CNAS-CL03-A001-202X《能力驗證提供者認可準則在微生物領域的應用說明》（征求意見稿）

202X年XX月XX日發(fā)布202X年XX月XX日實施202X年XX月XX日發(fā)布202X年XX月XX日實施CNAS-CL03-A001能力驗證提供者認可準則在微生物領域的應用說明GuidanceontheApplicationofAccreditationCriteriaforProficiencyTestingProvidersintheFieldofMicrobiology（上網征求意見稿）中國合格評定國家認可委員會CNAS-CL03-A001:202X第PAGECNAS-CL03-A001:202X第2頁共20頁目 錄前言21范圍32規(guī)范性引用文件33術語和定義34通用要求45結構要求46資源要求47過程要求58結構要求9附錄A（資料性附錄）均勻性和穩(wěn)定性檢驗10附錄B（資料性附錄）統計分析和能力評定14附錄C（資料性附錄）微生物能力驗證統計分析示例17202X年XX月XX日發(fā)布202X年XX月XX日實施202X年XX月XX日發(fā)布202X年XX月XX日實施前 言本文件由中國合格評定國家認可委員會（CNAS）制定，是《能力驗證提供者認可準則》所本文件與CNAS-CL03:2024《能力驗證提供者認可準則》同時使用。CNAS-CL03:2024中章、節(jié)條款號和名稱，對CNAS-CL03:2024在微生物檢測能力驗證計劃的應用說明內容在本文件的附錄A、附錄B和附錄C為資料性附錄，附錄的序號及內容與CNAS-CL03:2024不對應。本文件代替：CNAS-CL03-A001:2019。2019—刪除了對人員培訓和持續(xù)教育計劃的具體要求；—修改了對“能力驗證物品制備”部分的要求；—刪除了“參考文獻”。本文件所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：——CNAS-CL03-A001:2019 能力驗證提供者認可準則在微生物領域的應用說明GB/T27405實驗室質量控制規(guī)范食品微生物檢驗GB/T28043利用實驗室間比對進行能力驗證的統計方法（ISO13528,IDT）SN/T1800 食品與動物飼料微生物學微生物計數水平法30℃時的菌落計數方法(ISO4833,IDT)ISO/TS22117食品和動物飼料微生物能力驗證特定要求和指南(Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs-Specificrequirementsandguidanceforproficiencytestingbyinterlaboratorycomparison)CNAS-CL01檢測和校準實驗室能力認可準則目標微生物能力驗證物品中作為指定分析物的微生物。背景菌群backgroundflora能力驗證物品中與目標微生物競爭或相似的微生物。標準菌株referencestrain至少定義到屬或種水平的菌株，按其特征分類和描述，有明確的來源。（引自GB/T27405-2008，定義3.10）檢出限limitofdetection進行定性微生物檢測時，能檢測到但無法給出精確數值的微生物的最小量。（引自GB/T27405-2008，定義3.14）5結構要求b）涉及病原微生物的能力驗證提供者，應設置生物安全責任人和生物安全監(jiān)6.1總則6.1.2微生物能力驗證提供者或其外部供應商，應具有相應微生物項目的檢測能力，且滿足CNAS-CL01要求。6.2人員6.2.2 無論是否采用外部供應商進行能力驗證物品制備和檢測，從事能力驗證策劃、樣品制備、能力評定崗位的關鍵技術人員要具有微生物樣品制備和檢測的技術能力。授權簽字人應具備微生物學相關專業(yè)碩士研究生以上學歷，組織實施過3次以上微生物實驗室間比對工作經歷，中級以上（含中級）（含），6.3設施和環(huán)境條件6.3.1涉及病原微生物的能力驗證物品制備和處理應滿足所開展微生物制樣、檢測活動生物安全等級的要求。