蘇云金芽孢桿菌可濕性粉劑 編制說(shuō)明

1《蘇云金桿菌可濕性粉劑》修訂編制說(shuō)明意見(jiàn)、標(biāo)準(zhǔn)評(píng)審匯報(bào)等工作。草單位及有關(guān)單位的分工和大體工作進(jìn)度，2770/WG/GR（October2012）。經(jīng)比較，以上的WHO規(guī)格涉及的產(chǎn)品屬于B.T.i（蘇云金桿菌的以色列亞種，BacillusthurstrainAM65-52.并且一般適用于衛(wèi)生消殺領(lǐng)域中的蚊蟲(chóng)防治，故對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)3GB/T8170—2008數(shù)值修約規(guī)則與極限GB/T16150—1995農(nóng)藥粉劑、可濕性GB/T19136—2021農(nóng)藥熱蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis,簡(jiǎn)稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭氏昆蟲(chóng)尸體內(nèi)及植物葉片，是一種對(duì)害蟲(chóng)毒力強(qiáng)且對(duì)天敵無(wú)毒性的昆蟲(chóng)病原微生劑總量的90%～95%。我國(guó)最早用于防治小菜蛾的Bt菌是庫(kù)斯塔克亞種，其主效cry1Ac、cry1B、cry1C、cry1F、cry2A、cry1I、cry7Ba1c此類菌在芽孢形成時(shí)期產(chǎn)生一種或多種殺蟲(chóng)晶體蛋白(insecticidal藥被廣泛應(yīng)用。其中對(duì)昆蟲(chóng)的毒性大部分或者完全取決于伴胞晶體對(duì)昆蟲(chóng)的毒異受體結(jié)合而形成穿孔病灶。Bt晶體蛋白作為一種胃毒素發(fā)揮作用，其對(duì)多種昆蟲(chóng)有殺蟲(chóng)活性，包括鱗翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoplera)、雙翅目4指標(biāo)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了外觀、毒素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、毒力效價(jià)、水分、pH值、濕篩試驗(yàn)、懸浮率、潤(rùn)濕時(shí)間和持久起泡性，并規(guī)定了質(zhì)量保證期。具體指標(biāo)要求毒素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%pH值水分/%濕篩試驗(yàn)（通過(guò)75μm試驗(yàn)篩）/%懸浮率/%aH.a.代表棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)，也可選擇小菜蛾和甜菜夜蛾作為試驗(yàn)蟲(chóng)，試驗(yàn)結(jié)果分別表示為毒力效價(jià)（P.x.）和毒力效價(jià)（S.e.但應(yīng)以毒力效價(jià)（H.a.）作為仲裁法。夜蛾(Spodopteraexigua)。當(dāng)以毒素5可濕性粉劑控制細(xì)度指標(biāo)首先是防止在施藥析，并結(jié)合企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)情況，本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：“濕篩試驗(yàn)（通過(guò)75μm試驗(yàn)篩）6b）生產(chǎn)地址、生產(chǎn)設(shè)備或生產(chǎn)工藝有較大改變，可能影參照NY/T4409-2023,毒素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺7按GB/T14825-2023中4.2進(jìn)行。稱取500mg試樣(精確至0.1mg)于200mL燒杯中，加入50mL標(biāo)準(zhǔn)硬水，以120r/min速度攪拌2min，混合均勻試樣。將懸浮液全部轉(zhuǎn)移至250mL具塞玻璃量筒中，用標(biāo)準(zhǔn)硬水稀釋到250mL。經(jīng)過(guò)處理移取5mL于10mL離心管中，不加水稀釋，移取0.5mL至1.5mL離心管中，按照V）；V8三、主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）的分析、綜合報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果法和SDS法，方法均具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，適用于工業(yè)控制分析。四、采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的程度，以及與國(guó)際、國(guó)外同類標(biāo)準(zhǔn)五、與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國(guó)家七、標(biāo)準(zhǔn)作為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)或推薦性標(biāo)準(zhǔn)的建議9八、貫徹標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議（包括組織措施、技術(shù)措施、過(guò)渡辦法等內(nèi)十一、蘇云金桿菌可濕性粉劑產(chǎn)品質(zhì)量測(cè)試數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