蛋白質(zhì)的化學(xué)

第四章蛋白質(zhì)的化學(xué)第一節(jié)蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)蛋白質(zhì)的化學(xué)組成第三節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與合成原理第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能第五節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)第六節(jié)蛋白質(zhì)的分離與純化的基本原理第七節(jié)蛋白質(zhì)的分類第1頁(yè)，共123頁(yè)。第一節(jié)蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)一蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體的基本成分蛋白質(zhì)(protein):是由許多不同的α-氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵(肽鍵)縮合而成的,具有較穩(wěn)定的構(gòu)象并具有一定生物功能的大分子.蛋白質(zhì)存在于所有的生物細(xì)胞中,是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì).

第2頁(yè)，共123頁(yè)。蛋白質(zhì)的分布:蛋白質(zhì)是細(xì)胞中含量最豐富的高分子有機(jī)化合物.

占人體總干重的45%,細(xì)菌占50-80%,

干酵母47%,高等植物大豆含40%第3頁(yè)，共123頁(yè)。二蛋白質(zhì)具有多樣性的生物學(xué)功能蛋白質(zhì)在生命活動(dòng)過程中有重要的作用：生物催化,酶類，已知的有3000種以上代謝調(diào)節(jié)，部分激素免疫保護(hù)，抗體、干擾素物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存，載體蛋白運(yùn)動(dòng)與支持，肌肉、骨骼、鞭毛控制生長(zhǎng)和分化，基因表達(dá)調(diào)控接受和傳遞信息，配體和受體構(gòu)成生物膜.第4頁(yè)，共123頁(yè)。第二節(jié)蛋白質(zhì)的化學(xué)組成一蛋白質(zhì)的元素組成

蛋白質(zhì)是一類含氮有機(jī)化合物.某些蛋白質(zhì)還含有微量元素,主要是磷(P)、鐵(Fe)、銅(Cu)、鋅(Zn)和碘(I)等.

N的含量平均為16%：凱氏(Kjadehl)定氮法的理論基礎(chǔ)蛋白質(zhì)的含量=蛋白質(zhì)的含氮量×100/16=蛋白質(zhì)的含氮量×6.25第5頁(yè)，共123頁(yè)?；瘜W(xué)式：C3H6N6第6頁(yè)，共123頁(yè)。第68頁(yè)，共123頁(yè)。第72頁(yè)，共123頁(yè)。第六節(jié)蛋白質(zhì)的分離與純化的基本原理谷胱甘肽(glutathione，GSH)(一)根據(jù)溶解度不同的分離純化方法帶正電荷的極性氨基酸：賴氨酸、精氨酸、組氨酸透析:將蛋白質(zhì)溶液放在半透膜袋內(nèi),置于適當(dāng)?shù)囊子谂c氧結(jié)合,使Hb與氧結(jié)合的速度大大加快.荷質(zhì)比:凈電荷,大小,形狀免疫分離純化:免疫親和層析第115頁(yè)，共123頁(yè)。第60頁(yè)，共123頁(yè)。二.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的基本單位氨基酸(aminoacids):是蛋白質(zhì)水解的最終產(chǎn)物,是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本單位.

所有蛋白質(zhì)都由20種基本氨基酸組成.

氨基酸的結(jié)構(gòu)第7頁(yè)，共123頁(yè)。第8頁(yè)，共123頁(yè)。第9頁(yè)，共123頁(yè)。第10頁(yè)，共123頁(yè)。20種氨基酸(aa)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn):均為L(zhǎng)-氨基酸均為α氨基酸,脯氨酸除外(α亞氨基酸)α-碳原子為不對(duì)稱碳原子(甘氨酸除外)各種aa的R側(cè)鏈各不相同第11頁(yè)，共123頁(yè)。2.不常見氨基酸在少數(shù)蛋白質(zhì)中分離出一些不常見的氨基酸,這些氨基酸都由相應(yīng)的基本氨基酸衍生而來的.其中重要的有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、N-甲基賴氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等.這些不常見蛋白質(zhì)氨基酸的結(jié)構(gòu)如下：第12頁(yè)，共123頁(yè)。三、氨基酸可根據(jù)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行分類非極性氨基酸：丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸不帶電荷的極性氨基酸：甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺帶正電荷的極性氨基酸：賴氨酸、精氨酸、組氨酸帶負(fù)電荷的極性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸極性氨基酸第13頁(yè)，共123頁(yè)。幾種特殊氨基酸

脯氨酸（亞氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2第14頁(yè)，共123頁(yè)。

半胱氨酸+胱氨酸二硫鍵-HH-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3第15頁(yè)，共123頁(yè)。第16頁(yè)，共123頁(yè)。四、氨基酸其他重要的概念必需氨基酸(essentialaminoacid,EAA)：人體體內(nèi)自身不能合成,必須從食物中獲

成人有8種必需氨基酸：賴氨酸(Lys)纈氨酸(Val)色氨酸(Try)

