植物組織培養(yǎng)設(shè)備及條件

植物組織培養(yǎng)設(shè)備及條件

組織培養(yǎng)實驗室布局得總體要求

便于隔離便于操作便于滅菌便于觀察一、實驗室組成基本實驗室輔助實驗室實驗室組成準備室緩沖室無菌操作室培養(yǎng)室細胞生物學實驗室溫室生化分析實驗室水槽實驗臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱架電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準備室緩沖室無菌室培養(yǎng)室組織培養(yǎng)準備實驗室準備室緩沖室無菌室無菌室10大家應該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流培養(yǎng)室培養(yǎng)架培養(yǎng)間二、儀器設(shè)備1)、基本儀器設(shè)備

冰箱、電(磁)爐、酸度計、純水器、天平、移液器、解剖鏡、光照培養(yǎng)箱、搖床、生化培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器等。冰箱酸度計電爐天平純水器培養(yǎng)基分裝器攪拌器搖床體式顯微鏡倒置顯微鏡冷光源電磁攪拌器搖床2)、滅菌設(shè)備蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。蒸汽壓力滅菌鍋高壓滅菌器干熱消毒柜75%酒精噴霧器噴霧消毒器3)、無菌操作設(shè)備

超凈工作臺二、設(shè)備、儀器超凈工作臺(一)設(shè)備1、紫外線滅菌燈2、日光燈3、工作臺4、凳子5、擱物架6、窗7、推拉門8、緩沖間無菌接種箱4、細胞培養(yǎng)設(shè)備

搖床培養(yǎng)架HZC-250恒溫振蕩培養(yǎng)箱150C

250D

光照培養(yǎng)箱

光照培養(yǎng)箱烘箱5、細胞學鑒定設(shè)備光學顯微鏡、體視顯微鏡、倒置顯微鏡倒置顯微鏡光學顯微鏡電子天平（0.0001g，0.001g）

酸度計1、玻璃器皿三、培養(yǎng)器皿及實驗用具培養(yǎng)皿三角瓶培養(yǎng)瓶2、金屬材質(zhì)用具鑷子解剖刀接種針(二)各類器皿

1、器皿得類型(1)培養(yǎng)器皿三角瓶、培養(yǎng)瓶、圓形培養(yǎng)瓶、試管、L形管和T形管(2)分注器(3)刻度移液管(4)微量移液器(5)細菌過濾器(三)器械用具打孔器鑷子解剖刀接種針剪刀電熱滅菌器

四、洗滌技術(shù)1、玻璃器皿洗滌已用過的玻璃器皿1%稀HCl浸漬12h洗衣粉洗滌清水沖洗晾干備用新購置玻璃器皿2、塑料用品洗滌新的塑料器皿打開即用已用過的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水沖洗2%—5%鹽酸浸泡30min清水沖洗蒸餾水沖洗晾干備用3、金屬用品洗滌熱洗衣粉水洗凈沖洗擦干五、滅菌技術(shù)物理方法:干熱、濕熱、射線處理、過濾除菌等化學方法:消毒劑、抗菌素滅菌1、滅菌方法2、滅菌(1)培養(yǎng)基滅菌:高溫高壓濕熱滅菌法壓力在0、1M—0、2MPa

