第三代基因測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介

第三代基因測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介（原創(chuàng)2022-03-10CMDE中國器審）

一、前言

當(dāng)前，高通量測(cè)序技術(shù)（也稱為二代測(cè)序技術(shù)）迅猛發(fā)展，已逐步廣泛應(yīng)用于基因檢測(cè)的多個(gè)方面的臨床服務(wù)，其對(duì)于單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）和小于50bp的插入或缺失（Insertion-Deletion，InDel）變異檢測(cè)相對(duì)比較準(zhǔn)確，但是大的結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)卻非常困難。同時(shí)，另一類以不經(jīng)過擴(kuò)增的單分子測(cè)序和長讀長為標(biāo)志的DNA測(cè)序技術(shù)也隨即問世，這類測(cè)序技術(shù)被稱為第三代測(cè)序技術(shù)。因其測(cè)序時(shí)DNA分子無需PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測(cè)序，也稱為單分子測(cè)序技術(shù)。

二、技術(shù)平臺(tái)

Helicos公司于2008年推出了世界上第一款單分子測(cè)序平臺(tái)HeliScope，但其讀長較短（35bp），系統(tǒng)整體測(cè)序錯(cuò)誤率較高（5%）。之后出現(xiàn)了單分子的長讀長測(cè)序技術(shù)，目前長讀長測(cè)序是指單分子測(cè)序長度不少于KB級(jí)別測(cè)序讀長的技術(shù)平臺(tái)。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的長讀長測(cè)序平臺(tái)主要有OxfordNanoporeTechnologies的納米孔測(cè)序平臺(tái)（Nanopore）和PacBio的單分子實(shí)時(shí)（SMRT）測(cè)序平臺(tái)。

（一）單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（SMRT）

美國太平洋生物公司（PacificBiosciences，PacBio）開發(fā)的三代測(cè)序技術(shù)稱為SMRT測(cè)序（SingleMoleculeReal-TimeSequencing），該技術(shù)建立在兩項(xiàng)重要的發(fā)明基礎(chǔ)之上，從而攻克了測(cè)序領(lǐng)域測(cè)序讀長短的重大難題。第一，零模波導(dǎo)孔技術(shù)（Zero-modeWaveguides，ZMWs）使激發(fā)光被限定在單分子納米孔底部一定范圍內(nèi)，過濾了背景噪音。第二，熒光基團(tuán)結(jié)合在核苷酸的磷酸基團(tuán)上，幫助DNA聚合酶完成一個(gè)全天然的DNA鏈合成過程。

基于該原理的具體產(chǎn)品有PacBioSequel測(cè)序儀、PacBioSequelII測(cè)序儀。PacBioSequel測(cè)序儀是首個(gè)商業(yè)化應(yīng)用的第三代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)，其打破傳統(tǒng)短讀長測(cè)序諸多技術(shù)瓶頸。PacBioSequelII測(cè)序儀是PacBioSequel的升級(jí)款，可提供CLRLibrary和CCSlibrary（HIFI）兩種測(cè)序模式。測(cè)序芯片上的導(dǎo)孔（ZMW）由100萬個(gè)提升至800萬個(gè)，理論通量提升8倍。CCSreads單堿基準(zhǔn)確性有了極大提升，同一片段測(cè)序4次后，單一read的準(zhǔn)確性可達(dá)99%。

（二）納米孔單分子測(cè)序技術(shù)（Nanopore）

納米孔單分子測(cè)序是基于電信號(hào)測(cè)序的技術(shù)，原理是通過電場(chǎng)力驅(qū)動(dòng)單鏈核酸分子穿過納米尺寸的蛋白孔道，由于不同的堿基通過納米孔道時(shí)產(chǎn)生了不同阻斷程度和阻斷時(shí)間的電流信號(hào)，由此可根據(jù)電流信號(hào)識(shí)別每條核酸分子上的堿基信息，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)單鏈核酸分子的測(cè)序。由于其原理與其他平臺(tái)有較大差異，亦有被稱為第3.5代或四代測(cè)序技術(shù)。