亮氨酸(Leu)異亮氨酸(Ile)蘇氨酸(Thr)

苯丙氨酸(Phe)甲硫氨酸（蛋氨酸）(Met)

嬰兒時(shí)期所需:精氨酸(Arg)、組氨酸(His)

食物蛋白質(zhì)的互補(bǔ)作用:營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較低的食物蛋白質(zhì)合理搭配、混合食用,從而互補(bǔ)必需氨基酸的不足,提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值.第17頁(yè)，共123頁(yè)。2.紫外吸收色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在280nm附近有一定的吸收.原因：分子中含有苯環(huán)(共軛雙鍵).據(jù)此可以通過測(cè)定蛋白質(zhì)溶液280nm的吸光值測(cè)定蛋白質(zhì)含量第18頁(yè)，共123頁(yè)。3.茚三酮反應(yīng)氨基酸與水合茚三酮一起加熱,生成藍(lán)紫色化合物,在570nm處有最大吸收.可用作aa含量分析.氨基酸與水合茚三酮共熱,發(fā)生氧化脫氨反應(yīng),生成的NH3與還原吲三酮及水合茚三酮脫水縮合,生成藍(lán)紫色化合物第19頁(yè)，共123頁(yè)。4.兩性解離及等電點(diǎn)不同pH時(shí)氨基酸以不同的離子化形式存在：

氨基酸所帶靜電荷為零時(shí),溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)(isoelectricPoint),以pI表示pI的用途：分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)制劑、AA制劑，在藥物使用上可改變PI方法延長(zhǎng)療效第20頁(yè)，共123頁(yè)。五、氨基酸的分離與分析1.自動(dòng)氨基酸分析儀2.高效液相色譜(highperformanceliguidchromatography，HPLC)3.離子交換層析4.質(zhì)譜(MS)第21頁(yè)，共123頁(yè)。第三節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與合成原理蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)分為一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)(二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)).一蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)(primarystructure)一級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的種類、數(shù)量及排列順序.包含的共價(jià)鍵主要指肽鍵和二硫鍵(disulfidebond).第22頁(yè)，共123頁(yè)。(一)肽鍵(peptidebond)和肽鏈(polypeptide)肽鍵：一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基

之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵.第23頁(yè)，共123頁(yè)。肽鍵特點(diǎn)：組成肽鍵的原子處于同一平面肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì),不能自由旋轉(zhuǎn)肽健C-N:0.133nmC＝N:0.125nmC－N:0.145nm第24頁(yè)，共123頁(yè)。肽(peptide):氨基酸借肽鍵相連而形成的化合物.

二肽,三肽……

蛋白質(zhì)與多肽并無(wú)嚴(yán)格的界線,通常將分子量在

6kDa以上的多肽稱為蛋白質(zhì)寡肽(oligopeptide):由10個(gè)以內(nèi)氨基酸連成的小肽肽鏈:氨基酸之間通過肽鍵連接形成的鏈.

有鏈狀、環(huán)狀和分支狀.氨基酸殘基(aminoacidresidue):組成多肽的氨基酸單元.氨基酸在形成肽鏈時(shí)丟失一分子水,分子已不完整.二硫鍵：兩分子半胱氨酸殘基的巰基脫氫生成的，可存在肽鏈內(nèi)部和肽鏈之間.第25頁(yè)，共123頁(yè)。多肽鏈的一端含有一個(gè)游離的

-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個(gè)游離的

-羧基，稱為羧基端或C-端.氨基酸的順序是從N端的氨基酸殘基開始，以C端氨基酸殘基為終點(diǎn)的排列順序.如上述五肽可表示為:Ser-Val-Tyr-Asp-GlnSVYDQSer-Val和Val-Ser是相同的二肽嗎？第26頁(yè)，共123頁(yè)。多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位生物活性肽:1.谷胱甘肽(glutathione，GSH)功能：GSH是體內(nèi)重要的還原劑構(gòu)成第一個(gè)肽鍵的羧基是谷氨酸的γ－羧基2.促甲狀腺素釋放激素由下丘腦分泌,促進(jìn)腺垂體釋放促甲狀腺素(調(diào)節(jié)糖代謝)第27頁(yè)，共123頁(yè)。3.牛胰島素結(jié)構(gòu)：第28頁(yè)，共123頁(yè)。第29頁(yè)，共123頁(yè)。(二)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的原理一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定目的:知道氨基酸的組成和排列順序

