從男性尿液中提取尿激酶并進行活性測定實驗報告

PAGE“設(shè)計性實驗”項目申請書項目名稱從男性尿液中提取尿激酶并進行活性測定項目負責人申卓凡年級、專業(yè)2014級唐敖慶班化學方向聯(lián)系電子郵件shenzhuofan01@填表日期2016年月日國家級生物實驗教學示范中心制表填表說明1、本申請書適用于各門實驗課程的設(shè)計實驗。2、《設(shè)計性項目申請書》要按順序逐項填寫。填寫內(nèi)容要實事求是，講究誠信，不能有雷同；表達要明確、嚴謹?？杖表椧睢盁o”。3、格式要求：（1）一律用A4紙打印，于左側(cè)裝訂成冊。（2）字體：中文用宋體，英文和數(shù)字用Times

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Roman字體，行距為1.5倍行距。（2）一級標題：標題編排應(yīng)采用“（一）、（二）、（三）”等依次分級編號，左起縮進2字符，宋體加黑，字號為小四號。（3）二級標題：標題編排應(yīng)采用“1、2、3、”等依次分級編號，左起縮進2字符，宋體加黑，字號為五號。（4）內(nèi)容：字號為五號，每段第一行左起縮進2字符。4、“設(shè)計性實驗”項目每人填寫一項。5、參考文獻按照國家標準《文后參考文獻著錄規(guī)則》(GB7714-87)要求書寫。6、本《申請書》各頁不夠可自行加頁項目名稱從男性尿液中提取尿激酶并進行活性測定經(jīng)費5000（元）起止時間2016年6月至2016年8月負責人學號姓名年級專業(yè)聯(lián)系電話E-mail12140916申卓凡2014級唐敖慶班化學方henzhuofan01@163.com一、立項背景和依據(jù)（一）研究目的尿激酶（簡稱UK）是一種從人尿中提取的藥物，在臨床上被用于溶栓劑，預防和控制心肌梗死、高血壓、動脈硬化等；具有抗肺癌轉(zhuǎn)移作用，可用于治療癌癥；能降低精液黏稠度，促使精子和卵子結(jié)合受孕。UK通常從健康新鮮尿液中分離得到，該法因原料易得、價錢便宜而被廣泛應(yīng)用。由于UK有著重要的醫(yī)療價值，所以許多研究報導了各種從尿液中分離、提純尿激酶的方法。但這些方法都面臨著兩個方面的問題：第一，提取和純化的收率要高，盡可能保留酶的總活力；第二，精制后產(chǎn)品的比活要達到一定的高度。本項目研究的目的就是為了提高分離和提純的效率。（二）國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析對于提取、純化尿激酶的方法，國內(nèi)外已有許多報導。目前，從已發(fā)表的文章和專利來看，從尿液中分離、提純尿激酶主要有這些思路：①發(fā)泡法：向尿液通氣發(fā)泡，收集泡沫，滴加消泡劑使泡沫液化，使尿液得以濃縮，加入沉淀劑使尿激酶沉淀得到粗品；②沉淀法：在尿液中加入沉淀劑，使尿激酶沉淀得粗品；③吸附法：采用最多的方法。選擇適當?shù)奈絼┻x擇性吸附尿激酶，然后將其洗脫得尿激酶粗品。常用的吸附劑有硅膠、樹脂等；④離子交換法；⑤超濾法。（三）研究意義因人尿中尿激酶的含量很低，取得尿激酶的關(guān)鍵在于如何從大量的尿液中富集尿激酶。從上世紀70年代至今，國內(nèi)對尿激酶的提取工藝一直不盡人意。國內(nèi)生產(chǎn)的尿激酶粗品僅有一部分制成精品，不少粗品直接出口由外商加工精制銷售賺取利潤。對尿激酶純化技術(shù)進行研究，利國利民，具有顯著的經(jīng)濟效益和社會效益。（四）主要參考文獻[1]生物化學教研室尿激酶組.