JJF(魯) 138-2022 熒光定量PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范

JJF(魯)138-JJF（魯）138—2022JJF（魯）138—2022 （II） （1） （1） （1） （3） （4） （5） （5） （5） （6） （6） （6） （13） （13） （14） （18） （22）JJF（魯）138—2022《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》共同構(gòu)成支撐校JJF（魯）138—20221實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范本規(guī)范適用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的校準(zhǔn)，其他類型PCR儀相同原理部分可參照本3.1PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）polymerasec3.2PCR儀（聚合酶鏈反應(yīng)分析儀）polymerasechainreactionanalyze對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物量進(jìn)行定量分析，并通過對(duì)熒光的采集3.4溫度示值誤差temperatureindJJF（魯）138—202223.5溫度均勻度temperatur3.6溫度波動(dòng)度temperature在被檢設(shè)備穩(wěn)定的狀態(tài)下，在規(guī)定的時(shí)間間隔3.7溫度最大過沖量temperaturemaxi3.8平均升溫速率mean3.11熒光強(qiáng)度精密度precisionoffluorescenceintensity對(duì)多個(gè)檢測(cè)孔在同一熒光條件下重復(fù)熒光強(qiáng)度檢測(cè)擴(kuò)增過程前3～15個(gè)循環(huán)的熒光值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值，當(dāng)熒光值超過閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)均熱塊不同測(cè)量孔在同一熒光條件下，閾值3.14熔解溫度melttemperature,TmPCR過程中均熱塊測(cè)量孔的熒光強(qiáng)度（縱坐標(biāo)）與溫度（橫坐標(biāo)）JJF（魯）138—20223.18通道峰值強(qiáng)度一致性channelpeak3.19線性靈敏系數(shù)linearsensitivityfactor,LSF注：理想的熒光定量PCR儀，線性靈敏度應(yīng)該是1.00。LSF在0.80和1.20之間，溶解曲線呈現(xiàn)基本線性；LSF<0.80：在高熒光強(qiáng)度下線性降低，注意信號(hào)飽和；LSF>1.20：在低熒光強(qiáng)度下線性降低，注意最小信號(hào)檢測(cè)和靈敏度。3.20熔解溫度比ratioofmelttemperature,RTm注：RTm在0.80到1.20之間：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異僅基于控溫模塊特性，熔解峰漂移與溫度不均勻直接相關(guān)；RTm>1.20：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異是由控溫模塊、光學(xué)和光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)不準(zhǔn)確共同導(dǎo)致的；RTm<0.80：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異是與光學(xué)、光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)及分析軟件直接相關(guān)。3.21樣本示值誤差errorofsample’sindication實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，全稱為實(shí)時(shí)熒光定量聚對(duì)擴(kuò)增基因進(jìn)行定量分析的儀器。標(biāo)記有熒光染料性、低溫復(fù)性和適溫延伸的熱循環(huán)后，與模板基因于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下熒光染料發(fā)出熒光4基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)與之對(duì)應(yīng)的隨擴(kuò)增而變實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀均熱塊一般有32孔板、48孔板、96孔板和384孔板等幾種類型，其中96孔板應(yīng)用最為廣泛。其主要由軟件控制系統(tǒng)、溫度控制模塊、熒光檢測(cè)模塊、均熱塊檢測(cè)孔組成，詳細(xì)結(jié)構(gòu)如圖1所示。應(yīng)用于新冠病毒核酸快速檢測(cè)的儀器檢測(cè)通量通常不大于16。