一級(jí)結(jié)構(gòu)確定的原則：將大化小,逐段分析,制成兩套肽片段,找出重疊位點(diǎn),排出肽的前后位置,最后確定蛋白質(zhì)的完整序列.第30頁(yè)，共123頁(yè)。2.1N-末端氨基酸的分析(1)二硝基氟苯法(DNFB)分離DNP-氨基酸，用紙層析、HPLC進(jìn)行分析該方法已過時(shí)首先由Sanger應(yīng)用，確定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)第31頁(yè)，共123頁(yè)。(2)丹磺酰氯法(DNS-Cl):此法優(yōu)點(diǎn),丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測(cè)靈敏度比DNFB高100倍，產(chǎn)物不必提取直接分析第32頁(yè)，共123頁(yè)。(3)Edman降解法(苯異硫氰酸酯法、PITC法、PTC法、PTH法)Edman于1950年首先提出第33頁(yè)，共123頁(yè)。(4)氨肽酶法：一種肽鏈外切酶.能從肽鏈N端開始逐個(gè)切掉氨基酸第34頁(yè)，共123頁(yè)。2.2C-末端氨基酸的分析羧肽酶法：羧肽酶是一種肽鏈C-端外切酶，目前常用的羧肽酶：A,B,C和Y.種類作用類型A脂肪族或芳香族氨基酸（脯氨酸除外）B堿性氨基酸CC末端的脯氨酸Y幾乎所有類型氨基酸（最適用）第35頁(yè)，共123頁(yè)。(2)肼解法:也稱聯(lián)氨法.多肽與肼在無(wú)水條件下加熱,C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來,其余的氨基酸則變成肼化物.肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離.第36頁(yè)，共123頁(yè)。3.大分子多肽氨基酸順序的確定采用兩種或多種不同的斷裂方法將長(zhǎng)肽斷裂成兩套或多套小肽,并將其分離純化、分別測(cè)序.多肽的選擇性降解的方法有：化學(xué)法：溴化氰水解法,它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵.酶解法:第37頁(yè)，共123頁(yè)。第38頁(yè)，共123頁(yè)。利用重疊肽確定肽段在多肽鏈中的次序：利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊,拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序.第39頁(yè)，共123頁(yè)。5.從核酸順序推導(dǎo)氨基酸順序原理：通過核酸的氨基酸順序（三個(gè)核苷酸確定一個(gè)氨基酸的密碼）。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)經(jīng)典化學(xué)法難以測(cè)定的大分子蛋白質(zhì)或生物體含量很低的蛋白質(zhì)很適用缺點(diǎn)：無(wú)法提供二硫鍵的位置等信息第40頁(yè)，共123頁(yè)。二蛋白質(zhì)的構(gòu)象(conformation)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)不具有功能,只有形成正確的結(jié)構(gòu)才具有功能.二級(jí)結(jié)構(gòu)以上的結(jié)構(gòu)叫高級(jí)結(jié)構(gòu),高級(jí)結(jié)構(gòu)是指各原子或基團(tuán)在空間上的分布,所以又叫空間結(jié)構(gòu),或三維結(jié)構(gòu)可分為:二級(jí)結(jié)構(gòu),三級(jí)結(jié)構(gòu),四級(jí)結(jié)構(gòu)第41頁(yè)，共123頁(yè)。(一)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondarystructure)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指肽鏈的主鏈在空間的排列,或規(guī)則的幾何走向、旋轉(zhuǎn)及折疊.只涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵.主要有

-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角.第42頁(yè)，共123頁(yè)。1.α-螺旋(α-helix)

由肽鍵平面盤旋形成的螺旋狀構(gòu)象Pauling和Corey于1965年提出第43頁(yè)，共123頁(yè)。結(jié)構(gòu)要點(diǎn)：天然蛋白質(zhì)中螺旋的方向大都為右手螺旋(僅在嗜熱菌蛋白酶中發(fā)現(xiàn)了一段左手螺旋).每3.6個(gè)氨基酸螺旋上升一圈,每圈螺旋的高度為0.54nm,每個(gè)氨基酸殘基沿軸上升0.15nm,肽鍵平面與中心軸平行.主鏈原子構(gòu)成螺旋的主體,側(cè)鏈在其外部肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，第一個(gè)氨基酸殘基的-CO基與第四個(gè)氨基酸殘基的-NH基形成氫鍵.是穩(wěn)定螺旋的主要作用力第44頁(yè)，共123頁(yè)。影響α-螺旋穩(wěn)定性的因素：在多肽鏈中連續(xù)的出現(xiàn)帶同種電荷的極性氨基酸，阻止氫鍵形成，α-螺旋就不穩(wěn)定Pro的N上缺少H，不能形成氫鍵，它改變多肽鏈的方向并終止螺旋Gly的R基太小，難以形成α-螺旋所需的兩面角，也是螺旋的最大破壞者肽鏈中連續(xù)出現(xiàn)帶龐大側(cè)鏈的氨基酸如Ile，由于空間位阻，也難以形成α-螺旋pH的影響第45頁(yè)，共123頁(yè)。（4條α-螺旋）原纖維微原纖維巨原纖維紡錘體型皮質(zhì)細(xì)胞角質(zhì)膜皮質(zhì)髓質(zhì)頭發(fā)頭發(fā)結(jié)構(gòu)燙發(fā)的生物化學(xué)過程第46頁(yè)，共123頁(yè)。2.β-折疊(β-pleatedsheet)

-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列,通過鏈間氫鍵交聯(lián)形成.肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象.第47頁(yè)，共123頁(yè)。

-折疊的結(jié)構(gòu)要點(diǎn)：肽鍵平面呈鋸齒狀排列,側(cè)鏈Ｒ基團(tuán)交錯(cuò)分布在片層平面的兩側(cè)由氫鍵維持穩(wěn)定.其方向與折疊的長(zhǎng)軸接近垂直.有兩種類型:平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊:反平行式，即相鄰肽鏈的方向相反每一個(gè)氨基酸在主軸上所占的距離，平行的是0.325nm，反平行的是0.35nm.反平行式更穩(wěn)定.第48頁(yè)，共123頁(yè)。3.

