馬鈴薯晚疫病PCR檢測方法

1馬鈴薯晚疫病PCR檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了馬鈴薯晚疫病菌快速檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于馬鈴薯晚疫病菌快速檢測方法。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T8855新鮮水果和蔬菜取樣方法DB23/T1234-2008馬鈴薯晚疫病檢測方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。相關(guān)資料參見附錄A。3.1馬鈴薯晚疫病Potatolateblight是由致病疫霉Phytophthorainfestans(Montagne)deBary侵染引起馬鈴薯病害?？汕秩抉R鈴薯的葉片、莖桿以及塊莖等。發(fā)病初期病斑多在葉尖和葉緣處形成水浸狀褪綠斑，后擴(kuò)大為圓形暗綠色斑，病斑邊緣界限不明顯。在空氣濕度大時(shí)，病斑可擴(kuò)及葉的大半以及全葉，病斑邊緣有一環(huán)白色稀疏的霉輪，莖部受害，可形成長短不一的褐色斑。塊莖發(fā)病，初為褐色或紫褐色不規(guī)則的病斑，稍凹陷，后期導(dǎo)致薯肉不同深度的褐色壞死。潮濕條件下，莖稈和塊莖發(fā)病部位能夠形成白色稀疏的霉層。4主要儀器設(shè)備及試劑4.1儀器設(shè)備聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymerseChainReactiom，PCR）測定儀器設(shè)備見附錄B，生物學(xué)測定儀器設(shè)備參見附錄C。4.2試劑聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymerseChainReactiom，PCR）測定試劑見附錄B，生物學(xué)測定試劑參見附錄5抽樣與樣品制備5.1抽樣2抽樣按照SN/T2122的規(guī)定進(jìn)行。5.2馬鈴薯葉片和塊莖樣品的制備將馬鈴薯塊莖播于滅菌土中，于25℃進(jìn)行培養(yǎng)。待長出約10片葉后，觀察表型，將表現(xiàn)出癥狀的植株編號(hào)，未表現(xiàn)癥狀的植株分組并編號(hào)。表現(xiàn)癥狀的植株上采集10片有癥狀的葉片混合后提取DNA作為一個(gè)檢測樣本；未表現(xiàn)出癥狀植株上隨機(jī)采集10片葉片混合提取DNA作為對照樣本。采集馬鈴薯塊莖和葉片組織用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymerseChainReactiom，PCR）方法檢測及生物學(xué)測定。5.3組培苗樣品制備將每瓶組培苗中的每個(gè)植株都進(jìn)行葉片組織采樣，每瓶組培苗所采樣品作為一個(gè)加樣樣品用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測及生物學(xué)測定。6檢測方法6.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymerseChainReactiom，PCR）檢測方法見附錄B。6.2形態(tài)學(xué)鑒定見附錄C。7結(jié)果判定PCR檢測：若待檢樣品在256bp對應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶，則判定樣品為陽性；若待檢樣品在256bp對應(yīng)位置沒有出現(xiàn)特異性條帶，則判定為陰性。顯微觀察：菌絲無色無隔，較寬，有分支；孢子囊透明、檸檬狀、薄壁、頂生乳狀突起；孢囊梗節(jié)狀，各節(jié)基部膨大而頂端尖細(xì)，頂端產(chǎn)生孢子囊，孢子囊一般能產(chǎn)生4～8個(gè)游動(dòng)孢子?？筛鶕?jù)以上特征判斷為馬鈴薯晚疫病菌。8結(jié)果記錄8.1結(jié)果記錄完整的記錄包括：樣品的來源、時(shí)間、地點(diǎn)、方法和結(jié)果等，并應(yīng)有經(jīng)手人和實(shí)驗(yàn)人員的簽字。PCR反應(yīng)檢測應(yīng)有瓊脂糖凝膠電泳反應(yīng)的原始數(shù)據(jù)，形態(tài)學(xué)測定應(yīng)有顯微鏡下病原菌形態(tài)特征。