1—光源2—濾光片3—準(zhǔn)直器4—光導(dǎo)束5—樣品6—均熱塊檢測(cè)孔7—溫度傳感器8—加熱制冷供電9—光開關(guān)陣列10—光敏器11—電控裝置12—通訊接口13—計(jì)算機(jī)5計(jì)量特性實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀計(jì)量性能指標(biāo)如表1所示。備注1溫度示值誤差溫度項(xiàng)目2溫度均勻度3溫度波動(dòng)度4/56JJF（魯）138—20225續(xù)表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀計(jì)量性能指標(biāo)7閾值循環(huán)數(shù)示值誤差光學(xué)系統(tǒng)物理項(xiàng)目8閾值循環(huán)數(shù)均勻度9閾值循環(huán)數(shù)精密度通道峰值強(qiáng)度一致性1±0.2線性靈敏系數(shù)1±0.2熔解溫度飄移熔解溫度比1±0.2樣本示值誤差光學(xué)系統(tǒng)生物化學(xué)項(xiàng)目樣本線性相關(guān)系數(shù)≥0.980注：以上所有指標(biāo)不適用于合格性判別，僅供參考。6項(xiàng)目時(shí)，可根據(jù)客戶要求與實(shí)際情況選擇光學(xué)系統(tǒng)物理方法中的一種方法進(jìn)行校準(zhǔn)。對(duì)校準(zhǔn)結(jié)果產(chǎn)生疑義或仲裁時(shí)，7.2校準(zhǔn)方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀均熱塊孔數(shù)少于96孔時(shí)，測(cè)量點(diǎn)為12個(gè)，布點(diǎn)圖(以48孔為例)如圖2所示，均熱塊孔數(shù)為其他數(shù)量時(shí)，可參照?qǐng)D2布點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀均熱塊孔數(shù)等于或大于96點(diǎn)時(shí)，測(cè)量點(diǎn)為15個(gè)，布點(diǎn)圖如圖3所示，均熱塊孔數(shù)為其他數(shù)量時(shí)，可參照?qǐng)D3布點(diǎn)。也可以根據(jù)被測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀說明書或客戶要求，增加或減校準(zhǔn)前將實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀預(yù)熱30min。將儀器及光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器各部件連接完好，在光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器下部的溫度量導(dǎo)熱油，以確保其與均熱塊測(cè)量孔接觸良好。將光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器溫度項(xiàng)目校準(zhǔn)時(shí)，典型的校準(zhǔn)設(shè)置程序如表2步驟4～11所示(其中平均升、降溫速率的測(cè)量數(shù)據(jù)分別來源于步驟4～5和步驟5～6;溫度示值誤差的測(cè)量數(shù)據(jù)來源于步驟5~11;溫度均勻度、溫度波動(dòng)度、溫度最大過沖量的測(cè)量數(shù)據(jù)來源于步驟5～10)。光學(xué)系統(tǒng)采用物理校準(zhǔn)方法時(shí)，典型的校準(zhǔn)設(shè)置程序如表2步驟12～16所示(步驟12和步驟13之間設(shè)定程序循環(huán)32次)。光學(xué)系統(tǒng)采用生物化學(xué)校準(zhǔn)方法時(shí)，典型的校準(zhǔn)設(shè)置程序如表JJF（魯）138—2022表2溫度項(xiàng)目、光學(xué)系統(tǒng)物理項(xiàng)目典型的校準(zhǔn)設(shè)置程序步驟設(shè)定溫度點(diǎn)持續(xù)時(shí)間（s）備注13060預(yù)熱程序295603306043060溫度技術(shù)指標(biāo)校準(zhǔn)程序595630790850970603060模擬光學(xué)擴(kuò)增程序：在85℃/60℃之間循環(huán)32次，同時(shí)進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)。603095擴(kuò)增變性程序6030熔解曲線分解過程95表3光學(xué)系統(tǒng)生物化學(xué)項(xiàng)目典型的校準(zhǔn)設(shè)置程序步驟設(shè)定溫度點(diǎn)持續(xù)時(shí)間（s）循環(huán)數(shù)15012956001395304546060i（1）T——溫度示值誤差，℃;8JJF（魯）138—2022 T TTuTmaxTmin（2）T Tmax——所有測(cè)溫傳感器測(cè)定值平均值的最大值，℃; Tmin——所有測(cè)溫傳感器測(cè)定值平均值的最小值，℃。Tfmax[(TjmaxTjmin)/2]（3）TTjmax——測(cè)量點(diǎn)j溫度傳感器在m次測(cè)量中的最高溫度，℃;Tjmin——測(cè)量點(diǎn)j溫度傳感器在m次測(cè)量中的最低溫度，℃。TtTtmax-Ts（4）TJJF（魯）138—20229TTT/n（5）Tah——平均升溫速率，℃/s；TTT/n（6）T精密度按照公式（9）計(jì)算Ct值的相對(duì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以其作為Ct值精密度的表征。