-轉(zhuǎn)角(β-turn)也稱

-回折或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，存在于球狀蛋白中在

-轉(zhuǎn)角部分，由四個(gè)氨基酸殘基組成彎曲處的第一個(gè)氨基酸殘基的-C=O和第四個(gè)殘基的–N-H之間形成氫鍵，維持構(gòu)象.經(jīng)常出現(xiàn)在連接反平行β-折疊片的端頭.第49頁(yè)，共123頁(yè)。4.無(wú)規(guī)卷曲(randomcoil)自由回轉(zhuǎn)

無(wú)規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu).常常是酶的活性部位第50頁(yè)，共123頁(yè)。(二)超二級(jí)結(jié)構(gòu)指二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位(α-螺旋,β-折疊等)相互聚集,形成有規(guī)律的在空間上能辨認(rèn)的聚集體.已知的超二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有αα,βαβ,β-曲折和β-折疊筒等.

是氨基酸側(cè)鏈相互作用的結(jié)果.超二級(jí)結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)層次上高于二級(jí)結(jié)構(gòu)，但沒有聚集成具有功能的結(jié)構(gòu)域．又稱基序或模塊（motifs）第51頁(yè)，共123頁(yè)。第52頁(yè)，共123頁(yè)。(三)結(jié)構(gòu)域(structuraldomain)結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位.多肽鏈在超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步繞曲折疊成緊密的近似球行的結(jié)構(gòu),具有部分生物功能.第53頁(yè)，共123頁(yè)。第54頁(yè)，共123頁(yè)。結(jié)構(gòu)域一般由100-200個(gè)aa組成,氨基酸可以連續(xù),也可以不連續(xù)．結(jié)構(gòu)域之間常形成裂隙,比較松散,往往是蛋白質(zhì)優(yōu)先被水解的部位.酶的活性中心往往位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的界面上．可作為結(jié)構(gòu)單位進(jìn)行相對(duì)獨(dú)立的運(yùn)動(dòng),水解后仍能維持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),甚至保留某些生物活性．對(duì)于較小的蛋白質(zhì)分子,結(jié)構(gòu)域與三級(jí)結(jié)構(gòu)等同,即這些蛋白為單結(jié)構(gòu)域.結(jié)構(gòu)域有時(shí)也稱功能域,功能域是指有功能的部分.功能域可以是一個(gè)結(jié)構(gòu)域,也可以是兩個(gè)或兩個(gè)以上的結(jié)構(gòu)域組成.第55頁(yè)，共123頁(yè)。(四)三級(jí)結(jié)構(gòu)(tertiarystructure)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤旋、折疊,從而生成特定的空間結(jié)構(gòu).包括主鏈和側(cè)鏈的所有原子的空間排布．

一般非極性側(cè)鏈埋在分子內(nèi)部，形成疏水核，極性側(cè)鏈在分子表面．第56頁(yè)，共123頁(yè)。(四)四級(jí)結(jié)構(gòu)(quarternarystructure)蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)是指由多條各自具有一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的肽鏈通過非共價(jià)鍵連接起來的結(jié)構(gòu)形式,內(nèi)容包括各個(gè)亞基在蛋白質(zhì)中的空間排列方式及亞基之間的相互作用關(guān)系.

這種蛋白質(zhì)分子中，每一個(gè)具有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的肽鏈,稱為亞基(Subunit),它一般由一條肽鏈構(gòu)成,無(wú)生理活性,只有當(dāng)這些亞基聚合成一個(gè)完整的蛋白質(zhì)分子后,才具有生物活性第57頁(yè)，共123頁(yè)。由2-10個(gè)亞基組成的蛋白稱為寡聚體oligomer

更多亞基組成的蛋白稱多聚體(polymer)第58頁(yè)，共123頁(yè)。(五)維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵1氫鍵(hydrogenbond):一個(gè)電負(fù)性大的原子上的氫和另一個(gè)電負(fù)性大的原子相互作用形成的鍵.2疏水鍵(hydrophobicbond):由兩個(gè)非極性基團(tuán)因避開水而聚在一起的作用力.第59頁(yè)，共123頁(yè)。3鹽鍵(ionicbond):蛋白分子中正電荷基團(tuán)和負(fù)電荷基團(tuán)之間的靜電吸引所形成的化學(xué)鍵.4范德華引力(VanderWaals):原子,分子,基團(tuán)間的一種弱作用力.5二硫鍵(disulfidebond)第60頁(yè)，共123頁(yè)。維系蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)：肽鍵、二硫鍵維系蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)：氫鍵維系蛋白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)：疏水相互作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵維系蛋白質(zhì)分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵第61頁(yè)，共123頁(yè)。三蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測(cè)定1.二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定通常采用圓二色光譜(circulardichroism，CD)測(cè)定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量.

