共同處理后的電泳結(jié)果)。下列說法錯(cuò)誤的是 ()A.應(yīng)選用引物2和引物3對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增B.擴(kuò)增5次后有16個(gè)等長的目的基因片段C.DNA分子經(jīng)過染色可在紫外燈下觀察得到圖2所示圖譜D.由圖2可知該載體DNA分子中兩種限制酶的酶切位點(diǎn)各有一個(gè)16.我國科學(xué)家利用鏈霉菌的靛藍(lán)合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)構(gòu)建基因表達(dá)載體(如圖),通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入白玫瑰細(xì)胞中,獲得藍(lán)玫瑰。下列敘述錯(cuò)誤的是()A.表達(dá)載體中sfp和idgS具有各自的啟動(dòng)子,表達(dá)相互獨(dú)立B.可利用DNA分子雜交技術(shù)從鏈霉菌的基因文庫中獲取sfp和idgSC.將sfp插入Ti質(zhì)粒時(shí)不能同時(shí)使用限制酶PmeⅠ和BamHⅠD.若受體白玫瑰不變藍(lán),則可說明sfp和idgS未成功導(dǎo)入17.通過咽拭子取樣進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測是目前臨床上診斷新冠病毒感染疑似患者的常用方法。如圖為實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)的原理(序號(hào)表示步驟):PCR過程中探針和引物一起與模板結(jié)合,探針兩側(cè)分別帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)(抑制熒光發(fā)出),當(dāng)酶催化子鏈延伸至探針處時(shí)會(huì)水解探針,導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而發(fā)出熒光?；卮鹣铝袉栴}:(1)步驟①以病毒的RNA為模板通過過程合成cDNA。

(2)引物A和引物B是根據(jù)序列合成的。步驟②中引物與病毒cDNA結(jié)合,在PCR循環(huán)中稱為復(fù)性,一般設(shè)定溫度為。

(3)步驟③為階段,在酶的作用下將核苷酸不斷連接到2個(gè)引物的端。

(4)若監(jiān)測系統(tǒng)檢測到熒光信號(hào),則可基本判斷該檢測樣本為陽性,其原因是。(5)2022年3月,我國推出新冠病毒抗原檢測試劑盒作為核酸檢測的補(bǔ)充措施,該試劑盒的檢測原理是。

18.凝乳酶是食品生產(chǎn)中常用的凝結(jié)劑,科研人員從動(dòng)物體內(nèi)獲得了凝乳酶mRNA,擬利用大腸桿菌通過基因工程生產(chǎn)凝乳酶。據(jù)圖回答下列問題:(1)利用凝乳酶mRNA,在酶的作用下,可以得到凝乳酶的cDNA,進(jìn)一步通過PCR擴(kuò)增時(shí)需要2種引物,引物的作用是。(2)圖1和圖2是選用的質(zhì)粒及幾種相關(guān)限制酶的識(shí)別位點(diǎn),在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),最好選用的限制酶是,這樣選擇的優(yōu)點(diǎn)是(答出兩點(diǎn))。為在凝乳酶基因兩側(cè)加上相應(yīng)的酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)引物時(shí)需在引物前添加相應(yīng)酶切位點(diǎn),PCR過程中至少復(fù)制次可以得到含所需酶切位點(diǎn)的凝乳酶基因。

(3)將構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌,需要用鈣離子處理,使大腸桿菌處于。

(4)將在添加了青霉素的培養(yǎng)基中得到的4個(gè)大腸桿菌菌落進(jìn)行進(jìn)一步檢測,檢測結(jié)果如圖3所示,1~4號(hào)菌落中需要舍棄的是1號(hào)和。其中舍棄1號(hào)菌落的理由是。

第08講基因工程的基本操作程序【考點(diǎn)剖析】考點(diǎn)一：目的基因的篩選與獲取例1．2020年3月16日，中國科學(xué)家陳薇院士團(tuán)隊(duì)研制的重組新冠疫苗通過臨床研究注冊(cè)審評(píng)，獲批進(jìn)入臨床試驗(yàn)。重組新冠疫苗的制備流程如圖?；卮鹣铝袉栴}。(1)步驟②需要作為原料。步驟③需要的工具酶主要是。(2)被用作載體的Ad5應(yīng)具有的特點(diǎn)是(答出1點(diǎn)即可)。(3)步驟④是。(4)重組疫苗注入志愿者體內(nèi)后，S蛋白基因指導(dǎo)合成的S蛋白作為，刺激機(jī)體產(chǎn)生能與之相結(jié)合的抗體，抗體的分泌量可作為檢測疫苗對(duì)志愿者免疫效果的指標(biāo)。參加臨床試驗(yàn)的志愿者需要滿足的條件之一是(填“有”或“無”)SARS－CoV－2感染史，理由是。(5)為探究疫苗的注射劑量對(duì)志愿者產(chǎn)生的免疫效果，需進(jìn)一步試驗(yàn)，請(qǐng)寫出試驗(yàn)思路：?！