CtiCtqiCts（7）JJF（魯）138—2022RSDCtCtuCtqmaxRSDCtnnCtqii1nnCtm1qiCti——第i個(gè)采樣測(cè)量點(diǎn)閾值循環(huán)數(shù)Ct示值誤差；Cts——熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器實(shí)際經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；Ctu——閾值循環(huán)數(shù)均勻度；RSDCt——閾值循環(huán)數(shù)精密度；CPHCiLSFiBiCiBCABBiCiCPHCi——通道峰值強(qiáng)度一致性；JJF（魯）138—2022 Ai——第i個(gè)采樣孔測(cè)量熔解LSFi——線性靈敏系數(shù)。TTTRTm——熔解溫度比；Ttmax——所有采樣測(cè)量孔實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的Tm最大值，℃;Ttmin——所有采樣測(cè)量孔實(shí)時(shí)熒光定量PCRTJJF（魯）138—2022ccccs（14）c——樣本示值誤差，copies/μLcc——儀器測(cè)量平均值，copies/μLcs——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)稱值，copies/μLrn(CtiCt)(lncilnc)n(CtiCt)2(lncilnc)2r——線性相關(guān)系數(shù)；Cti——系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的第i個(gè)擴(kuò)增Ct值； 校準(zhǔn)結(jié)果應(yīng)在校準(zhǔn)證書（報(bào)告）上反映，校準(zhǔn)證書（報(bào)JJF（魯）138—2022h)如果與校準(zhǔn)結(jié)果的有效性和應(yīng)用有關(guān)時(shí)，應(yīng)對(duì)被校樣品的抽樣程序進(jìn)j)本次校準(zhǔn)所用測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的溯源性及有效性說明；n)校準(zhǔn)證書和校準(zhǔn)報(bào)告簽發(fā)人的簽名、職務(wù)或等p)未經(jīng)實(shí)驗(yàn)室書面批準(zhǔn)，不得部分復(fù)制證書或報(bào)告的聲JJF（魯）138—2022實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀校準(zhǔn)原始記錄參考格式記錄編號(hào)：第X頁共X頁基本信息委托單位名稱：委托單位地址：儀器名稱：制造廠商：規(guī)格型號(hào)：出廠編號(hào)：校準(zhǔn)依據(jù)：標(biāo)準(zhǔn)器信息計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)（器）名稱計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)證書號(hào)有效期至計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)器證書號(hào)有效期至測(cè)量范圍準(zhǔn)確度等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)名稱型號(hào)規(guī)格批號(hào)量值特性/不確定度證書編號(hào)有效日期環(huán)境溫度：℃環(huán)境濕度：%RH校準(zhǔn)員：核驗(yàn)員：一、溫度示值誤差、溫度均勻度設(shè)定點(diǎn)：次數(shù)測(cè)量點(diǎn)12345A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12JJF（魯）138—2022記錄編號(hào)：第X頁共X頁設(shè)定溫度點(diǎn)(℃)305060709095測(cè)量點(diǎn)實(shí)測(cè)溫度平均值 (℃)A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12平均值(℃)實(shí)測(cè)最高溫度(℃)實(shí)測(cè)最低溫度(℃)溫度示值誤差(℃)不確定度(℃)溫度均勻度(℃)二、溫度波動(dòng)度設(shè)定點(diǎn)：次數(shù)測(cè)量點(diǎn)123456789A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12JJF（魯）138—2022記錄編號(hào)：第X頁共X頁Tmax-Tmin305060709095測(cè)量點(diǎn)(℃)A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12溫度波動(dòng)度(℃)三、溫度最大過沖量、平均升溫速率和平均降溫速率設(shè)定溫度點(diǎn)(℃)305060709095最低或最高測(cè)量值(℃)溫度最大過沖量(℃)平均升溫速率(℃/s）平均降溫速率(℃/s）四、閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）示值誤差、均勻度、精密度（光學(xué)系統(tǒng)物理項(xiàng)目）類別熒光定量PCR儀光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器不同分布位置測(cè)量的閾值循環(huán)數(shù)A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12JJF（魯）138—2022記錄編號(hào)：第X頁共X頁閾值循環(huán)數(shù)示值誤差不確定度閾值循環(huán)數(shù)均勻度閾值循環(huán)數(shù)精密度（光學(xué)系統(tǒng)物理項(xiàng)目）T(℃)T(℃)TAiBiCiAi-BiBi-CiCPHCLSFRTm光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器分布位置A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12平均值六、樣本示值誤差、樣本線性相關(guān)系數(shù)（光學(xué)系統(tǒng)生物化學(xué)項(xiàng)目）樣本值：項(xiàng)目測(cè)量值（copies/μL）U2樣本示值誤差：樣本線性系數(shù)：JJF（魯）138—2022設(shè)定溫度點(diǎn)(℃)305060709095溫度示值誤差(℃)溫度均勻度(℃)溫度波動(dòng)度(℃)溫度最大過沖量(℃)平均升溫速率(℃/s）50℃→90℃平均降溫速率(℃/s）90℃→50℃閾值循環(huán)數(shù)示值誤差閾值循環(huán)數(shù)均勻度閾值循環(huán)數(shù)精密度通道峰值強(qiáng)度一致性線性靈敏系數(shù)熔解溫度漂移(℃)熔解溫度比樣本示值誤差（copies/μL）樣本線性相關(guān)系數(shù)JJF（魯）138—2022確保與加熱模塊接觸良好。按照儀器說明書或用TTTiT——采樣測(cè)量孔內(nèi)溫度示值誤差，℃;TT根據(jù)上述數(shù)學(xué)模型以及測(cè)量方法，其不確定度來源a)測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1；b)溫度傳感器分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1；c)溫度傳感器準(zhǔn)確度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u2。C.4.1重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度分量u1sp(ykjyj)2j1k1m(n1)JJF（魯）138—2022ykj——第j個(gè)測(cè)量點(diǎn)第k次的測(cè)量值，℃; yj——第j個(gè)測(cè)量點(diǎn)測(cè)量值的平均值，℃;表C.1溫度測(cè)量結(jié)果次數(shù)測(cè)量點(diǎn)不同測(cè)量點(diǎn)溫度傳感器測(cè)量結(jié)果(℃)123456789A195.0194.9895.0194.9594.9894.9895.0195.0495.0194.98A495.2295.2295.2595.2595.2895.2295.1995.2295.1995.22A794.9394.9394.9394.9694.9394.9694.9394.9994.9194.96A1095.2695.2695.2695.2695.2695.2995.2695.2995.2695.26A1295.4995.4095.4095.4995.4695.5295.4695.4695.5295.46D195.0395.1595.0995.0995.0395.0695.0995.0995.06D794.9094.8794.8794.8294.9394.9094.8794.8494.8794.87D1295.3795.2695.2995.2995.3295.2095.2995.2995.3595.29E494.9494.8594.8594.8594.8594.9494.8894.8594.9794.91E1095.3795.2895.3495.2895.3495.3795.3195.2895.3495.31H195.4795.4795.5095.4795.5095.5095.4795.4795.4795.50H495.0395.0695.0695.0395.0995.0695.0695.0995.06H795.0395.0095.0395.0095.0095.0095.0095.0695.0095.00H1095.2595.2895.2595.3195.3195.2595.2895.2595.2595.28H1295.0194.9895.0194.9894.9594.9895.0194.9595.0395.01sp=0.0313℃u10.0134℃C.4.2溫度傳感器分辨力引入的不確定度u1'JJF（魯）138—2022者具有一定的相關(guān)性，因此在不確定度計(jì)算時(shí)不量u1'。C.4.3溫度傳感器準(zhǔn)確度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u2；u20.058℃C.5合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucc22 u1u2取k2，則：JJF（魯）138—2022并運(yùn)行該程序，同時(shí)啟動(dòng)PCR擴(kuò)增光學(xué)