-螺旋的CD峰有222nm處的負(fù)峰、208nm處的負(fù)峰和198nm處的正峰三個(gè)成分；而

-折疊的CD譜不很固定第62頁(yè)，共123頁(yè)。2.三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定X射線衍射法(X-raydiffraction)和核磁共振技術(shù)(nuclearmagneticresonance,NMR)是研究蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)最準(zhǔn)確的方法第63頁(yè)，共123頁(yè)。四蛋白質(zhì)和多肽合成的基本原理(一)化學(xué)合成法的基本原理氨基酸的基團(tuán)保護(hù)氨基保護(hù)基Y：Cbz-Cl(芐氧碳酰氯)：H2/Pd或Na-液氨法去除Boc-Cl(叔丁氧碳酰氯)：稀鹽酸法去除第64頁(yè)，共123頁(yè)。2.縮合劑：N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(N,N′-dicyclohexylcarbodiimide,縮寫DCCI)第65頁(yè)，共123頁(yè)。多肽的液相合成(1)氨基酸的基團(tuán)保護(hù)(2)接肽縮合反應(yīng)(3)除去保護(hù)集團(tuán)循環(huán)反應(yīng)，合成順序N端到C端第66頁(yè)，共123頁(yè)。多肽的固相合成常用固相載體：聚苯乙烯樹脂羧基與載體相連.合成方向：C端到N端第67頁(yè)，共123頁(yè)。(二)生物技術(shù)合成蛋白質(zhì)1.基因工程(geneticengineering)(DNA重組)2.細(xì)胞工程(cellengineering)3.酶工程(enzymeengineering)第68頁(yè)，共123頁(yè)。第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能一蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1.一級(jí)結(jié)構(gòu)不同,生物學(xué)功能各異不同蛋白質(zhì)有不同功能的根本原因是一級(jí)結(jié)構(gòu)的不同.一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)而決定功能.第69頁(yè)，共123頁(yè)。第70頁(yè)，共123頁(yè)。2.一級(jí)結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵部分相同,功能也相同

ACTH：促腎上腺皮質(zhì)激素,垂體前葉分泌第71頁(yè)，共123頁(yè)。3.一級(jí)結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵部分變化,其生物活性也改變第72頁(yè)，共123頁(yè)。4.一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化與疾病的關(guān)系如鐮刀貧血病(sickle-cellanemia),其不正常的血紅蛋白(Hb-S)與正常的血紅蛋白(Hb-A)的差別：僅僅在于β鏈的N-末端第6位殘基發(fā)生變化CTT→CAT第73頁(yè)，共123頁(yè)。糖尿病是胰島素51個(gè)氨基酸中僅有一氨基酸殘基異常:

這類由遺傳突變引起的在分子水平上僅存在微觀差異而導(dǎo)致的疾病稱作分子病第74頁(yè)，共123頁(yè)。高濃度中性鹽：鹽析作用構(gòu)成第一個(gè)肽鍵的羧基是第109頁(yè)，共123頁(yè)。帶負(fù)電荷的極性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸第28頁(yè)，共123頁(yè)。所有蛋白質(zhì)都由20種基本氨基酸組成.四蛋白質(zhì)和多肽合成的基本原理第28頁(yè)，共123頁(yè)。蛋白質(zhì)是由氨基酸組成，因此蛋白質(zhì)的性質(zhì)與氨基酸相似,但由于蛋白質(zhì)是由許多氨基酸通過肽鍵形成了大分子化合物,也就出現(xiàn)了一些新的性質(zhì).熔點(diǎn)：180℃（分解）.葡聚糖凝膠(商品名Sephadex)(2)丹磺酰氯法(DNS-Cl):此法優(yōu)點(diǎn),丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測(cè)靈敏度比DNFB高100倍，產(chǎn)物不必提取直接分析在多肽鏈中連續(xù)的出現(xiàn)帶同種電荷的極性氨基酸，阻止氫鍵形成，α-螺旋就不穩(wěn)定N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺結(jié)構(gòu)域之間常形成裂隙,比較松散,往往是蛋白質(zhì)優(yōu)先被水解的部位.二蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)分子特定的空間構(gòu)象是其具有生物活性所必需的.1.蛋白質(zhì)前體的活化有些蛋白在體內(nèi)是以無(wú)活性的蛋白質(zhì)原形式合成和分泌的,經(jīng)過裂解之后才表現(xiàn)出活性.一些酶原和蛋白質(zhì).第75頁(yè)，共123頁(yè)。例：胰島素,在剛合成時(shí)為前胰島素原,其的N-末端有一段肽鏈,稱為信號(hào)肽.信號(hào)肽被切去,變成胰島素原.其由84個(gè)aa組成,僅有10%活性,經(jīng)水解成一條21個(gè)aa的A鏈,一條30個(gè)aa的B鏈，才有完整的生物活性.第76頁(yè)，共123頁(yè)。2.蛋白質(zhì)的變構(gòu)現(xiàn)象變構(gòu)作用(allostericeffect)：又稱別構(gòu)效應(yīng),指含亞基的蛋白質(zhì)分子由于一個(gè)亞基構(gòu)象的改變而引起其余亞基以至整個(gè)分子構(gòu)象、性質(zhì)和功能發(fā)生變化.以血紅蛋白為例：血紅蛋白(Hb),四聚體(α2β2),與氧的親和力很弱,但當(dāng)氧與Hb分子中一個(gè)亞基的血紅素輔基的鐵結(jié)合后.即引起該亞基構(gòu)象的改變,一個(gè)亞基構(gòu)象的改變又會(huì)引起其余亞基的構(gòu)象相繼發(fā)生改變,易于與氧結(jié)合,使Hb與氧結(jié)合的速度大大加快.第77頁(yè)，共123頁(yè)。3蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病蛋白質(zhì)構(gòu)象病比如：朊病毒蛋白（PrP)第78頁(yè)，共123頁(yè)。三蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與生物進(jìn)化

同源蛋白：在不同有機(jī)體中實(shí)現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì).同源蛋白中的一級(jí)結(jié)構(gòu)中有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來說都是相同的，稱為不變殘基；其他位置的氨基酸稱可變殘基.不同種屬的可變殘基有很大變化.可用于判斷生物體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近.

第79頁(yè)，共123頁(yè)。例：細(xì)胞色素C,80個(gè)物種中,有26個(gè)位置上的氨基酸殘基完全不變,是維持其構(gòu)象中發(fā)揮特有功能所必要的部位,屬于不變殘基.第80頁(yè)，共123頁(yè)。

可變殘基可能隨著進(jìn)化而變異，而且不同種屬的細(xì)胞色素C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關(guān)系相關(guān).親緣關(guān)系相近者，氨基酸差異少，反之則多(進(jìn)化樹)第81頁(yè)，共123頁(yè)。第五節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)是由氨基酸組成，因此蛋白質(zhì)的性質(zhì)與氨基酸相似,但由于蛋白質(zhì)是由許多氨基酸通過肽鍵形成了大分子化合物,也就出現(xiàn)了一些新的性質(zhì).第82頁(yè)，共123頁(yè)。一蛋白質(zhì)分子的大小、形狀及分子量的測(cè)定1.蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子，相對(duì)分子質(zhì)量一般大于1×104.最高可達(dá)4×107(煙草花葉病毒)．2.球形不對(duì)稱常數(shù)接近1

纖維狀不對(duì)稱常數(shù)遠(yuǎn)大于10

橢圓形不對(duì)稱常數(shù)介于中間第83頁(yè)，共123頁(yè)。3.分子量測(cè)定的方法1)估算分子量方法：

a)根據(jù)化學(xué)成分測(cè)定最小相對(duì)分子質(zhì)量

首先利用化學(xué)分析方法測(cè)定蛋白質(zhì)分子中某一特殊成分的百分含量,假定蛋白質(zhì)分子中該成分只有一個(gè),據(jù)其百分含量可計(jì)算出最低相對(duì)分子質(zhì)量：

最小分子量=原子量/組成百分?jǐn)?shù)ⅹ100

如：細(xì)胞色素C鐵=0.45%，其最小分子量=12237

第84頁(yè)，共123頁(yè)。b)根據(jù)氨基酸的數(shù)目

20種氨基酸的平均分子量為128

肽鍵個(gè)數(shù)=縮合失水分子數(shù)=氨基酸分子總個(gè)數(shù)－肽鏈條數(shù)

已知20種氨基酸的平均分子量是128，現(xiàn)有一蛋白質(zhì)分子由兩條多肽鏈組成，共有肽鍵98個(gè),問此蛋白質(zhì)的分子量最接近于（）2)較精確測(cè)定分子量的主要方法有超速離心法、分子篩層析法、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、生物質(zhì)譜法等.