6.3.3能力驗證物品制備及貯存環(huán)境條件應有明確的規(guī)定和相應的監(jiān)控記錄。6.3.5 6.4外部提供的產品和服務6.4.2外部供應商也要符合該應用說明的要求。如微生物能力驗證物品制備采用外部供應商，外部供應商應提供能力驗證物品制備的詳細記錄，見本文件能力驗證物品的制備過程記錄。6.4.4c)菌種的采購和驗收要符合如下要求：——目標微生物通常選用有資質的菌種保藏機構保藏的菌株，也可根據能力驗證的目的使用經過鑒定和確認的其他菌株?！褂们皯_認目標微生物的特性，應根據能力驗證的目標采用適當的標準檢驗方法（如ISO標準、國標或行標）進行確認。當采用其他菌株時，還應對其分類學地位進行鑒定?！糜谀M背景菌群的任何菌株，其特性也應經過鑒定和確認。過程要求7.2能力驗證計劃的設計和策劃7.2.1概述開展新能力驗證計劃前通常應進行預試驗，預試驗應考慮微生物能力驗證物品的設計和制備的關鍵環(huán)節(jié)（直接影響能力驗證計劃質量的過程）。 d）明確目標微生物是定性檢測和/f）采用自然樣品還是人工污染樣品，以及樣品的基質；采用人工污染樣品時，目標微生物的來源和特性，背景菌群的組成，目標微生物和背景菌群的預期含量/范圍；h）能力驗證物品分發(fā)的特殊要求，如確保低溫和生物安全防護措施。穩(wěn)定性試驗的信息可用于選擇最佳的條件來分發(fā)能力驗證物品，比如是否需要使用干冰或冰袋在樣品運輸過程中來降溫，或判斷環(huán)境條件能否接受。制備人工污染樣品時，對目標微生物和背景菌群的要求：——在使用前應確認目標微生物的特性，應根據能力驗證的目標采用適當的標準檢測方法（如ISO標準、國標或行標）進行確認?！糜谀M背景菌群的菌株，其特性也應經過鑒定和確認?！芰︱炞C物品中存在背景菌群尤其是疑似目標微生物時，提供者應考慮背景菌群對目標微生物檢測的影響，應通過確認試驗保證能力驗證物品指定值的準確可靠。i）有防止串通或偽造結果的措施，如多水平、多樣本設計，參加者返回分離到的目標微生物等；u）病原性微生物能力驗證物品破損或泄露時應采取的無害化處理方式。2統計設計方案中，可包括以下內容：a）統計設計應考慮微生物的水平和分布，同時應考慮參加者的數量和不同檢測方法上可能存在的差異。注1：開展過多輪次定量微生物能力驗證計劃的提供者，可使用經驗值作為能力評定標準差來評價參加者的能力。注2:通常最大可能數（mostprobablenumber,MPN）計數方法和平板菌落計數方法具有不同的重復性。在同一定量計劃中，如兩種方法的重復性差異較大影響能）注3:定性微生物能力驗證計劃通常直接將參加者結果與指定值進行比較，兩者相同能力評價視為滿意，不相同視為不滿意。e）用于確定能力評定標準差（標準偏差、標準化四分位距、經驗值、方法中給定的精密度或先前能力驗證獲得的統計結果等）或其它評定準則的程序（參見附錄B）；f)若允許參加者使用自己選擇的方法，適用時，能力驗證提供者應制定政策并按程序對不同原理的方法得到的結果進行比對。注:附錄C.3給出了結果統計和能力評定示例。提供者應將確定微生物定性和定量計劃指定值（平均值、中位值、穩(wěn)健平均值等）的程序形成文件，包括確定的原因。7.3能力驗證物品的制備和分發(fā)應建立微生物能力驗證物品的制備、儲存、處置的程序，包括檢畢能力驗證物品和剩余能力驗證物品的處理。制備過程記錄內容應包括：——能力驗證物品目標菌、背景菌和所用的基質及處理方式；——能力驗證物品目標菌和背景菌的確認記錄；——添加（污染）微生物的記錄；——制備能力驗證物品的主要儀器設備名稱；——制備工藝（能力驗證物品為凍干粉時應包括冷凍干燥記錄）；——能力驗證物品的數量（要考慮完成結果評價之后，參加者對能力驗證物品穩(wěn)定性質疑時，自行復查或共同復查時對能力驗證物品的需求）；——能力驗證物品制備環(huán)境監(jiān)測記錄；——消毒滅菌記錄。