3.2基因工程的基本操作程序的課件高二下學期生物人教版（2019）選擇性必修3

3.2基因工程的基本操作程序?qū)W習目標與任務(wù)1.闡述基因表達載體構(gòu)建的意義；2.說出基因表達載體的結(jié)構(gòu)組成以及各元件的作用；3.辨析啟動子和起始密碼子、終止子和終止密碼子；4.闡述基因表達載體的構(gòu)建過程。問題探討蘇云金桿菌培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉需要哪幾步？Bt基因表達蘇云金伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白）攝食害蟲死亡蘇云金桿菌與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細胞抗蟲棉提取表達Bt基因?qū)隑t基因重組DNA分子培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程問題探討1.基因:具有遺傳效應(yīng)的DNA片段2.目的基因定義：主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因,也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。如與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因第一步、目的基因的篩選和獲取那么如何篩選合適的目的基因呢？目的基因的篩選和獲取棉花植株(有抗蟲特性)轉(zhuǎn)入Bt抗蟲蛋白基因3.目的基因的篩選目的基因的篩選和獲取3.目的基因的篩選明確了目的基因后，該怎樣獲取它呢？多聚酶鏈式反應(yīng)（簡稱PCR），在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。可以獲得大量的目的基因。PCR擴增儀目的基因的篩選和獲取3.利用PCR獲取和擴增目的基因復習：DNA在細胞內(nèi)復制所需要的條件條件名稱模板雙鏈DNA分子原料4種脫氧核苷酸能量ATP酶DNA解旋酶DNA聚合酶PCR的原理——體外DNA復制多次重復PCR所需要的條件條件名稱模板雙鏈DNA分子原料4種脫氧核苷酸能量加熱酶DNA聚合酶引物2種?熱穩(wěn)定的指數(shù)形式2n

擴增（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）

1個DNA分子進行PCR擴增,循環(huán)4次，理論上至少需要（24-1）×2=30個引物2×（2n-1）PCR技術(shù)擴增目的基因過程：PCR技術(shù)擴增目的基因過程：PCR技術(shù)與細胞內(nèi)DNA復制的比較比較項目細胞內(nèi)DNA復制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋場所主要在細胞核內(nèi)細胞外(主要在PCR擴增儀內(nèi))酶解旋酶、DNA聚合酶等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）溫度細胞內(nèi)溫和條件控制溫度，需在不同溫度下進行結(jié)果合成整個DNA分子擴增特定的DNA片段或基因聯(lián)系①模板:均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板②原料:均為四種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶從引物開始進行互補鏈的合成歸納比較獲取了足夠量的Bt基因后，下一步就是要讓基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；同時，使Bt基因能夠表達和發(fā)揮作用這就是需要構(gòu)建基因表達載體。這也是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的核心工作那么基因表達載體是由哪些部分組成的呢？第二步：基因表達載體的構(gòu)建不能。游離的DNA進入受體細胞，一般會直接被分解，即使可以轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂而進行復制，導致子代細胞中不再含有目的基因。

獲得了足量的Bt基因后，是否能直接將Bt基因?qū)朊藁毎?？（核心工作）思考：各個元件有什么作用？

因此，獲取Bt基因后，還需要借助載體將其導入棉花細胞，才能使棉花植株獲得抗蟲特性。第二步：基因表達載體的構(gòu)建目的基因：能控制表達所需要的特殊性狀啟動子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。復制原點：DNA復制的起始位點終止子：位置：基因的下游功能：終止轉(zhuǎn)錄標記基因：便于重組DNA分子的篩選。第二步：基因表達載體的構(gòu)建第二步：基因表達載體的構(gòu)建