11036第85頁(yè)，共123頁(yè)。a）超速離心法在60000～80000rpm的高速離心力作用下,蛋白質(zhì)分子會(huì)沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動(dòng),用光學(xué)方法測(cè)定界面移動(dòng)的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降速度.蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān).沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場(chǎng)中的沉降速度,用S表示.一個(gè)S單位為1×10-13秒第86頁(yè)，共123頁(yè)。相對(duì)分子質(zhì)量越大,S值越大蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)：1～200S由沉降系數(shù)S可根據(jù)斯維得貝格〔Svedberg〕方程計(jì)算蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量：第87頁(yè)，共123頁(yè)。b)分子篩層析法,也叫凝膠過濾法所用介質(zhì)為凝膠珠,其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).一定型號(hào)的凝膠網(wǎng)孔只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部,大分子則被排阻在外.洗脫時(shí)大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來,洗脫液體積小;小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去,歷程長(zhǎng),后洗脫下來,洗脫體積大.第88頁(yè)，共123頁(yè)。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量一般用葡聚糖,商品名:Sephadex先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積〔Ve〕以相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)(logM)對(duì)Ve作圖,得一標(biāo)準(zhǔn)曲線再測(cè)出未知樣品洗脫體積〔Ve〕從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量一定范圍內(nèi):Ve＝K1－K2logM第89頁(yè)，共123頁(yè)。c)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS)SDS:十二烷基硫酸鈉,變性劑普通蛋白質(zhì)電泳的泳動(dòng)速率取決于荷質(zhì)比:凈電荷,大小,形狀用SDS和巰基乙醇(打開二硫鍵)處理蛋白質(zhì)變性并與SDS結(jié)合,形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,使蛋白質(zhì)分子均帶負(fù)電.

0.4g-1.4gSDS/1g

此方法只能測(cè)得亞基肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量第90頁(yè)，共123頁(yè)。十二烷基硫酸鈉

Sodiumdodecylsulfate

分子式：CH3(CH2)11OSO3Na

分子量：C12H25NaO4S=288.38

性狀：白色或淺黃色結(jié)晶或粉末.

熔點(diǎn)：180℃（分解）.

十二烷基磺酸鈉

Dodecylsulfonicacidsodiumsalt

分子式：CH3(CH2)11SO3Na

分子量：C12H25NaO3S=272.38

性狀：白色或淺黃色結(jié)晶或粉末.

熔點(diǎn)：300℃.第91頁(yè)，共123頁(yè)。水平式電泳裝置垂直式電泳裝置第92頁(yè)，共123頁(yè)。用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值對(duì)它們的遷移率作圖，測(cè)出待測(cè)樣品的遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的相對(duì)分子量.d)生物質(zhì)譜法更準(zhǔn)確的分子量測(cè)定方法第93頁(yè)，共123頁(yè)。二蛋白質(zhì)的變性(denaturation)變性是指蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響,使蛋白質(zhì)分子原有的特定的空間構(gòu)象發(fā)生改變,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)性質(zhì)的改變以及生物活性的喪失.但一級(jí)結(jié)構(gòu)未遭破壞.1.變性蛋白質(zhì)的特性：變性蛋白質(zhì)主要標(biāo)志是生物學(xué)功能的喪失溶解度降低,易形成沉淀析出,粘度增加而擴(kuò)散系數(shù)減小結(jié)晶能力喪失,分子形狀改變,肽鏈松散,反應(yīng)基團(tuán)增加,易被酶消化第94頁(yè)，共123頁(yè)。2.變性的因素物理因素:加熱、紫外線、X-射線、超聲波等.化學(xué)因素:酸、堿、有機(jī)溶劑、蛋白變性劑(尿素、鹽酸胍)、重金屬鹽等.3.蛋白質(zhì)的復(fù)性(renaturation)除去變性因素后,有的變性蛋白質(zhì)又可恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性,這一現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性第95頁(yè)，共123頁(yè)。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)第96頁(yè)，共123頁(yè)。三蛋白質(zhì)的兩性電離與等電點(diǎn)

等電點(diǎn)(pI):在某一pH值溶液中,蛋白質(zhì)酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)的解離程度相當(dāng),蛋白質(zhì)分子所帶正負(fù)電荷相等,凈電荷為零.此時(shí)溶液的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI).第97頁(yè)，共123頁(yè)。四蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子顆粒大小1-100nm之間,屬膠體顆粒范圍,在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體,具有膠體溶液的典型性質(zhì)如布郎運(yùn)動(dòng)、丁達(dá)爾現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附能力等.蛋白質(zhì)的親水膠體溶液相當(dāng)穩(wěn)定：1.表面親水基團(tuán)吸引周圍的水分子,使水分子定向排列在它的周圍,形成“水化層”.2.蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)帶有同種電荷,同種電荷相斥,使蛋白質(zhì)分子保持一定的距離而不聚合.+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)第98頁(yè)，共123頁(yè)。五蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)(pre-cipitation)當(dāng)破壞了維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素甚至蛋白質(zhì)的構(gòu)象時(shí),蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中析出,這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的沉淀使蛋白質(zhì)沉淀的方法:鹽析法(saltingout)

向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽低濃度中性鹽：鹽溶作用高濃度中性鹽：鹽析作用第99頁(yè)，共123頁(yè)。常用的中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等作用原理:鹽離子與水親和力極強(qiáng),奪去蛋白質(zhì)的水化層,減少分子間靜電斥力特點(diǎn)：不破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象,蛋白質(zhì)不發(fā)生變性分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度,可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出.