敬鸢浮?1)脫氧核苷酸Taq酶(2)能自我復(fù)制(或有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、有標(biāo)記基因位點(diǎn)、對(duì)受體細(xì)胞無害)(3)基因表達(dá)載體的構(gòu)建(4)抗原無有SARS－CoV－2感染史的志愿者血清中存在一定量的相應(yīng)抗體，會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾(5)給不同組志愿者分別注射不同劑量的疫苗，一段時(shí)間后采集血樣并檢測相應(yīng)抗體的水平【解析】(1)步驟②為逆轉(zhuǎn)錄過程，合成的產(chǎn)物是cDNA，因此需要脫氧核苷酸作為原料。步驟③為利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得S蛋白基因的過程，該過程需要的酶是Taq酶(耐高溫的DNA聚合酶)。(2)Ad5作為載體應(yīng)具有的特點(diǎn)是能自我復(fù)制、有多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、有標(biāo)記基因、在宿主細(xì)胞中可以存活并表達(dá)、對(duì)宿主細(xì)胞無害等。(3)步驟④為構(gòu)建目的基因表達(dá)載體的過程，即重組新冠疫苗的過程。(4)重組疫苗注入志愿者體內(nèi)后，S蛋白基因指導(dǎo)合成的S蛋白可作為抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫過程，使機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生能與之相結(jié)合的抗體，抗體的分泌量可作為檢測疫苗對(duì)志愿者免疫效果的指標(biāo)。參加臨床試驗(yàn)的志愿者需要滿足無SARS－CoV－2感染史的條件，即未感染過新冠病毒的志愿者，因?yàn)楦腥具^新冠病毒的人體內(nèi)含有相應(yīng)的記憶細(xì)胞，若注射疫苗，則會(huì)出現(xiàn)二次免疫的特征，即體內(nèi)的記憶細(xì)胞會(huì)迅速增殖分化，產(chǎn)生大量的漿細(xì)胞，漿細(xì)胞合成并分泌大量的抗體，從而導(dǎo)致無法檢測出該疫苗的真正效果。(5)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑樘骄恳呙绲淖⑸鋭┝繉?duì)志愿者產(chǎn)生的免疫效果，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康目芍搶?shí)驗(yàn)的自變量為疫苗的注射劑量，因變量為抗體產(chǎn)生量，因此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)如下：將同性別且年齡相當(dāng)?shù)闹驹刚唠S機(jī)分成若干組，然后給不同組別的志愿者注射不同劑量的疫苗，一段時(shí)間之后，檢測志愿者體內(nèi)的抗體產(chǎn)生量，作好記錄并進(jìn)行比較、分析，從而得出結(jié)論?？键c(diǎn)二：表達(dá)載體的構(gòu)建例2．大腸桿菌β-半乳糖苷酶(Z酶)可催化底物(X-gal)水解產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。在pUC18質(zhì)粒中，lacZ′編碼Z酶氨基端的一個(gè)片段(稱為α-肽)，該質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及限制酶識(shí)別位點(diǎn)如圖甲所示。已知α-肽、缺失α-肽的Z酶片段單獨(dú)存在時(shí)均無Z酶活性，共同存在時(shí)就會(huì)表現(xiàn)出Z酶活性。利用圖乙中的DNA片段與pUC18質(zhì)粒進(jìn)行基因工程操作。(1)限制酶能催化雙鏈DNA分子中(填化學(xué)鍵名稱)的斷裂。本實(shí)驗(yàn)可使用限制酶處理pUC18質(zhì)粒和圖乙中的DNA片段，再通過DNA連接酶連接，獲得含目的基因的重組質(zhì)粒。(2)用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后將大腸桿菌接種到含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，由于未發(fā)生轉(zhuǎn)化的大腸桿菌沒有該質(zhì)粒，因而不具有，在該培養(yǎng)基上不能生長。從功能上劃分，該培養(yǎng)基屬于培養(yǎng)基。(3)當(dāng)上述培養(yǎng)基中含有X-gal時(shí)，生長出的菌落有藍(lán)色和白色兩種類型，其中含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌的菌落顏色為，這是因?yàn)開________________________________________________________________________________________________________。