3馬鈴薯晚疫病相關(guān)資料A.1基本信息中文名稱：致病疫霉菌拉丁學(xué)名：Phytophthorainfestans(Mont.)deBary.俗名：馬鈴薯晚疫病菌分類地位：真菌界，鞭毛菌亞門，卵菌綱、霜霉目、腐霉科、疫霉屬真菌。A.2寄主范圍馬鈴薯晚疫病菌自然侵染僅限馬鈴薯。A.3病害癥狀馬鈴薯晚疫病田間癥狀：葉部：染病葉片初期出現(xiàn)灰白色或水漬狀淺褐色小斑點(diǎn)，逐漸擴(kuò)大，自葉尖或葉緣向葉中部發(fā)展，或從中部葉脈附近形成病斑。天氣潮濕時(shí)，病斑迅速擴(kuò)大成圓形或不規(guī)則形大斑。與葉面病斑相對的背面病斑呈褐色至黑色，周圍長出白色的霉?fàn)钗?，病斑邊緣常出現(xiàn)一圈淡綠色或暗黃色的暈圈。嚴(yán)重時(shí)病斑擴(kuò)展到主脈、葉柄和莖部，使葉片萎蔫下垂，整個(gè)植株的葉片和莖稈變黑。天氣干燥時(shí)，病斑干枯成褐色，不產(chǎn)生霉?fàn)钗?。莖部：莖部的病斑是在皮層形成長短不一的褐色條斑，開裂或不開裂，在潮濕條件下也會(huì)長出稀疏的白色霉層。莖部感染可從葉柄病斑擴(kuò)展至莖部，也可以從帶病種薯侵入幼苗后向上擴(kuò)展。塊莖：感染的塊莖初期在表面出現(xiàn)淡褐色或稍帶紫色的圓形或不規(guī)則褪色小斑，以后稍微凹陷。病斑向薯塊表層擴(kuò)展，有的擴(kuò)展到內(nèi)層，呈深度不同的褐色壞死組織。A.4分布地區(qū)世界各地馬鈴薯產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生。在中國，西南地區(qū)較為嚴(yán)重，東北、華北與西北多雨潮濕的年份為害較重。A.5傳播方式病原菌的孢子通過空氣或流水傳播侵染。4聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測B.1原理馬鈴薯晚疫病的致病菌基因組的某些關(guān)鍵區(qū)域在進(jìn)化上較為保守，可代表該病原菌特異性和唯一性，利用致病菌相應(yīng)的特異性引物，以基因組DNA為模板，在TaqDNA聚合酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果判斷該樣品中是否含有目的片段，從而達(dá)到鑒定馬鈴薯晚疫病菌的目的。B.2試劑以下所以試劑，除另有規(guī)定外，均使用分析純試劑；水為滅菌后的蒸餾水。B.2.1植物基因組DNA提取試劑盒。B.2.2TaqDNA聚合酶（5U/μL）。B.2.3dNTP混合物（各2.5mmol/L）。B.2.410×PCR緩沖液（含Mg2+）。B.2.5無水乙醇。B.2.650×TAE電泳緩沖液。B.2.71×TAE電泳緩沖液。量取50×TAE電泳緩沖液20mL，加水定容至1000mL。B.2.875%乙醇量取無水乙醇75mL，加水定容至100mL。B.2.9溴化乙錠溶液（10mg/mL）或GelRed核酸凝膠染料（溴化乙錠替代物）稱取溴化乙錠200mg，加水溶解，定容至20mL。GelRed核酸凝膠染料按照商品推薦稀釋濃度使用。B.2.101.0%瓊脂糖凝膠板稱取瓊脂糖1.0g，加入1×TAE電泳緩沖液定容至100mL，微波爐中加熱至瓊脂糖融化，待溶液冷卻50℃~60℃時(shí)，加溴化乙錠榕液或GelRed核酸凝膠染料5μL，搖勻，倒人制膠板中均勻鋪板，凝固后取下梳子，備用。B.2.11引物緩沖液用水將上下游引物分別配制成工作濃度為10ng/μL的溶液。B.2.122000bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物。B.2.136×電泳上樣緩沖液。B.3主要儀器B.3.1PCR儀。5B.3.2臺(tái)式高速離心機(jī)（離心力1180g～12470g）。B.3.3電泳儀、水平電泳槽。B.3.4凝膠成像儀。B.3.5移液器（0.1μL～2.5μL、0.5μL～10μB.3.6滅菌鍋等。B.4試驗(yàn)步驟B.4.1對照的設(shè)立試驗(yàn)分別設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照（即用等體積的水代替DNA作空白對照在檢測過程中要同待測樣品一同進(jìn)行如下操作。B.4.2樣品制備取馬鈴薯植株或塊莖組織0.1g，現(xiàn)用現(xiàn)取。