2024-2025學(xué)年講義生物（選擇性人教版2019）第3章第2節(jié)實驗突破二DNA片段的擴增及電泳鑒定

一、DNA片段的擴增1．實驗原理2．實驗步驟二、PCR擴增產(chǎn)物的電泳鑒定1．實驗原理2．實驗步驟三、操作提示1．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。2．緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。四、關(guān)鍵點撥1．PCR擴增目的基因時，復(fù)性溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。復(fù)性溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對，復(fù)性溫度過低又會造成引物不能與DNA模板鏈的特定部位結(jié)合。復(fù)性溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，假設(shè)引物的長度相同，在G、C含量高時，設(shè)定的復(fù)性溫度要高一些。因為DNA分子中G—C之間有三個氫鍵，A—T之間有兩個氫鍵。2．未出現(xiàn)擴增條帶的主要原因(1)TaqDNA聚合酶失活。(2)引物出現(xiàn)質(zhì)量問題。(3)Mg2＋濃度過低。(4)變性時的溫度低，變性時間短。3．出現(xiàn)非特異性擴增條帶的主要原因(1)模板DNA出現(xiàn)污染。(2)引物特異性不強或形成引物二聚體。(3)Mg2＋濃度過高。(4)復(fù)性時的溫度過低等。例1(2023·云南昆明高二月考)關(guān)于“DNA片段的擴增及電泳鑒定”實驗，下列相關(guān)敘述正確的是()A．PCR儀實質(zhì)上就是一臺能自動調(diào)控溫度的儀器，但在使用時需根據(jù)擴增的DNA片段以及引物的情況人工設(shè)定合適的溫度B．PCR反應(yīng)體系中需加入耐高溫的DNA聚合酶，該酶主要在復(fù)性過程中起作用C．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水和移液器等在使用前都必須進行高壓滅菌處理D．電泳時，電泳緩沖液不能沒過凝膠，以免凝膠加樣孔中的電泳樣液流出答案A解析PCR反應(yīng)體系中需加入耐高溫的DNA聚合酶，該酶主要在延伸過程中起作用，B錯誤；為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水等在使用前都必須進行高壓滅菌處理，移液器不需要高壓滅菌，C錯誤；電泳時，電泳緩沖液以沒過凝膠1mm為宜，D錯誤。例2用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時，得到以下電泳圖譜，其中1號為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液(Marker)，10號為蒸餾水，PCR時加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此作出的分析，不合理的是()A．PCR產(chǎn)物的分子大小在250～500bp之間B．3號樣品為不含目的基因的載體DNAC．9號樣品對應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株D．10號確定反應(yīng)體系等對結(jié)果沒有干擾答案B解析PCR過程中，可以通過設(shè)計特定的引物來擴增特定的DNA片段，4～9號是轉(zhuǎn)基因植株，理論上應(yīng)包含目的基因，結(jié)合2號野生型和10號蒸餾水組的結(jié)果，推測包含目的基因的片段大小應(yīng)為250～500bp，A合理；3號PCR結(jié)果包含250～500bp片段，應(yīng)包含目的基因，B不合理；9號PCR結(jié)果不包含250～500bp片段，所以不是所需轉(zhuǎn)基因植株，C合理；10號放入蒸餾水，可排除反應(yīng)體系等對結(jié)果的干擾，D合理。1．使用PCR儀的正確實驗操作順序應(yīng)為()①設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序②按配方準(zhǔn)備好各組分③用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分④進行PCR反應(yīng)⑤離心使反應(yīng)液集中在離心管的底部A．②⑤③④① B．①⑤③②④C．②③⑤①④ D．④②⑤③①答案C解析PCR反應(yīng)的操作步驟一般為準(zhǔn)備(包括配制試劑及將各試劑放于實驗臺上)→移液→混合→離心→反應(yīng)。PCR儀是一種能自動調(diào)控溫度的儀器，設(shè)置好循環(huán)程序就可以進行反應(yīng)。2．下列關(guān)于PCR操作過程的敘述，錯誤的是()A．PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理B．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，在－20℃儲存C．將PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出，需放在高溫環(huán)境中迅速融化D．在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換答案C解析將PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出，需放在冰塊上緩慢融化，C錯誤。3．(2023·重慶渝中區(qū)高二期中)某實驗利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實驗結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是()A．增加模板DNA的量 B．延長熱變性的時間C．延長延伸的時間 D．提高復(fù)性的溫度答案D解析增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速度，但不能有效減少非特異性條帶的產(chǎn)生，A錯誤；延長熱變性的時間和延長延伸的時間會影響變性延伸過程，但對于延伸中的配對影響不大，故不能有效減少產(chǎn)生非特異性條帶，B、C錯誤；非特異性條帶增加的原因可能是復(fù)性溫度過低而造成引物與模板的錯配，故可通過提高復(fù)性的溫度來減少非特異性條帶的產(chǎn)生，D正確。4．下列有關(guān)電泳的敘述，不正確的是()A．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程B．待測樣品中DNA分子的大小和構(gòu)象、凝膠的濃度等都會影響DNA在電泳中的遷移速率C．進行電泳時，帶電分子會向著與其所帶電荷相同的電極移動D．PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定答案C解析由于同性相斥、異性相吸，帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動，C錯誤。5．為優(yōu)化目的基因(700bp)的PCR條件，研究者設(shè)計不同的復(fù)性溫度進行實驗，產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖。據(jù)圖分析，下列有關(guān)說法錯誤的是()A．對照組可用無菌蒸餾水代替模板，其他成分相同B．電泳條帶的寬度、亮度與擴增產(chǎn)物大小呈正相關(guān)C．復(fù)性溫度的高低會影響PCR擴增產(chǎn)物的純度D．58℃是本實驗中擴增該基因的最佳復(fù)性溫度答案B解析實驗設(shè)計應(yīng)遵循對照原則與單一變量原則，故對照組可用無菌蒸餾水代替模板，其他成分相同，A正確；PCR技術(shù)中，反應(yīng)最終的電泳條帶的寬度、亮度與PCR起始狀態(tài)的模板DNA(或者模板)含量呈正相關(guān)，B錯誤；據(jù)圖可知，58℃條件下條帶寬度最大，故該溫度是本實驗中擴增該基因的最佳復(fù)性溫度，D正確。6．(2023·江蘇揚州高二期末)在基因工程操作中，科研人員利用兩種限制酶(R1和R2)處理基因載體，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖所示。下列相關(guān)敘述不正確的是()A．電泳時，核酸的移動方向是從負極到正極的B．該載體最可能為環(huán)狀DNA分子C．限制酶R1與R2的切點最長相距約600bpD．兩種限制酶在載體上識別的序列可能相同答案D解析根據(jù)圖示可知，200bp的DNA分子量小，800bp的DNA分子量較大，200bp的DNA移動速度快，所以在電泳時，核酸的移動方向是從負極到正極的，A正確；當(dāng)僅用一種限制酶切割載體時，僅產(chǎn)生一種長度的DNA片段，因此該載體最有可能為環(huán)狀DNA分子，B正確；兩種限制酶同時切