為保證能通過菌落顏色辨別出含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，本實(shí)驗(yàn)作為受體細(xì)胞的大腸桿菌中Z酶基因應(yīng)滿足的條件是______________________________________?！敬鸢浮?1)磷酸二酯鍵SalⅠ(2)氨芐青霉素抗性選擇(3)白色目的基因與質(zhì)粒連接后使lacZ′被破壞，不能合成α-肽編碼α-肽的DNA序列缺失，其他序列正常【解析】(1)限制酶能催化雙鏈DNA分子中特定部位磷酸二酯鍵的斷裂，將DNA斷開。從圖中可知，酶HindⅢ可破壞目的基因，而質(zhì)粒和目的基因兩側(cè)都有酶SalⅠ識(shí)別位點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)可使用限制酶SalⅠ處理pUC18質(zhì)粒和圖乙中的DNA片段。(2)重組質(zhì)粒上有氨芐青霉素抗性基因，由于未發(fā)生轉(zhuǎn)化的大腸桿菌沒有該質(zhì)粒，因而不具有氨芐青霉素抗性，在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上不能生長。從功能上劃分，該培養(yǎng)基屬于選擇培養(yǎng)基，選擇了含重組質(zhì)粒的大腸桿菌。(3)從圖中可知，重組質(zhì)粒是用酶SalⅠ分別處理過的質(zhì)粒和目的基因片段形成的，重組質(zhì)粒的lacZ′基因被破壞，不能合成β-半乳糖苷酶(Z酶)，不能催化底物(X-gal)水解產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，故呈菌落白色。已知α-肽、缺失α-肽的Z酶片段單獨(dú)存在時(shí)均無Z酶活性，共同存在時(shí)就會(huì)表現(xiàn)出Z酶活性，為保證能通過菌落顏色辨別出含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，本實(shí)驗(yàn)作為受體細(xì)胞的大腸桿菌中Z酶基因應(yīng)滿足的條件是編碼α-肽的DNA序列缺失，其他序列正常?？键c(diǎn)三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞例3．乙烯具有促進(jìn)果實(shí)成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄細(xì)胞內(nèi)合成乙烯的兩個(gè)關(guān)鍵酶。利用反義基因技術(shù)(原理如圖1)，可以抑制這兩個(gè)基因的表達(dá)，從而使番茄具有耐儲(chǔ)存、宜運(yùn)輸?shù)膬?yōu)點(diǎn)。圖2為融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反義基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖1反義基因技術(shù)圖2反義基因表達(dá)載體(1)圖2中的2A11為特異性啟動(dòng)子，則2A11應(yīng)在番茄的(填器官名稱)中表達(dá)。(2)從番茄成熟果實(shí)中提取作為模板，利用反轉(zhuǎn)錄法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，對(duì)它們進(jìn)行拼接構(gòu)成融合基因并擴(kuò)增。(3)合成出的ACC氧化酶基因兩端分別含限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)，ACC合成酶基因兩端含SacⅠ和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)，用限制酶對(duì)上述兩個(gè)基因進(jìn)行切割后，再將它們拼接成融合基因，相應(yīng)的Ti質(zhì)粒和融合基因均使用限制酶進(jìn)行切割，以確保融合基因能夠插入載體中。(4)為了實(shí)現(xiàn)圖1中反義基因的效果，應(yīng)將融合基因(填“正向”或“反向”)插入啟動(dòng)子2A11的下游即可構(gòu)成反義融合基因。(5)在檢測番茄細(xì)胞中是否存在反義融合基因時(shí)，(填“能”或“不能”)用放射性物質(zhì)標(biāo)記的ACC氧化(合成)酶基因片段作探針進(jìn)行檢測，理由是?！敬鸢浮?1)果實(shí)(2)RNA(3)XbaⅠBamHⅠ和SacⅠ(4)反向(5)不能番茄細(xì)胞內(nèi)本來就存在ACC氧化(合成)酶基因，能與ACC氧化(合成)酶基因探針發(fā)生分子雜交【解析】(1)番茄食用的是果實(shí)，因此，啟動(dòng)子2A11應(yīng)在番茄的果實(shí)中表達(dá)。(2)從番茄成熟果實(shí)中提取RNA作為模板，利用反轉(zhuǎn)錄法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因。(3)使用限制酶XbaⅠ對(duì)合成出的ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因進(jìn)行切割后，兩種基因有相同的黏性末端，可將二者拼接形成融合基因。