DB13-T 1778-2013 魚類鏈球菌病診斷技術(shù)規(guī)范

ICS 67.120.30B

50DB13

of

diagnosis

streptococcicosis

河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局

DB13/T

1778—2013前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T

1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北省水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治監(jiān)測(cè)總站。薛政。IDB13/T

1778—2013魚類鏈球菌病診斷技術(shù)規(guī)范1

范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了魚類鏈球菌病的診斷方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于魚類鏈球菌病病原菌的鑒定及本病的流行病學(xué)調(diào)查、診斷、檢疫和監(jiān)測(cè)。2

規(guī)范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)

染色法、培養(yǎng)基和試劑GB/T

6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3

術(shù)語和定義3.1

下列術(shù)語和定義適用于本文件。病原菌鏈球菌（Streptococcus）呈球形或卵圓形，在液體培養(yǎng)基中以成對(duì)或鏈狀出現(xiàn)；革蘭氏陽性、觸Streptococcus

iniae）、無乳鏈球菌（Streptococcus

agalactiae）、米氏鏈球菌（Streptococcus

millieri）、副乳房鏈球菌（Streptococcus

parauberis）和停乳鏈球菌（Streptococcus

dysgalactiae）。其中海豚鏈球菌和無乳鏈球菌是引起魚類鏈球菌病的主要病原菌。4

設(shè)備和材料設(shè)備和材料包括：a)

恒溫培養(yǎng)箱。b)

顯微鏡：10×～100×。c)

滅菌乳缽。d)

天平：精度

e)

恒溫水浴鍋。f)

帶有熱蓋功能的

PCR

儀。g)

電泳儀。h)

紫外分析儀或紫外觀察燈。i)

滅菌剪刀、鑷子。j)

高壓滅菌器。1DB13/T

1778—20135

培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑包括：a)

水：應(yīng)符合

的要求。b)

Todd-Hewitt

肉湯（簡稱

c)

血瓊脂平板：按

GB/T

4789.28

中規(guī)定。d)

75％酒精。e)

革蘭氏染色液：按

中規(guī)定。f)

3％

H2O2

溶液（臨時(shí)配制）。g)

Taq

DNA

聚合酶。h)

酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）。i)

瓊脂糖。j)

溴化乙錠（EB）。k)

標(biāo)準(zhǔn)菌株：海豚鏈球菌和無乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。l)

dNTP：含

dATP、dCTP、dGTP

和

dTTP

各

10mmol/L。m)

PCR

引物：

為

10μmol/L。其序列如下：E1:

5′－GGACCAATGCCACAAACTCG－3′E2:

5′－TGGAGTATGACGTCCACCTTC－3′n)

DNA

分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）。o)

無水乙醇：使用前預(yù)冷至-20℃。6

診斷步驟6.1 活動(dòng)情況觀察或間斷地狂游、翻滾、轉(zhuǎn)圈。6.2 外部檢查部有出血現(xiàn)象；體表有

l

處或多處隆起，尤以尾部為多見，隆起部位出血或潰瘍。6.3 解剖檢查患病魚腦部充血，有出血點(diǎn)；肝臟腫大、出血，或脂肪變性、褪色；脾臟腫大，呈暗紅色；膽囊、腎臟腫脹；胃腸或腹腔積水，腸壁充血發(fā)炎。6.4 病原菌的實(shí)驗(yàn)室常規(guī)鑒定6.4.1 涂片檢查用

75%酒精棉球擦拭魚體，在無菌條件下取樣品魚的腦、腎、肝、脾等器官的小塊組織,在潔凈載玻片上涂片,風(fēng)干后,革蘭氏染色（按

中的規(guī)定）后鏡檢。如見紫色球菌則表明病料中可能含有鏈球菌。2用無菌生理鹽水稀釋至10

CUF/mL（約麥?zhǔn)媳葷岫?.4），按

用無菌生理鹽水稀釋至10

CUF/mL（約麥?zhǔn)媳葷岫?.4），按

的方法提取細(xì)菌DNA做為PCR反6.4.2 病原菌分離培養(yǎng)脂平板。

25g

滅菌的

THB

培養(yǎng)

24h

士

48h

士

后觀察。6.4.3菌落形態(tài)和顯微鏡觀察直徑大小為

6.4.4 病原菌生化鑒定

菌落接種于營養(yǎng)肉湯（見附錄A.2）于10℃培養(yǎng)48h，觀察是否生長?？设b定為鏈球菌。6.5病原菌的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法鑒定本方法與6.4的方法可任選其一。6.5.1取樣解剖待檢樣品魚，取腦、腎、肝和脾組織約