尿激酶(人尿)的分離與精制——(Ⅰ)尿激酶的分離[J].吉林大學自然科學學報,1979(2).[2]劉蘭英,孫中武,尹洪濱,等.以732陽離子交換樹脂為吸附劑分離尿激酶的研究[J].吉林大學自然科學學報,1981(4).[3]趙新燕,劉艷.尿激酶的分離與純化研究[J].現(xiàn)代制造,2013(5):21-24.[4]祝一鋒,蔡志亮,趙忠睦,等.尿激酶精制新工藝[J].浙江工業(yè)大學學報,1998(1):63-66.[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].二部.2015年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:532-533.[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].四部.2015年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:96-97.二、項目研究內(nèi)容（一）項目主要研究內(nèi)容該項目主要設(shè)計了一套從新鮮男性尿液中提取、純化尿激酶并進行酶活力測定的實驗方案。（二）擬解決的關(guān)鍵問題1、提取和純化的收率問題人尿中尿激酶的含量很低，取得尿激酶的關(guān)鍵在于如何從大量的尿液中高收率地富集尿激酶。純化尿激酶的各步驟中，如何在提高比活倍數(shù)的同時盡量保存尿激酶的總活力也是一個關(guān)鍵問題。2、精制粗品時提高比活的問題精制后產(chǎn)品的比活要達到一定的高度，藥用尿激酶要求達到臨床上“安全有效”的純度。（三）創(chuàng)新點1、高效本項目提供了與其他方案相比更加高效的一系列從尿液中分離、純化尿激酶的實驗方法。以732陽離子交換樹脂作為尿激酶吸附劑，比其他傳統(tǒng)方法提取收率高約10%。2、低成本本實驗方案設(shè)計較為科學，在保證效果的前提下，通過不同試劑使用量及其效果的對比，能做到盡量節(jié)約。且沒有用到不必要的昂貴設(shè)備。3、較為簡便本實驗流程設(shè)計盡量減少了繁瑣無必要的操作步驟，以求快速高效。三、項目實施方案（一）研究思路由于報道的現(xiàn)有許多種分離、提純方法各有優(yōu)缺點，所以計劃采取文獻中記載的各種路線的不同可取部分來綜合設(shè)計實驗方案。（二）技術(shù)路線1、從尿液中分離尿激酶的路線2、提純尿激酶粗品的路線（三）研究方法擬通過樹脂吸附法從新鮮尿液中提取粗品尿激酶，再通過一系列凝膠層析和離子交換層析精制純化尿激酶粗品。同時每一步操作得到的樣品都用發(fā)泡法測定酶活力（IU/mL或IU/mg）。最后用Folin-酚法測定精制后尿激酶粉末的蛋白質(zhì)含量，換算出比活（IU/mg）。（四）實施計劃1、從尿液中分離尿激酶粗品①堿化除沉淀將新鮮男性尿液用5mol/LNaOH溶液調(diào)至pH值為9.0，靜置1小時，虹吸上清液，棄去灰白色的沉淀。②732陽離子交換樹脂樹脂吸附尿激酶將虹吸的上清液用5mol/L鹽酸調(diào)到pH值為5.3—5.5，加3%（W/V）732樹脂，攪拌吸附1.5小時。停止攪拌后，樹脂自然下沉。虹吸去掉殘余尿液，收集吸附有UK的樹脂。③洗滌用0.1mol/L，pH值5.5的磷酸緩沖液（體積為上清液的10%），攪拌洗滌0.5小時。虹吸去上清液。再以0.1mol/L、pH值6.4的磷酸緩沖液攪拌洗滌0.5小時。虹吸去上清液，收集樹脂。④洗脫第一次洗脫：用2%氨水（用量為pH9.0的上清液的3.5%）攪拌洗脫1.5小時。