)水平對(duì)9標(biāo)準(zhǔn)名稱外觀IU/mg毒素蛋白，%潤(rùn)濕時(shí)間，minpH值水分，%細(xì)度，%持久起泡性，mL質(zhì)量保證期本標(biāo)準(zhǔn)灰白色至棕褐色疏松粉末，不應(yīng)有≥32000≥160004.0~7.5≤4.0NY/T4409-2023灰白色至棕褐色疏松粉末，不應(yīng)有≥32000≥160004.0~7.5≤4.0GB/T19567.3-2004灰白色或棕揭色疏松粉末，不應(yīng)有團(tuán)塊≥32000≥160006.0~7.5≤4.0/（毒力效價(jià)及毒素蛋白可降解到70%）帳IU/mg毒素懸浮率，%潤(rùn)濕時(shí)間，spH值水分，%細(xì)度，%持久起//77/s/s//>30℃>30%123蘇云金桿菌可濕性粉劑分析方法研究蘇云金桿菌分析方法研究查詢相關(guān)文獻(xiàn)，參考了原行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)比了WHOspecification770/WG（October2012），經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、對(duì)比后提出。本方法適用于蘇云金桿菌毒方法來(lái)源適用菌種檢測(cè)方法方法摘要本標(biāo)準(zhǔn)蘇云金桿菌鲇澤亞和蘇云金桿菌庫(kù)斯塔克亞種（B.t.k）SDS-PAGE凝膠圖像處理法試樣處理：試樣用水溶解；加入終濃度為0.1mol/L的氫氧化鈉溶液；加入3×樣品稀釋液；沸水浴中煮6min；15000r/min離心5min，取上清液。SDS電泳：上樣量2~10μL；初期電壓100V；待試樣進(jìn)入分離膠后加大電壓到120V。凝膠成像系統(tǒng)：毒素蛋白目標(biāo)區(qū)帶:130kDa。毒力效價(jià)法H.a.為棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)的縮寫(xiě)，也可選擇P.x.和S.e.作為試驗(yàn)蟲(chóng)，試驗(yàn)結(jié)果分別表示為分別毒力效價(jià)（P.x.）和毒力效價(jià)（S.e.但應(yīng)以毒力效價(jià)（H.a.）作為仲裁法。P.x.和S.e.分別為小菜蛾(Plutellaxylostella)和甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)的縮寫(xiě)。WHOspecification770/WG（October2012）蘇云金桿菌以色列亞種（B.t.i）SDS-PAGE凝膠圖像處理法試樣處理：試樣用1M/5mM，NaCl/EDTA溶液溶解；離心后棄上清溶液；用5mMEDTA溶液洗滌2次，離心棄上清液；加入0.1mol/L的氫氧化鈉溶液，取上清液；加入2×樣品稀釋液；沸水浴中煮5min；8000g離心5min，取上清液。SDS電泳：上樣量10~20μL；分離膠濃度10%；凝膠成像系統(tǒng)：毒素蛋白目標(biāo)區(qū)帶:135、70和28kDa。毒力效價(jià)法B.t.i使用埃及伊蚊（Aedesaegypti）作為試蟲(chóng)鈉，邊加入邊攪拌溶解，待充分溶解后，放置1mol/L、pH8.8三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液：稱取三羥基甲基氨基甲1mol/L、pH6.8三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液：稱取三羥基甲基氨基甲再加入3×樣品稀釋液0.325mL，于沸水浴中煮6min，冷卻至室溫，15000r/min制板:選擇兩塊大小一樣的玻璃板，其中一塊一端帶有2~3cm高的凹槽。制備分離膠:從冰箱中取出制膠試劑，平衡至室溫。按表2先配制分離膠。將膠液配好、混勻后，迅速注入兩塊玻璃板的間隙中，至膠液面離玻璃板凹槽勿擾亂膠面。垂直放置膠板于室溫約30min左右使之凝聚。此時(shí)，在凝膠和水///水標(biāo)準(zhǔn)曲線，取6μL的試樣溶液上層清液(毒素蛋白含量約為3μg)加入到上樣孔倒去染色液，先用漂洗液洗滌凝膠，然后加入脫色液，于37℃下加熱使其膠板經(jīng)脫色后，可清晰地看到130kDa蛋白區(qū)帶，用凝膠成像系統(tǒng)掃描該區(qū)）；）；毒素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)兩次平行測(cè)定結(jié)果之相對(duì)差應(yīng)不大于8%，取其算術(shù)平均于聚丙烯酰胺凝膠的上樣孔中分別上樣2，41~5μg)，測(cè)定目標(biāo)蛋白區(qū)帶灰度值，以毒素蛋白質(zhì)量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)蛋白區(qū)帶12345質(zhì)量在1.25μg~6.25μg之間時(shí)，與相應(yīng)的蛋白區(qū)帶灰度值有良測(cè)定次數(shù)12345稱樣量，g0.107480.107700.108090.107620.10814毒素蛋白含量，%6.036.255.885.976.26極差，%0.38平均值，%6.08變異系數(shù)（RSD），%2.80霍維茨值RSDR（Hor），%3.04＞2.8012345平均回收率，%分別選取蘇云金桿菌可濕性粉劑的統(tǒng)一試樣送至不同的實(shí)驗(yàn)室按本方法測(cè)表6不同實(shí)驗(yàn)室可濕性粉劑試樣驗(yàn)證結(jié)果項(xiàng)目單位可濕性粉劑毒素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%沈陽(yáng)沈化院測(cè)試技術(shù)有限公司5.81武漢科