如血清球蛋白(50硫酸銨飽和度)

清蛋白(飽和硫酸銨)第100頁(yè)，共123頁(yè)。(2)有機(jī)溶劑沉淀法原理:使蛋白質(zhì)脫去水化層,又能降低溶液的介電常數(shù)使蛋白質(zhì)表面電荷減少,導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀.常用有機(jī)溶劑:甲醇、乙醇、丙酮缺點(diǎn)：常會(huì)使蛋白質(zhì)變性注意事項(xiàng):必須低溫下操作,盡量縮短處理的時(shí)間第101頁(yè)，共123頁(yè)。重金屬鹽沉淀法原理:重金屬離子如Hg2+、Ag+、Pb2+等帶有正電荷,能與蛋白質(zhì)分子中帶負(fù)電基團(tuán)結(jié)合,生成不溶性的重金屬蛋白鹽而沉淀.

若溶液pH大于蛋白質(zhì)的pI,沉淀更易發(fā)生缺點(diǎn)：此法常使蛋白質(zhì)變性失活(4)加熱:變性導(dǎo)致沉淀第102頁(yè)，共123頁(yè)。(5)生物堿試劑和某些酸類沉淀法原理:生物堿試劑(如鞣酸、苦味酸、鎢酸等),某些酸類(三氯乙酸、磺酰水楊酸和硝酸等),與帶正電的蛋白質(zhì)結(jié)合生成不溶性的鹽而沉淀注意事項(xiàng):反應(yīng)溶液的pH<pI,確保蛋白質(zhì)以陽(yáng)離子形式存在缺點(diǎn)：此法常使蛋白質(zhì)變性失活第103頁(yè)，共123頁(yè)。六蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)第104頁(yè)，共123頁(yè)。七蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì)1.抗原(antigen,Ag):外源和非自身的能被免疫系統(tǒng)識(shí)別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì).免疫原性(Immunogenicity):能刺激生物體產(chǎn)生免疫應(yīng)答并產(chǎn)生抗體或免疫淋巴細(xì)胞的特性.免疫反應(yīng)性(Specificreactivity):能與所產(chǎn)生免疫應(yīng)答產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)合并發(fā)生反應(yīng)的能力.半抗原(Hapten)-不具免疫原性只具免疫反應(yīng)性的物質(zhì).抗原決定簇(Determinant):是抗原引起免疫應(yīng)答和與抗體結(jié)合反應(yīng)的基本結(jié)構(gòu)單位.常位于抗原分子的表面,由3-8個(gè)氨基酸構(gòu)成.

分為a.構(gòu)象決定簇b.順序決定簇第105頁(yè)，共123頁(yè)。2.抗體(antibody,Ab):能與抗原特異性結(jié)合,并具免疫功能的球蛋白.免疫球蛋白(immunoglobulinIg)抗體活性及和抗體結(jié)構(gòu)類似的球蛋白家族多克隆抗體(polyclonalantibodies)：針對(duì)各種抗原決定簇的許多不同的抗體.單克隆抗體(monoclonalantibodyMcAb)：針對(duì)單一抗原決定簇第106頁(yè)，共123頁(yè)。抗原抗體反應(yīng)具有高度特異性3蛋白質(zhì)免疫性的應(yīng)用疾病的免疫預(yù)防,免疫診斷,免疫治療免疫分析:放射免疫分析(RIA)酶聯(lián)免疫分析:(EIA)免疫分離純化:免疫親和層析BACK第107頁(yè)，共123頁(yè)。第六節(jié)蛋白質(zhì)分離與純化的基本原理一蛋白質(zhì)的提取1.材料的選擇.含目的蛋白多,來源方便,注意處理過程2.組織細(xì)胞破碎.有機(jī)械方法、超聲法等3.提取分離.合適的溶劑和方法、防止酶解.第108頁(yè)，共123頁(yè)。

二蛋白質(zhì)的分離與純化(一)根據(jù)溶解度不同的分離純化方法

1等電點(diǎn)沉淀法

2鹽析沉淀法

3低溫有機(jī)溶劑沉淀法

4溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的響

(二)根據(jù)分子大小不同的分離純化方法

1透析(dialysis)和超濾法(ultrafiltration)第109頁(yè)，共123頁(yè)。透析:將蛋白質(zhì)溶液放在半透膜袋內(nèi),置于適當(dāng)?shù)木彌_液中,小分子雜質(zhì)(如硫酸銨等)可從袋中透出,而蛋白質(zhì)保留于袋中,從而將蛋白質(zhì)純化.第110頁(yè)，共123頁(yè)。

超濾法：利用壓力或離心力強(qiáng)行使水和小分子雜質(zhì)通過超濾膜(一種半透膜)除去,而蛋白質(zhì)留在膜上.第111頁(yè)，共123頁(yè)。2分子篩層析(molecular-sievehormatography)

也叫凝膠過濾(gel-