注：當自然樣品無法滿足能力驗證目標和目的要求時，應采用人工污染樣品。人工污染樣品中的目標微生物和背景菌等應盡可能與日常檢測樣品相似；設計目標微生物水平應考慮微生物的方法檢出限和在同類樣品中微生物常規(guī)檢出水平；當目標微生物是致病菌時，應考慮對人體健康的危害水平和安全標準中微生物的限量水平。在定性計劃中設定目標微生物方法檢出限時，由于微生物本身的特性和添加的技術手段的局限性，目標微生物水平通常設定在略高于常規(guī)方法的檢出限，以有利于準確考察參加者的能力。如果目標微生物水平設定過高，不利于完整考察實驗室的技術能力，尤其是在篩選、選擇分離和鑒定階段的能力。32對定量和定性能力驗證物品，應建立均勻性和穩(wěn)定性判定原則(參見附錄A)：注:附錄C.1給出了均勻性評估示例，附錄C.2給出了穩(wěn)定性評估示例。微生物能力驗證物品應進行穩(wěn)定性評估。必要時，應將穩(wěn)定性量化，并考慮作為能力驗證物品指定值不確定度的補充分量，在能力評定中予以考慮。穩(wěn)定性評定應考慮貯存和運輸期間的穩(wěn)定性：——儲存穩(wěn)定性評估。穩(wěn)定性期限應是從能力驗證物品制備起至規(guī)定的檢測日期或檢測時段。應在儲存期間定期核查低溫下（儲存的能能力驗證提供者應控制微生物能力驗證物品的包裝，確保符合國家、地區(qū)35b）給參加者的指導書應包括以下內容：微生物的添加（污染）方式，能力驗證物品基質類型及其主要成份。如果能力驗證物品基質含有抑制微生物復蘇的成分（某些基質材料能結合和滯留細胞，如脂性材料d）對于病原微生物能力驗證計劃，提供者應有文件化的政策，告知參加者注意風險并確保給出相關安全建議。8.1一般要求8.1.2適用時，能力驗證提供者應制定病原微生物安全規(guī)章制度，確保生物安全。8.3管理體系文件的控制8.3.2適用時，文件控制程序應包括基于病原微生物安全考慮的現場文件的管理。8.4記錄控制8.4.1適用時，記錄控制程序應包括基于病原微生物安全考慮的質量/技術記錄的管理。8.8.2適用時，內部審核應涵蓋能力驗證提供者病原微生物安全的內容。8.9管理評審8.9.2適用時，評審應考慮到生物安全規(guī)章制度的執(zhí)行情況。CNAS-CL03-A001:202X第PAGECNAS-CL03-A001:202X第10頁共20頁附錄A（資料性附錄）均勻性和穩(wěn)定性檢驗通常從微生物能力驗證物品總體中隨機抽取10個或10個以上樣品進行均勻性檢驗，每個樣品在重復條件下至少測試兩次。將測試數據轉換為以10為底的對數值后進行均勻性評價。微生物水平較高時，可使用單因子方差分析和Ss≤0.3σ準則（Ss為樣品間標準差，σ為能力評定標準差）進行評價（GB/T28043）。當開展一項新的能力驗證計劃時，通常σ0.3σ確認樣品是否均勻。如σ，比如根據經驗值或先期同類能力驗證計劃獲得的σ值，可利用Ss≤0.3σ當微生物水平較低時，樣品間微生物計數差異可能會比較大，可能不滿足Ss≤0.3σ的要求，在后續(xù)評價參加者能力時可考慮在能力評定標準差中加入樣品10/gi(i=12mj（jn品的試均值 全部品測的平值CNAS-CL03-A001:202X第PAGECNAS-CL03-A001:202X第11頁共20頁測試總次數樣品間平方和均方SS2=樣品間平方和均方SS2=樣品內平方和MS2=均方自由度n1=m-1n2=N-m統計量

MS1=若F＜自由度（n1，n2）及給定顯著性水平α（通常α=0.05）的臨界值Fα(n1n2(F)表1F分布表P{F(n1,n2)>Fα(n1,n2)}=α