相應(yīng)的Ti質(zhì)粒和融合基因均使用限制酶BamHⅠ和SacⅠ進(jìn)行切割，然后再連接，可以確保融合基因能夠插入載體中。(4)為了實(shí)現(xiàn)圖1中反義基因的效果，應(yīng)將融合基因反向插入啟動(dòng)子2A11的下游。(5)番茄細(xì)胞內(nèi)本來就存在ACC氧化(合成)酶基因，能與ACC氧化(合成)酶基因探針發(fā)生分子雜交，因此，不能用放射性物質(zhì)標(biāo)記的ACC氧化(合成)酶基因作為探針進(jìn)行檢測。四、目的基因的檢測與鑒定例4．通過把編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入酵母菌細(xì)胞中，使之充分表達(dá)，再經(jīng)純化可制得乙型肝炎疫苗?；卮鹣铝袉栴}：(1)人體接種乙型肝炎疫苗后，該疫苗可作為刺激機(jī)體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。乙型肝炎疫苗先后需要接種多次，其目的是。(2)如果已知乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列，則可以推測出相應(yīng)目的基因的核苷酸序列，但推測出的目的基因核苷酸序列并不是唯一的，其原因是。(3)將編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因?qū)虢湍妇?xì)胞之前需要構(gòu)建基因表達(dá)載體，這一過程中需要的工具酶主要有。構(gòu)建的基因表達(dá)載體中，編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因應(yīng)該位于之間。(4)將編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因?qū)虢湍妇?xì)胞時(shí)，使該基因在酵母菌細(xì)胞中得以穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是。【答案】(1)抗原使人體產(chǎn)生更多的抗體和記憶細(xì)胞(2)決定氨基酸的密碼子具有簡并性(或決定一種氨基酸的密碼子往往不是只有一種)(3)限制酶和DNA連接酶啟動(dòng)子和終止子(4)確保編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因插入到酵母菌細(xì)胞的染色體DNA上【解析】(1)乙型肝炎疫苗可作為抗原引起人體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。乙型肝炎疫苗需先后接種多次的目的是使人體產(chǎn)生更多的抗體和記憶細(xì)胞，以發(fā)揮最大的免疫效果。(2)由于mRNA上的密碼子具有簡并性，根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測出的mRNA的核苷酸序列不是唯一的，所以推測出的基因的核苷酸序列不是唯一的。(3)在構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中，需要用限制酶切割目的基因片段與載體，再用DNA連接酶把目的基因與載體連接起來。構(gòu)建的基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子和終止子分別是基因表達(dá)中轉(zhuǎn)錄起始和終止的調(diào)控序列，目的基因需要插在啟動(dòng)子和終止子之間。(4)真核細(xì)胞分裂時(shí)細(xì)胞質(zhì)DNA隨機(jī)分配，應(yīng)將目的基因插入到酵母菌細(xì)胞的染色體DNA上，以確保目的基因在酵母菌細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳。【真題演練】1.（2021湖北,16）某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對(duì)）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對(duì)）。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是（）A.增加模板DNA量 B.延長熱變性的時(shí)間C.延長延伸的時(shí)間 D.提高復(fù)性的溫度【答案】D【解析】【分析】多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，PCR過程一般經(jīng)歷下述三循環(huán)：95℃下使模板DNA變性、解鏈→55℃下復(fù)性（引物與DNA模板鏈結(jié)合）→72℃下引物鏈延伸（形成新的脫氧核苷酸鏈）。【詳解】A、增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速度，但不能有效減少非特異性條帶，A錯(cuò)誤；BC、延長熱變性的時(shí)間和延長延伸的時(shí)間會(huì)影響變性延伸過程，但對(duì)于延伸中的配對(duì)影響不大，故不能有效減少反應(yīng)非特異性條帶，BC錯(cuò)誤；D、非特異性產(chǎn)物增加的原因可能是復(fù)性溫度過低會(huì)造成引物與模板的結(jié)合位點(diǎn)增加，故可通過提高復(fù)性的溫度來減少反應(yīng)非特異性條帶的產(chǎn)生，D正確。