第二次洗脫：以同樣量的洗脫液攪拌洗脫0.5小時，抽濾收集洗脫液。合并兩次洗脫液，測量其體積。⑤硫酸銨沉淀按洗脫液體積加入固體硫酸銨，不斷攪拌使其溶解，并使其飽和度達65%。用5mol/L鹽酸調(diào)到pH值為8.6。于0—-2℃下沉淀8小時。冷凍離心收集棕色的尿激酶粗品沉淀。2、尿激酶的精制①SephadexG-50凝膠過濾除鹽將UK粗品用預冷至0一5℃的無熱原蒸餾水溶解，制成UK含量為(2—3)*104IU/mL的UK水溶液，立即用冷凍離心機分離，收集上清液，用2mol/L鹽酸或2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.5。將此溶液上SephadexG-50凝膠柱（此柱預先用pH6.5，0.1mol/L的磷酸鈉緩沖液平衡），上樣體積控制在柱床體積的15%—25%，收集流出液中含UK的部分。②CM-SephadexC-50離子交換層析預先用pH6.5，0.1mol/L的磷酸鈉緩沖液平衡CM-SephadexC-50離子交換層析柱。將上一步收集到的UK溶液上平衡過的離子交換層析柱，加1個床體積的柱平衡液洗滌后，用0.6mol/L的氯化鈉溶液洗脫，收集UK活力部分。③硫酸鈉沉淀在上一步收集的UK溶液中緩緩加人固體硫酸鈉（430g/L），邊加邊攪拌，直至加入的硫酸鈉溶解，立即用冷凍離心機分離，收集UK沉淀物。④Bio-GelP–30凝膠過濾將上一步收集的UK沉淀物用0—5℃的無熱原蒸餾水溶解，制成UK含量為(5—10)*104IU/mL的溶液，上Bio-GelP–30凝膠柱（此柱預先用0.3mol/L的氯化鈉溶液平衡），上樣量控制在柱床體積的8%—12%，隨時監(jiān)測流出液的UK活力，收集第一個流出峰部分，即H-UK部分。⑤產(chǎn)品的除菌及冷凍干燥將上述工序收集的H-UK溶液添加1%—5%的甘露醇作賦形劑（加量多少依產(chǎn)品效價要求和冷凍干燥情況而定），用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后，立即進行冷凍干燥，冷凍干燥后的UK為粉狀產(chǎn)品，密封于容器內(nèi)，置0—5℃下保存。3、尿激酶的活性測定（氣泡法）①試劑的配制牛纖維蛋白原溶液：取牛纖維蛋白原，加巴比妥-氯化鈉緩沖液（pH7.8）溶解并稀釋制成每1mL中含6.67mg可凝結(jié)蛋白的溶液。牛凝血酶溶液：取牛凝血酶，加巴比妥-氯化鈉緩沖液（pH7.8）溶解并稀釋制成每1mL中含6.0單位的溶液。牛纖維蛋白溶酶原溶液：取牛纖維蛋白溶酶原，加三羥甲基氨基甲烷緩沖液（pH9.0）溶解并稀釋制成每1mL中含1—1.4酪蛋白單位的溶液（如溶液渾濁，離心，取上清液備用）?；旌先芤号R用前取等體積的牛凝血酶溶液和牛纖維蛋白溶酶原溶液，混勻。②UK標準品溶液的制備取UK標準品，加巴比妥-氯化鈉緩沖液（pH7.8）溶解并定量稀釋制成每1mL中含60單位的溶液。③UK供試品溶液的制備取前面步驟得到的尿激酶樣品適量，精密稱定，加巴比妥-氯化鈉緩沖液（pH7.8）溶解并定量稀釋制成與標準品溶液相同濃度的溶液，搖勻。④測定法取試管4支，各加牛纖維蛋白原溶液0.3mL，置于37℃±0.5℃水浴中，分別加巴比妥-氯化鈉緩沖液（pH7.8）0.9mL、0.8mL、0.7mL、0.6mL，依次加標準品溶液0.lmL、0.2mL、0.3mL、0.4mL，再分別加混合溶液0.4mL，立即搖勻，分別計時。反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)在30—40秒內(nèi)凝結(jié)，當凝塊內(nèi)小氣泡上升到反應(yīng)系統(tǒng)體積一半時作為反應(yīng)終點，立即計時。