α=0.05n1n289101112131415161718192093.233.183.143.103.073.053.033.012.992.972.962.952.94103.072.982.942.912.892.862.852.832.812.802.792.77112.952.902.852.822.792.762.742.722.702.692.672.662.65122.852.802.752.722.692.662.642.622.602.582.572.562.54132.772.712.672.632.602.582.552.532.512.502.482.472.46142.702.652.602.572.532.512.482.462.442.432.412.402.39152.642.592.542.512.482.452.422.402.382.372.352.342.33162.592.542.492.462.422.402.372.352.332.322.302.292.28172.552.492.452.412.382.352.332.312.292.272.262.242.23182.512.462.412.372.342.312.292.272.252.232.222.202.19192.482.422.382.342.312.282.262.232.212.202.182.172.16202.452.392.352.312.282.252.232.202.182.172.152.142.12（摘自GB4086.4-1983統計分布數值表F分布）Ss準則m性條件下測試j次（j=1、2n）A.1.1.1MS1、MS2。若每個樣品的重復測試次數均為n次。按下式計算樣品之間的不均勻性標準偏差Ss：式中：MS1—樣品間均方；2—樣品內均方；n—測量次數。若Ss≤0.3σ，則使用的樣品可以認為是均勻的。通常從微生物能力驗證物品總體中隨機抽取足夠具有代表性的品進行穩(wěn)定性10檢驗法按下式計算t值：式中：x1—第一次測試數據的平均值；x2—第二次測試數據的平均值；s1—第一次測試數據的標準偏差；s2—第二次測試數據的標準偏差；sCNAS-CL03-A001:202X第PAGECNAS-CL03-A001:202X第15頁共20頁n1—第一次測試次數；n2—第二次測試次數注：為了保證平均值和標準偏差的準確度，n1和n2均≥6。(n+nt+一2 (n+n122t分布表），則兩個平均值之間無顯著差異，表明樣品是穩(wěn)定的。2 tP{t(n)>tα(n)}=αα0.025 （單側檢驗）自由度10111213141516171819臨界值2.22812.20102.17882.16042.14482.13152.11992.10982.10092.0930自由度20212223242526272829臨界值2.08602.07962.07392.06872.06392.05952.05552.05182.04842.0452自由度30313233343536373839臨界值2.04232.03952.03692.03452.03222.03012.02812.02622.02442.0227自表 tx一y≤0.3σx一y≤0.3σ1若成立，則認為樣品是穩(wěn)定的。1式中：x—均勻性檢驗的總平均值y—穩(wěn)定性檢驗的測試平均值。注：取樣數≥3，每次單獨取樣。測試方法與均勻性檢驗相同。對于定性計劃樣品的均勻性和穩(wěn)定性檢驗，其取樣和測試程序基本上和定量計劃相同，通常核查測試結果是否和樣品制備時指定值一致，如一致可判定樣品滿足要求，如不一致可判定為不滿足要求，需核查原因或重新制樣。另外，也可利用以上定量計劃的評定準則，采用目標微生物和背景菌群計數來進行均勻性和穩(wěn)定性評定。B統計分析和能力評定對于微生物定量計劃，確定指定值最常用的方法是利用參加者的公議值來確定，由所有參加者結果的穩(wěn)健平均值或中位值給出。能力評定標準差的確定有多種方法，如標準偏差、標準化四分位距、經驗值或先期能力驗證獲得的統計結果等。/）Z如參加者使用的是MPN計數方法，應考慮和平板計數法的方法差異，可采用經驗值進行能力評定。利用Z值評定ZσZZ值z=其中x為參加的結果，X為指定值,σ能力評定標準差。