2.（2020北京生物高考題）12.為了對(duì)重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HMA3）基因與外源高效啟動(dòng)子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中（如圖）。為檢測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，同時(shí)避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)選擇的引物組合是（）A.①+③ B.①+② C.③+② D.③+④【答案】B【解析】圖示中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HMA3）基因與外源高效啟動(dòng)子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中，若要檢測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因和高效啟動(dòng)子，需要檢測是否含有高效啟動(dòng)子序列和HMA3基因序列，應(yīng)選擇的引物組合是①+②，即B正確，ACD錯(cuò)誤。3.（2021湖北，16）某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對(duì)）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對(duì)）。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是（）A.增加模板DNA量 B.延長熱變性的時(shí)間C.延長延伸的時(shí)間 D.提高復(fù)性的溫度【答案】D【解析】增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速度，但不能有效減少非特異性條帶，A錯(cuò)誤；延長熱變性的時(shí)間和延長延伸的時(shí)間會(huì)影響變性延伸過程，但對(duì)于延伸中的配對(duì)影響不大，故不能有效減少反應(yīng)非特異性條帶，BC錯(cuò)誤；非特異性產(chǎn)物增加的原因可能是復(fù)性溫度過低會(huì)造成引物與模板的結(jié)合位點(diǎn)增加，故可通過提高復(fù)性的溫度來減少反應(yīng)非特異性條帶的產(chǎn)生，D正確。4.（2020?北京）為了對(duì)重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HMA3）基因與外源高效啟動(dòng)子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中（如圖）。（注：①、②、③、④表示引物）為檢測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，同時(shí)避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)選擇的引物組合是（）A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④【答案】B【解析】圖示中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HMA3）基因與外源高效啟動(dòng)子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中，若要檢測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因和高效啟動(dòng)子，需要檢測是否含有高效啟動(dòng)子序列和HMA3基因序列，應(yīng)選擇的引物組合是①+②，即B正確，ACD錯(cuò)誤。5.（2019?北京）篩選淀粉分解菌需使用以淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基。接種培養(yǎng)后，若細(xì)菌能分解淀粉，培養(yǎng)平板經(jīng)稀碘液處理，會(huì)出現(xiàn)以菌落為中心的透明圈（如圖），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表。菌種菌落直徑：C（mm）透明圈直徑：H（mm）H/C細(xì)菌Ⅰ5.111.22.2細(xì)菌Ⅱ8.113.01.6有關(guān)本實(shí)驗(yàn)的敘述，錯(cuò)誤的是（）A．培養(yǎng)基除淀粉外還含有氮源等其他營養(yǎng)物質(zhì) B．篩選分解淀粉的細(xì)菌時(shí)，菌液應(yīng)稀釋后涂布 C．以上兩種細(xì)菌均不能將淀粉酶分泌至細(xì)胞外 D．