B.4.3DNA提取B.4.3.1植物組織樣品DNA提取將樣品置于研缽中，加液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管。后續(xù)操作參見植物基因組DNA提取試劑盒推薦步驟進(jìn)行。B.4.3.2菌株樣品DNA提取將樣品置于研缽中，加液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管。后續(xù)操作參見植物基因組DNA提取試劑盒步驟進(jìn)行。B.4.4PCR擴(kuò)增B.4.4.1PCR擴(kuò)增引物上下游引物為馬鈴薯晚疫病菌的特異性引物。表B.1晚疫病致病菌的特異性引物序列引物名稱引物序列（5‘～3’）片段長度(bp)PIO3-3TAACCGACCAAGTAGTAAA256PIO3-4GAAAGGCATAGAAGGTAGAB.4.4.2PCR反應(yīng)體系按表B.2順序加入相應(yīng)試劑（縮略語見附錄D混勻，離心10s，使液體都沉降到PCR管底。表B.2.1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系6水B.4.4.3PCR反應(yīng)程序按表B.3列出的每對引物反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。表B.3每對特異性引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序B.5瓊脂糖凝膠電泳使用1.0%的瓊脂糖凝膠板，按比例混勻電泳上樣緩沖液和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物作為分子量標(biāo)記，進(jìn)行凝膠電泳。電泳結(jié)束后在凝膠成像儀的紫外透射光下觀察，凝膠上是否出現(xiàn)預(yù)期的特異性DNA條帶，并拍攝記錄。B.6結(jié)果B.6.1試驗(yàn)成立的條件陽性對照檢測到預(yù)期大小的特異性擴(kuò)增條帶，陰性對照和空白對照均沒有檢測到預(yù)期大小的目的條帶。若陰性對照、陽性對照和空白對照同時(shí)成立時(shí)，則表明試驗(yàn)有效，否則試驗(yàn)無效。B.6.2陽性判定待檢樣品若在256bp對應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶，則判定樣品為陽性。B.6.3陰性判定待檢樣品若在256bp對應(yīng)位置未出現(xiàn)特異性條帶，則判定樣品為陰性。7（資料性）形態(tài)學(xué)鑒定C.1原理馬鈴薯晚疫病的病原為致病疫霉菌（Phhthorainfestans（Monti）DeBary）。菌絲無色無隔，較寬，有分支；孢子囊透明、檸檬狀、薄壁、大小為21～38μm×12～23μm、頂生乳狀突起；孢囊梗節(jié)狀，各節(jié)基部膨大而頂端尖細(xì)，頂端產(chǎn)生孢子囊，孢子囊一般能產(chǎn)生4～8個(gè)游動(dòng)孢子?？筛鶕?jù)以上特征判斷馬鈴薯晚疫病菌。C.2試劑以下所以試劑，除另有規(guī)定外，均使用分析純試劑；水為符合GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水。次氯酸鈉、鹽酸、75%酒精、無菌水。C.3儀器培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、無菌操作臺(tái)、載玻片和蓋玻片、培養(yǎng)皿、酒精燈等。C.4方法若樣品發(fā)病部位已有霉層存在，可挑取其霉層直接鏡檢，若無霉層，則按以下步驟進(jìn)行。C.4.1葉片將葉片用無菌水清洗晾干后，放入18℃培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)1~4d后，挑取霉層直接鏡檢。C.4.2塊莖將塊莖用自來水清洗，再用1%次氯酸鈉溶液表面消毒3~5min，用無菌水清洗3次，晾干。將塊莖放入18℃培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)3~5d后，挑取霉層直接鏡檢。C.5結(jié)果判定將制好的玻片放在生物顯微鏡下觀察，并記錄病原菌形態(tài)特征。如果鏡下的菌絲