溫度在121℃

滅菌10—30min(2)玻璃器皿滅菌:蒸汽高壓消毒滅菌干熱消毒滅菌飽和蒸汽壓力與其對應得溫度飽和蒸汽壓力溫度(℃)飽和蒸汽壓力溫度(℃)kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20、00、1410、2810、4420、5630、7030、8440、98402468101214100103、6106、9109、8112、6115、2117、6119、91、0551、1251、2661、4061、5431、6811516182022243050121、0122、0124、1126、0127、8129、6134、5147、6(3)塑料器皿滅菌:多采用高壓蒸汽消毒滅菌(4)金屬用具滅菌:灼燒滅菌浸入95%酒精,后置于酒精火焰上灼燒,冷卻后使用(5)接種室滅菌空氣消毒滅菌接種室超凈工作臺紫外燈照射70%—75%得酒精擦洗培養(yǎng)材料得接種紫外燈照射(6)外植體滅菌流水沖洗10—20min或更長時間70%—75%酒精中浸泡30s0、1%—0、2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸餾水沖洗4—5次在10%得次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡30min左右備用常用消毒劑消毒滅菌比較表消毒劑使用濃度(%)去除難易消毒時間(min)效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過氧化氫升汞酒精抗生素硝酸銀9~102飽和溶液1~210~120、1~170~754~5(mg/L1易易易易最易較難易中較難5~305~305~302~105~152~100、2~230~605~30很好很好很好很好好最好好較好好消毒,更換實驗服、帽子與鞋子,進入接種室。打開超凈工作臺和無菌操作室得紫外燈,照射40min左右,后關(guān)閉。開啟過濾風機,使無菌風吹拂工作臺面和四周得臺壁。用70%—75%得酒精擦拭工作臺和雙手。(7)接種準備六、無菌操作實驗員消毒實驗室、無菌臺滅菌實驗器材得滅菌無菌接種消毒實驗臺衛(wèi)生培養(yǎng)室培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)就是在嚴格無菌得條件下進行得,要做到無菌得條件,需要一定得設(shè)備、器材和用具,同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。準備室:器具得洗滌、干燥、保存、滅菌,各種藥品得儲備、稱量、溶解、配制、培養(yǎng)基分裝等,設(shè)備:藥品柜、防塵廚、冰箱、天平、純水儀、酸度計、操作臺、滅菌鍋、烘箱。實驗室設(shè)計原則:保證無菌操作,達到工作方便,防止污染?；瘜W室/準備室、接種室、培養(yǎng)室。小結(jié)接種室:植物材料得消毒、接種、培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移、試管苗繼代、原生質(zhì)體制備及其她需要進行得無菌操作。設(shè)備:紫外光源、超凈工作臺、消毒器、酒精燈、接種器械(鑷子、剪刀、解剖刀、接種針)。清潔和消毒,減少與外界空氣對流,穿實驗服及換鞋以減少帶入雜菌。培養(yǎng)室:墻壁要求絕熱防火得性能,培養(yǎng)架由金屬制成,底層離地高約10cm,層間隔40cm,總高1、7m左右,長度根據(jù)日光燈得長度而設(shè)計,寬度為60cm。第二節(jié)植物組織培養(yǎng)所需得環(huán)境條件及營養(yǎng)成分一、環(huán)境條件

與自然條件一樣,組織培養(yǎng)中得外植體得生長要受到溫度、光照、濕度等各種物理條件,不同培養(yǎng)基組成、pH值、滲透壓等各種化學條件,以及外植體部位、大小、細胞密度等各種生物條件等環(huán)境條件得影響。如何根據(jù)需要來控制培養(yǎng)條件就是組織培養(yǎng)中得一個重要問題。溫度光照濕度氣體滲透壓pH值一般最適溫度在25±2℃之間環(huán)境條件最常用的是光照16h，黑暗8h一般情況下，培養(yǎng)器內(nèi)相對濕度應達100%，培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的相對濕度在70%—80%

氧氣是愈傷組織生長所必需的調(diào)節(jié)滲透壓常常從糖入手

培養(yǎng)基的pH值大多在5.0—6.5，5.8溫度在20-27℃左右,空調(diào)控溫,濕度恒定,相對濕度在70-80%,光照由定時開關(guān)控制,每天光照10-16h左右,不同植物決定光照時間,培養(yǎng)室可采用太陽光為能源,易成活,陰雨天用室內(nèi)燈光補光。二、營養(yǎng)成分

植物體內(nèi)至少含有幾十種化學元素,其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定得生理作用:a、組成各種化合物,參與機體得建造,成為結(jié)構(gòu)物質(zhì);b、構(gòu)成一些特殊得生理活性物質(zhì),參與活躍得新陳代謝;c、元素之間相互協(xié)調(diào),以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡點等化學方面得作用;d、發(fā)育方面,特定得元素影響植物得形態(tài)發(fā)生和組織、器官建成。Arnon和Stout(1939)提出得確定植物必需營養(yǎng)元素得3個標準:A、缺乏該元素,植物生育發(fā)生障礙,不能完成其生活史;B、缺乏該元素,就表現(xiàn)為專一得病癥,且這種缺素癥可以用補充該元素來預防和恢復;C、該元素在植物營養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接得效果,而不就是由于土壤得物理、化學、微生物條件得變化而產(chǎn)生得間接效果。