Nanopore測(cè)序儀的具體產(chǎn)品種類很多，均為基于Nanopore芯片來搭建的平臺(tái)，大到由多個(gè)芯片陣列組成的PromehION、GridION系列測(cè)序儀，小到可以連接手機(jī)的TypeC、電腦USB的MnION系列便攜式測(cè)序儀。其中PromethION是一款高通量、高樣本數(shù)的臺(tái)式系統(tǒng)，基于模塊化設(shè)計(jì)（多達(dá)48個(gè)測(cè)序芯片，各有多達(dá)3,000個(gè)納米孔通道，總計(jì)達(dá)144,000個(gè)），測(cè)序芯片既可單獨(dú)也可同時(shí)運(yùn)行，尤其適合于大樣本量、具有龐大數(shù)據(jù)量的項(xiàng)目。

（三）第三代測(cè)序平臺(tái)特點(diǎn)比較

這兩類第三代測(cè)序平臺(tái)均具有長讀長、無GC偏好性及可直接檢測(cè)甲基化修飾等優(yōu)點(diǎn)。相較而言，納米孔單分子測(cè)序技術(shù)讀長更長，可達(dá)到Mb級(jí)別；MnION測(cè)序儀如手機(jī)大小，較為便攜；單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（SMRT）平臺(tái)，無錯(cuò)誤偏好，可通過增加數(shù)據(jù)糾錯(cuò)以提高測(cè)序準(zhǔn)確性。具體的比較如下表所示：

三、應(yīng)用方向的探索

目前長讀長測(cè)序的三代測(cè)序平臺(tái)，已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜動(dòng)植物基因組、微生物基因組、全長轉(zhuǎn)錄組、微生物群體研究及人類基因組變異檢測(cè)等領(lǐng)域的科研項(xiàng)目中，以解決這些科研領(lǐng)域檢測(cè)技術(shù)瓶頸的問題。

在疾病檢測(cè)方面，三代測(cè)序基于其單分子檢測(cè)與長讀長測(cè)序的特點(diǎn)，在基因組結(jié)構(gòu)變異、短串聯(lián)重復(fù)/微衛(wèi)星、單體型分析、真假基因區(qū)分、甲基化檢測(cè)等相關(guān)的檢測(cè)中具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。例如，目前許多基于高通量測(cè)序技術(shù)的基因診斷產(chǎn)品已基本成熟；但因二代測(cè)序技術(shù)存在讀長短、對(duì)基因組覆蓋不均勻等局限，對(duì)SNVs和InDels檢測(cè)尚可，對(duì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)無能為力。第三代測(cè)序技術(shù)用于遺傳病及腫瘤基因的檢測(cè)，憑借長讀長、無PCR、無GC偏好性等優(yōu)勢(shì)，進(jìn)行長片段序列測(cè)定，可以檢測(cè)缺失、重復(fù)、倒位、易位等結(jié)構(gòu)變異（＞50bp），可進(jìn)一步提高疾病的檢出率，彌補(bǔ)二代測(cè)序技術(shù)對(duì)結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)的不足。

四、小結(jié)

長讀長測(cè)序的三代測(cè)序平臺(tái)，較二代測(cè)序?qū)⒆x長提升了萬倍，但由于錯(cuò)誤率、成本及樣本要求都較高，算法、軟件、數(shù)據(jù)庫等配套的技術(shù)需要研發(fā)等問題，目前尚處于科研項(xiàng)目應(yīng)用階段。針對(duì)這些問題，各技術(shù)平臺(tái)也不斷優(yōu)化技術(shù)以解決問題，例如PacBio測(cè)序儀的HIFI技術(shù)模式可有效提高數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，納米孔測(cè)序平臺(tái)也通過對(duì)PromethION進(jìn)行設(shè)備上的升級(jí)以提高準(zhǔn)確度。

隨著三代測(cè)序平臺(tái)的不斷發(fā)展，其未來在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化應(yīng)用，可以有效彌補(bǔ)目前基于結(jié)構(gòu)變異、短串聯(lián)重復(fù)/微衛(wèi)星、單體型分析等變異的基因相關(guān)疾病的檢測(cè)手段的空白。

參考文獻(xiàn)：

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