應用Z值評定準則如下：|zz|z利用臨界值（CD值）評定當參加者使用的測試方法有可靠的重復性限r和再現性限R時,可根據GB/T6379，按下式計算CD值：參加者在重復條件下n次測試的平均值x與指定值X之差|x—X|小于臨界值CD值，則參加者的結果為滿意結果，否則為不滿意結果。注：重復性限r8r，再現性限為RR，r為測試方法的重復性σ標準差，R為測試方法的再現性標準差。根據ISO4833，常規(guī)30℃需氧培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基上的菌落計數，其方法重復性限r為0.25，再現性限R為0.45，計算CD值約為0.29。σ通常，微生物實驗室質量控制要求重復計數不超過0.5對數單位，符合該要求表明質量控制良好。當參加者使用的是平板菌落計數方法時，圍繞平均菌落計數值力驗證統計評價，參加者結果在對數中位值±0.5范圍內可認為是滿意結果（ISO/TS22117)。能力評定準則如下：——結果不超出對數中位值±0.5范圍：滿意——結果落在對數中位值±0.5范圍外：不滿意MPN3×33×5MPN結果對數值的標準差約為0.24。在理想情況下，95%的結果將會落在指定值±2σ以內，而超過99%的結果會落在指定值±3σ以內，σ為標準差。然而，實踐中仍存在實驗室間變異。大量分（倍MPN計數結果的接受限應增加到±3σ和±5σ（ISO/TS22117)MPN表3MPN對數值接受限接受限3×3管法3×5管法±3σ±0.96±0.72±5σMPN計數方法結果評定準則如下：——在指定值±3σ（含邊界）范圍內：滿意——在指定值±3σ和指定值±5σ（不含邊界）范圍內：有疑問——在指定值±5σ（含邊界）范圍外：不滿意注：隨著參加者對MPN計數方法的逐漸熟練和參加者總體水平的提高，參加者MPN計數值之間的變異會逐漸減小，趨近于方法本身的變異，評價參加者結果的MPN對數值接受限可根據實際情況縮小。如英格蘭衛(wèi)生局經過兩年多輪次能力驗證計劃運作之后，將參加者MPN對數值接受限分別縮小至±2.68σ和±4σ。附錄C（資料性附錄）微生物能力驗證統計分析示例以某次乳粉中菌落總數測定能力驗證為例。參加者使用的測試方法為ISO4833能力驗證物品（凍干粉）分裝后隨機抽取10個樣品，每個樣品重復測試2次，測定結果見表4。表4菌落總數測試結果（CFU/g）測試次數樣品號測試結果x1測試結果x2x1對數轉換值x2對數轉換值150000420004.6994.623253000510004.7244.708360000540004.7784.732447000400004.6724.602550000560004.6994.748643000510004.6334.708745000480004.6534.681846000520004.6634.716948000470004.6814.6721043000500004.6994.623總平均值4.685單因子方差分析結果見表5。表5方差分析結果方差來源自由度平方和均方F樣品間90.0230.00251.67樣品內100.0150.0015F臨界值F0.05(9,10)=3.02。計算的F值為1.67，該值＜臨界值，這初步表明在0.05顯著性水平時，樣品中的細菌分布是均勻的。也可用A.1.1.2 Ss≤0.3σ則計算品之的不勻標偏差Ss為檢驗的第一次測試數據。模擬運輸條件放置30天后進行第二次測試。每個樣品在6表6模擬運輸條件放置30天后測試結果（CFU/g）樣品號測試結果第1次第2次第1次對數值第2次對數值142000440004.6234.643248000500004.6814.699345000500004.6534.699451000490004.7084.690556000530004.7484.724統計分析結果見表7。表7t檢驗分析結果x1x2s1s2n1n2t4.6854.6870.0450.03820100.120.0528t0.05(28)2.05A.1.2.1式計算t21x-y≤0.3σ也可用A.1.2.2 則