如何構(gòu)建抗蟲棉的基因表達載體？①

用一定的限制酶切割載體，使其出現(xiàn)一個切口。②

用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有Bt基因的DNA片段。③

將切下的Bt基因片段拼接到載體的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子。第二步：基因表達載體的構(gòu)建同一限制酶切割獲得的目的基因和載體混合后加DNA連接酶會出現(xiàn)的連接方式有（僅考慮兩兩連接）切割質(zhì)粒和含目的基因的DNA片段的限制酶一般是同一種酶，也可以是不同限制酶，只要獲得能互補的末端即可。但有時可用兩種限制酶同時切割質(zhì)粒和含目的基因的DNA片段，這樣可保證目的基因和質(zhì)粒的定向連接，防止目的基因和質(zhì)粒的自我環(huán)化。第三步、將目的基因?qū)胧荏w細胞1.將目的基因?qū)胫参锛毎?1)花粉管通道法①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中②在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程②農(nóng)桿菌的特點：農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上Ti質(zhì)粒T-DNA目的基因植物細胞表現(xiàn)出新性狀的植株將目的基因插入染色體DNA中含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌構(gòu)建表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導入植物細胞③農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法過程第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞2.將目的基因?qū)雱游锛毎?1)方法：顯微注射技術(shù)(2)受體細胞：受精卵3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎Ｒ源竽c桿菌作為受體細胞，一般先用Ca2＋處理大腸桿菌細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，然后再將重組的基因表達載體導入其中第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞種類項目植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉(zhuǎn)化過程目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞DNA中→表達目的基因表達載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→表達載體與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞第四步、目的基因的檢測與鑒定①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)——“抗原—抗體雜交技術(shù)”2.個體生物學水平鑒定1.分子水平檢測抗性檢測：功能活性比較：PCR技術(shù)

或分子雜交技術(shù)抗蟲、抗病接種實驗；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性比較——檢測是否具有抗性以及抗性強度等方法如：胰島素注射到糖尿病模型小鼠①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因方法1：PCR擴增轉(zhuǎn)基因生物提取DNADNA作為模板PCR操作M：marker；1-陽性質(zhì)粒；2：原始品系；3-9轉(zhuǎn)Bt品系；轉(zhuǎn)Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果DNA半保留復制原理：目的基因的檢測與鑒定是否擴增出目的基因以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）電泳操作

引物如何設(shè)定？原因：帶標記的基因探針，與目的基因DNA單鏈在一定條件下互補配對，結(jié)合成雙鏈，從而出現(xiàn)雜交帶。目的基因的檢測與鑒定①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因酶切轉(zhuǎn)膜標記的DNA/RNA探針DNA分子雜交（Southern-blot)流程圖以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）方法2：

DNA分子雜交技術(shù)堿基互補配對原理：②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法：PCR擴增或分子雜交技術(shù)轉(zhuǎn)基因生物提取RNARNA作為模板PCR操作電泳是否擴增出目的基因逆轉(zhuǎn)錄cDNA目的基因的檢測與鑒定提取RNA轉(zhuǎn)膜標記的DNA/RNA探針RNARNA分子雜交(NorthernBlot)流程圖以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法：

抗原與抗體的特異性結(jié)合原理：蘇云金芽孢桿菌提取Bt抗蟲蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交轉(zhuǎn)基因生物目的基因的檢測與鑒定放射性檢測

（雜交帶）以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）過程：提取轉(zhuǎn)基因植物的蛋白質(zhì)+相應(yīng)抗體→是否出現(xiàn)雜交帶抗原—抗體雜交技術(shù)2.個體生物學水平鑒定沒有抗蟲基因的棉花植株有抗蟲基因的棉花植株棉鈴蟲沒有死亡棉鈴蟲死亡接種棉鈴蟲目的基因的檢測與鑒定以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）轉(zhuǎn)Bt基因非轉(zhuǎn)基因1、下列關(guān)于基因工程的敘述，正確的是（）A.基因工程是細胞水平上的生物工程B.基因工程經(jīng)常以抗菌素抗性基因為目的基因C.基因工程成功的原因之一是所有生物共用一套遺傳密碼D.基因工程的產(chǎn)物對人類都是有益的練習C練習2、以下為逆轉(zhuǎn)錄過程和PCR擴增過程示意圖。據(jù)圖分析，下列說法錯誤的是(

)A.催化①過程的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶B.④過程發(fā)生的變化是引物與單鏈DNA結(jié)合C.催化②⑤過程的酶都是DNA聚合酶D.如果RNA單鏈中A與U之和占該鏈堿基含量的40%，則一個雙鏈DNA中，A與U之和也占該DNA堿基含量的40%D3、科學家通過利用PCR定點突變技術(shù)改造Rubisco酶基因，提高了光合作用過程中Rubisco酶對CO2的親和力，從而顯著提高了植物的光合作用速率，請回答下列問題：（1）PCR過程所依據(jù)的原理是_______________，該過程需要加入的酶是_______________________________。利用PCR技術(shù)擴增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成_______________。（2）該技術(shù)不直接改造Rubisco酶，而通過對Rubisco酶基因進行改造，從而實現(xiàn)對Rubisco酶的改造，其原因是______________________________________。和傳統(tǒng)基因工程技術(shù)相比較，定點突變技術(shù)最突出的優(yōu)點是______________________________