1.0g，于滅菌乳缽中充分研磨,

再加

TE

(見附錄

A.3)混勻,

然后將組織懸液轉(zhuǎn)入無菌離心管中。6.5.2 模板

DNA

取組織懸液

90μL

于

1.5mL

10μL(10

37

℃水浴

1

h。加入蛋白酶

K

5μL(20

mg/mL),

37

1h，加入

RNA

酶

10μL(10

37

℃水浴

30min,加入

苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合液抽提

3

次，然后加入預(yù)冷的無水乙醇，

r/min

離心

10min，棄上清，自然干燥，用

TE

PCR

反應(yīng)模板

溶液，4

℃保存。也可以使用能夠達(dá)到同種效果的商業(yè)化細(xì)菌DNA提取試劑盒。6.5.3 PCR

擴(kuò)增PCR

反應(yīng)體系

5μL，MgCl2

（25mmol/L）4μL，dNTPs（各

10mmol/L）1μL，E1、E2

引物（10μmol／L）各

1μL，Taq

DNA

聚合酶（5Ｕ/μL）0.5μL，模板

DNA

溶液

雙蒸水

35.5μL。PCR

反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性

5

min；94℃變性

1

min，58℃退火

45

s，72℃延伸

1min，共

35

循環(huán)；72℃延伸

min，最后

每次反應(yīng)應(yīng)設(shè)立陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。將海豚鏈球菌或無乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于THB增菌液中，28℃培養(yǎng)18h～24h，搖勻后取1mL，6 8應(yīng)的陽性模板。以DNA提取液代替陰性對(duì)照模板。以水替代空白對(duì)照模板。3DB13/T

1778—2013PCR

PCR

6.5.4擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳用電泳緩沖液（見附錄

A.4）配制

1.5%的瓊脂糖〔含

0.5μg/mL

EB

溶液〕平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好沒過膠面。將

6μL

2μL

上樣緩沖液（見附錄

6

品孔，同時(shí)加入

DNA

標(biāo)準(zhǔn)分子量（Marker）。5V/cm

電泳約

6.5.5 結(jié)果觀察與判定用紫外分析儀或紫外觀察燈觀察瓊脂糖凝膠；陽性對(duì)照樣會(huì)在與

639bp

片段的位置出現(xiàn)條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照應(yīng)無條帶；如在

639bp

位置出現(xiàn)條帶，則判定為鏈球菌陽性；如在

639bp

位置無條帶，或條帶不在此位置，則判定為鏈球菌陰性。7

綜合判定4DB13/T

1778—2013AA附錄 A（規(guī)范性附錄）試劑配制標(biāo)準(zhǔn)中所用試劑，除特別注明外，均采用分析純?cè)噭?。A.1 Todd-Hewitt肉湯（簡稱THB)牛肉膏 5.0g胰蛋白胨20.0g葡葡糖 2.0g碳酸鈉 2.5g氯化鈉 2.0g磷酸氫二鈉(Na24) 0.4g蒸餾水 1000ml將以上各成份混合煮沸，完全溶化，冷卻至室溫后，調(diào)

pH，于

115℃滅菌

10min，最終

pH

為

7.8。A.2 營養(yǎng)肉湯蛋白陳 10g牛肉膏 3g氯化鈉 5g蒸餾水 按上述成分混合，溶解后校正

至7.4，分裝，每瓶，121℃高壓滅菌。A.3 1×TE

1M

Tris-HCl（PH=8.0） 5ml0.5M

EDTA（PH=8.0） 1ml量取以上溶液于

L

后，高溫高壓滅菌；室溫保存。A.4 5×TBE電泳緩沖液Tris 54g硼酸（HBO3

） 27.5gEDTA 2.922g水1000mL用

5mol/L

pH

8.3，用時(shí)稀釋

5DB13/T

1778—2013A.5 EB(ethidium

bromide，核酸染色劑)用水配制成

的濃縮液，用時(shí)每

10mL

1μL。A.6 上樣緩沖液每水溶液中含溴酚藍(lán)0.25g，蔗糖。6DB13/T

1778—2013BB附 錄 B（資料性附錄）鏈球菌（EF-Tu）tuf

基因序列B.1 無乳鏈球菌延伸因子（EF-Tu）tuf基因序列1

tgagcacatc

cttctttcac

gtcaagttgg

61

tcatgaacaa

agttgacctt

gttgatgatg

aagaattgct

tgaattggtt121

ttcgtgacct

tctttcagaa

tacgacttcc

caggtgatga

ccttccagtt181

cagctcttaa

agcacttgaa

ggcgacgaaa

aatacgaaga

catcatcatg241

gcactgttga

tgagtacatt

ccagaaccag

aacgtgatac

tgacaaacct301

cagttgaaga

tgtattctca

atcactggac

gtggtacagt

tgcttcagga361

gtggtactgt

tcgtgtcaac

gacgaagttg

aaatcgttgg

tattaaagaa421

aagcagttgt

tactggtgtt

gaaatgttcc

gtaaacaact

tgacgaaggt481

acaacgttgg

tgttcttctt

cgtggtgttc

aacgtgatga

aatcgaacgt541

ttgctaaacc

aggttcaatc

aacccacaca

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ctaccgtcca661

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t//B.2 海豚鏈球菌延伸因子（EF-Tu）tuf基因序列1

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ccttccagtt181

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