H/C值反映了兩種細(xì)菌分解淀粉能力的差異【答案】C【解析】篩選淀粉分解菌的培養(yǎng)基中，除淀粉提供碳源外，還需要氮源、水、無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)，A正確；篩選分離淀粉分解菌時(shí)需要將菌液進(jìn)行一定程度的稀釋才能涂布培養(yǎng)，B正確；據(jù)圖分析可知，兩個(gè)菌落均產(chǎn)生了透明圈，說明兩種細(xì)菌均能將淀粉酶分泌至細(xì)胞外，C錯(cuò)誤；據(jù)表分析可知，H/C值越大，分解淀粉能力越強(qiáng)，該值的大小反映了兩種細(xì)菌分解淀粉能力的差異，D正確。6.（2017?北京）為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1），擬將其與質(zhì)粒（圖2）重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖牵ǎ〢．用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒 B．用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞 C．在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞 D．用分子雜交方法檢測C基因是否整合到菊花染色體上【答案】C【解析】據(jù)圖分析可知，在目的基因的兩端、啟動(dòng)子和終止子之間都有限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ的切割位點(diǎn)，因此可以用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ切割目的基因和運(yùn)載體，之后再用DNA連接酶連接形成基因表達(dá)載體，A正確；將目的基因?qū)氲街参锛?xì)胞，常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，可以將目的基因C導(dǎo)入到農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的T﹣DNA段，之后再用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞中染色體上的DNA上，B正確；圖2中顯示標(biāo)記基因是潮霉素抗性基因，應(yīng)該在培養(yǎng)基中添加潮霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌，C錯(cuò)誤；要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用分子雜交技術(shù)，D正確。7.（2021?北京）新冠病毒（SARS﹣CoV﹣2）引起的疫情仍在一些國家和地區(qū)肆虐，接種疫苗是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多種，其中我國科學(xué)家已研發(fā)出的腺病毒載體重組新冠病毒疫苗（重組疫苗）是一種基因工程疫苗，其基本制備步驟是：將新冠病毒的S基因連接到位于載體上的腺病毒基因組DNA中，重組載體經(jīng)擴(kuò)增后轉(zhuǎn)入特定動(dòng)物細(xì)胞，進(jìn)而獲得重組腺病毒并制成疫苗。（1）新冠病毒是RNA病毒，一般先通過得到cDNA，經(jīng)獲取S基因，酶切后再連接到載體。（2）重組疫苗中的S基因應(yīng)編碼。A.病毒與細(xì)胞識(shí)別的蛋白B.與病毒核酸結(jié)合的蛋白C.催化病毒核酸復(fù)制的酶D.幫助病毒組裝的蛋白（3）為保證安全性，制備重組疫苗時(shí)刪除了腺病毒的某些基因，使其在人體中無法增殖，但重組疫苗仍然可以誘發(fā)人體產(chǎn)生針對(duì)新冠病毒的特異性免疫應(yīng)答。該疫苗發(fā)揮作用的過程是：接種疫苗→→→誘發(fā)特異性免疫反應(yīng)。（4）重組疫苗只需注射一針即可完成接種。數(shù)周后，接種者體內(nèi)仍然能檢測到重組腺病毒DNA，但其DNA不會(huì)整合到人的基因組中。請(qǐng)由此推測只需注射一針即可起到免疫保護(hù)作用的原因?！敬鸢浮浚?）逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增（2）A（3）（重組腺病毒）進(jìn)入細(xì)胞表達(dá)抗原（4）重組腺病毒DNA在人體細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)抗原，反復(fù)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)【解析】（1）新冠病毒是RNA病毒，其遺傳物質(zhì)是RNA，若要得到與其對(duì)應(yīng)的cDNA，則要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用cDNA擴(kuò)增出目的基因—S基因需要利用PCR擴(kuò)增技術(shù)。（2）重組疫苗作為抗原需要被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別，而重組疫苗中的S基因是從新冠病毒中提取的，所以重組疫苗中的S基因應(yīng)編碼病毒與細(xì)胞都能識(shí)別的蛋白，A正確，BCD錯(cuò)誤。