每個濃度測3次，求平均值（3次測定中最大值與最小值的差不得超過平均值的10%）。以尿激酶濃度的對數(shù)為橫坐標，以反應(yīng)終點時間的對數(shù)為縱坐標，進行線性回歸。供試品按上法測定，用線性回歸方程求得供試品溶液濃度，計算每1mg供試品的酶活力（單位）。⑤空白實驗以0.9%氯化鈉溶液作空白液，同上述方法操作（試劑的配制同上述酶活力測定步驟）。4、尿激酶中蛋白含量的測定（Folin-酚法）①Folin試液的配制取氫氧化鈉10g，碳酸鈉50g，加水400mL使溶解，作為甲液。取酒石酸鉀0.5g，加水50mL使溶解；另取硫酸銅0.25g，加水30mL使溶解，將兩液混合作為乙液。②對照品溶液的制備取牛血清白蛋白對照品，加水溶解并制成每1mL中含0.2mg蛋白的溶液。③UK供試品溶液的制備精密稱量經(jīng)上述步驟提取、精制的尿激酶粉末約10mg，用0.9%氯化鈉溶液定量稀釋，制成每1mL中蛋白質(zhì)含量約0.2mg的溶液。④繪制標準曲線精密量取對照品溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分別置具塞試管中，各加水至1.0mL，再分別加入Folin甲試液1.0mL，搖勻，室溫放置10分鐘。各加入Folin乙試液4.0mL，立即混勻，室溫放置0.5小時，照紫外-可見分光光度法，在650nm波長處測定吸光度，同時以0號管作為空白。以蛋白質(zhì)含量與其相對應(yīng)的吸光度計算線性回歸方程。⑤測定法精密量取供試品UK溶液適量，依照相同方法測定。從線性回歸方程計算UK供試品溶液中的蛋白質(zhì)含量并乘以體積倍數(shù)，即得10mg尿激酶粉末中的蛋白質(zhì)含量。由3和4的結(jié)果可以計算所得尿激酶蛋白質(zhì)的比活，即每1mg蛋白質(zhì)中所含的酶活力單位數(shù)，單位是IU/mg。（五）預期結(jié)果用732陽離子交換樹脂從尿液中吸附尿激酶，預期平均收率約為70%-80%，比活為600-800CTA/mg尿激酶粗品；依2中的步驟純化尿激酶，預期平均總收率為60%左右，比活提高總倍數(shù)能穩(wěn)定在50倍以上，這些結(jié)果說明該實驗方案的可行性較高。用氣泡法測定尿激酶的活性時，混合液搖勻計時后預期應(yīng)在30-45秒內(nèi)凝結(jié)，且凝塊在15分鐘內(nèi)重新溶解。以0.9%氯化鈉溶液作空白，同法操作時，凝塊在2小時內(nèi)不溶。尿激酶樣品的活性、蛋白含量、比活取決于實驗具體操作情況。四、擬利用資源（一）儀器設(shè)備冷凍離心機，層析柱，0.22μm微孔濾膜，恒流泵，紫外檢測儀，恒溫水浴鍋，紫外-可見分光光度計。（二）實驗材料新鮮尿液，蒸餾水，732樹脂（100—220目），5mol/LNaOH溶液，5mol/L鹽酸，0.1mol/LpH5.5磷酸緩沖液，0.1mol/LpH6.5磷酸緩沖液，2%氨水，硫酸銨，2mol/L鹽酸，2mol/LNaOH溶液，SephadexG-50凝膠，CM-SephadexC-50離子交換樹脂，0.6mol/LNaCl溶液，Bio-GelP–30凝膠，0.3mol/LNaCl溶液，甘露醇，牛纖維蛋白原，牛凝血酶，牛纖維蛋白溶酶原，pH7.8巴比妥-氯化鈉緩沖液，尿激酶標準品，pH9.0三羥甲基氨基甲烷緩沖液，0.9%氯化鈉溶液，F(xiàn)olin甲、乙試液，牛血清白蛋白。五、教師評語與成績實驗成績：指導教師（簽名）：