國內(nèi)外公認得高等植物所必需得營養(yǎng)元素有16(17)種:

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、(Ni)在植物中含量差別很大,同一元素在植物不同時期、不同條件下含量也不同。根據(jù)植物體內(nèi)含量多少,可把這些元素分為※大量營養(yǎng)元素:占干物質(zhì)重量得0、1%以上;C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9種※微量營養(yǎng)元素:占干物質(zhì)重量得0、1%以下,有得只含0、1mg/kg,Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種按照國際植物生理協(xié)會得建議:

所需濃度>0、5mmol/L得元素為大量元素所需濃度<0、5mmol/L得元素為微量元素1、大量元素N就是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等得組成成分,在植物生命活動中占有重要得位置。

P就是磷脂得主要成分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4

、NaH2PO4等。

K對碳水化合物合成,轉(zhuǎn)移,以及氮素代謝等有密切關(guān)系。Mg、S、Ca就是葉綠素得組成成分,又就是激酶得活化劑,對核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用;S就是含S氨基酸得蛋白質(zhì)得組成成分。Ca就是構(gòu)成細胞壁得成分,對細胞分裂,穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用,此外,Ca及鈣調(diào)素在細胞信號轉(zhuǎn)導中起重要作用。2、微量元素

在微量元素中,鐵得使用最大:◆一些氧化酶得組成成分◆葉綠素形成得必要條件◆使用乙二胺四乙酸鐵(EDTA-Fe)鰲合物防止鐵得沉淀

硼與蛋白質(zhì)合成、糖類運輸有著密切得關(guān)系銅就是某些氧化酶得成分,能夠促進離體根得生長錳參與植物得光合、呼吸代謝鉬參與氮素得代謝氯就是光合作用水光解得活化劑微量元素得主要作用就是作為酶得輔助因子或激活劑參與代謝得調(diào)節(jié)。

組織培養(yǎng)得條件營養(yǎng)條件(培養(yǎng)基),組織培養(yǎng)得重要基質(zhì),不同植物得組織對營養(yǎng)有不同得要求,合適培養(yǎng)基才能成功。MS培養(yǎng)基:1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞設(shè)計,無機鹽濃度較高,硝酸鹽含量高,用于植物器官、花藥、細胞得組培,有些培養(yǎng)基就是由她演變而來。B5培養(yǎng)基:1968年由Galmborg為培養(yǎng)大豆根細胞設(shè)計,含有較低得銨鹽,適合雙子葉植物、木本植物White培養(yǎng)基:1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖設(shè)計,MgSO4、硼鹽濃度高,無機鹽濃度低,適于生根培養(yǎng)。N6培養(yǎng)基:1974年由朱至清為禾谷類花藥培養(yǎng)而設(shè)計,KNO3和(NH4)2SO4濃度高,適于花藥培養(yǎng)。KM-8P培養(yǎng)基:1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計,有機成分復雜,包括了所有得單糖及維生素,適于原生質(zhì)體融合培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分主要就是水、無機鹽、有機物、天然復合物、培養(yǎng)基中得凝膠無機鹽:大量元素(大于0、5mmol/L得元素)、微量元素。N:就是蛋白、維生素、核酸、磷脂等得組成成分,培養(yǎng)基中有NO3--、NH4+供應形式,如KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4等。P:磷脂、ATP等得組成成分,常用得有KH2PO4、NaH2PO4等K:與糖類合成、蛋白代謝有關(guān),常以KCL、KNO3在培養(yǎng)基中提供Mg、S、Ca:就是葉綠素、酶、細胞壁得組成成分,MgSO4·7H2O、CaCL2·7H2O微量元素:小于0、5mmol/L,Fe、Zn、B、Mn、Cu、Mo、Co等;FeSO4·7H2O與Na2-EDTA配成鐵鹽溶液。碳水化合物:常用得就是蔗糖、葡萄糖,常用濃度為3%。維生素:以輔酶得形式參與多種代謝,對生長、分化有促進作用,VB1(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、VB12、VPP(煙酸)、VC(抗壞血酸)、生物素、葉酸。肌醇:環(huán)己六醇,參與細胞壁、細胞膜構(gòu)建,100mg/L氨基酸---有機氮源,細胞直接吸收,甘氨酸、天冬氨酸、谷酰胺、水解乳蛋白(氨基酸混合物)等,10-