故選A。（3）重組疫苗對(duì)人體來說屬于外來異物，即抗原，故人體接種疫苗后，重組腺病毒進(jìn)入人體細(xì)胞，其在人體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出抗原，引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫﹣﹣細(xì)胞免疫和體液免疫，因此該疫苗發(fā)揮作用的過程是：接種疫苗→（重組腺病毒）進(jìn)入細(xì)胞→表達(dá)抗原→誘發(fā)特異性免疫反應(yīng)。（4）接種疫苗后，由于長時(shí)間內(nèi)接種者體內(nèi)仍能檢測到重組腺病毒DNA，而DNA會(huì)不斷表達(dá)出S蛋白，S蛋白作為抗原刺激機(jī)體，故機(jī)體會(huì)反復(fù)針對(duì)抗原產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。8.（2019?北京）光合作用是地球上最重要的化學(xué)反應(yīng)，發(fā)生在高等植物、藻類和光合細(xì)菌中。（1）地球上生命活動(dòng)所需的能量主要來源于光反應(yīng)吸收的。在碳（暗）反應(yīng)中，RuBP羧化酶（R酶）催化CO2與RuBP（C5）結(jié)合，生成2分子C3．影響該反應(yīng)的外部因素，除光照條件外還包括（寫出兩個(gè)）；內(nèi)部因素包括（寫出兩個(gè)）。（2）R酶由8個(gè)大亞基蛋白（L）和8個(gè)小亞基蛋白（S）組成。高等植物細(xì)胞中L由葉綠體基因編碼并在葉綠體中合成，S由細(xì)胞核基因編碼并在中由核糖體合成后進(jìn)入葉綠體，在葉綠體的中與L組裝成有功能的酶。（3）研究發(fā)現(xiàn)，原核生物藍(lán)藻（藍(lán)細(xì)菌）R酶的活性高于高等植物。有人設(shè)想通過基因工程技術(shù)將藍(lán)藻R酶的S、L基因轉(zhuǎn)入高等植物，以提高后者的光合作用效率。研究人員將藍(lán)藻S、L基因轉(zhuǎn)入某高等植物（甲）的葉綠體DNA中，同時(shí)去除甲的L基因。轉(zhuǎn)基因植株能夠存活并生長。檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株中的R酶活性高于未轉(zhuǎn)基因的正常植株。①由上述實(shí)驗(yàn)?zāi)芊竦贸觥稗D(zhuǎn)基因植株中有活性的R酶是由藍(lán)藻的S、L組裝而成”的推測？請(qǐng)說明理由。。②基于上述實(shí)驗(yàn)，下列敘述中能夠體現(xiàn)生物統(tǒng)一性的選項(xiàng)包括。a．藍(lán)藻與甲都以DNA作為遺傳物質(zhì)b．藍(lán)藻與甲都以R酶催化CO2的固定c．藍(lán)藻R酶大亞基蛋白可在甲的葉綠體中合成d．在藍(lán)藻與甲的葉肉細(xì)胞中R酶組裝的位置不同【答案】（1）光能溫度、CO2濃度色素含量及種類、酶的含量及活性（2）細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)基質(zhì)（3）①不能，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因植株仍包含甲植株的S基因，不能排除轉(zhuǎn)基因植株中R酶由藍(lán)藻的L蛋白和甲植株的S蛋白組成②a、b、c【解析】1、光合作用的過程圖解：2、基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因﹣﹣DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA﹣﹣分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)﹣﹣抗原﹣抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。（1）地球上生命活動(dòng)所需的能量主要來源于光反應(yīng)吸收的光能。在碳（暗）反應(yīng)中，RuBP羧化酶（R酶）催化CO2與RuBP（C5）結(jié)合，生成2分子C3．影響該反應(yīng)的外部因素，除光照條件外還包括溫度、CO2濃度等；內(nèi)部因素包括色素含量及種類、酶的含量及活性等。（2）R酶由8個(gè)大亞基蛋白（L）和8個(gè)小亞基蛋白（S）組成。高等植物細(xì)胞中L由葉綠體基因編碼并在葉綠體中合成，S由細(xì)胞核基因編碼并在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中由核糖體合成后進(jìn)入葉綠體，在葉綠體的中與L組裝成有功能的酶。（3）①由上述實(shí)驗(yàn)不能得出“轉(zhuǎn)基因植株中有活性的R酶是由藍(lán)藻的S、L組裝而成”的推測，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因植株仍包含甲植株的S基因，不能排除轉(zhuǎn)基因植株中R酶由藍(lán)藻的L蛋白和甲植株的S蛋白組成。②藍(lán)藻與甲都以DNA作為遺傳物質(zhì)，能體現(xiàn)生