第九章 進(jìn)化酶課件

第九章進(jìn)化酶第九章進(jìn)化酶主要內(nèi)容天然酶的應(yīng)用及局限性酶的定向進(jìn)化的思想酶的定向進(jìn)化的策略和方法酶的定向進(jìn)化技術(shù)的展望

第九章進(jìn)化酶

生物體系之所以能夠相對(duì)獨(dú)立地存在于自然界中，并維持其獨(dú)立性和生命的延續(xù)性，都是因?yàn)樯矬w內(nèi)的一系列酶在發(fā)揮著作用。酶保證了生物體內(nèi)組成生命活動(dòng)的大量生化反應(yīng)得以按照預(yù)定的方向有序、精確而順利地進(jìn)行，幾乎所有生物的生理現(xiàn)象都與酶的作用緊密相關(guān)，可以這樣說，沒有酶的存在，就沒有生物體的一切生命活動(dòng)。

天然酶的作用第九章進(jìn)化酶

利用酶作為催化劑進(jìn)行生物催化與生物轉(zhuǎn)化，已成為生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品、手性藥物、食品添加劑等的重要工具,獲得了廣泛應(yīng)用。第九章進(jìn)化酶

隨著酶催化應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大和研究的逐步深入，研究者發(fā)現(xiàn)，酶催化的精確性和有效性常常不能很好地滿足酶學(xué)研究和工業(yè)化應(yīng)用的要求，而且天然酶的穩(wěn)定性差、活性低使催化效率很低，還缺乏有商業(yè)價(jià)值的催化功能天然酶的局限

天然酶的局限性源于酶的自然進(jìn)化過程。第九章進(jìn)化酶現(xiàn)代生物工程的要求

能具備長(zhǎng)期穩(wěn)定性和活性能適用于水及非水相環(huán)境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能夠在特殊環(huán)境中合成和拆分制作新藥物或藥物的原材料第九章進(jìn)化酶

如何利用相對(duì)簡(jiǎn)單的方法以達(dá)到對(duì)天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶就顯得非常有研究意義和應(yīng)用前景。第九章進(jìn)化酶

1993年,美國(guó)科學(xué)家ArnoldFH首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念，并用于天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶。蛋白質(zhì)定向進(jìn)化概念的提出第九章進(jìn)化酶

人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外對(duì)基因進(jìn)行隨機(jī)突變，從一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存在的親本酶（天然的或者人為獲得的）出發(fā)，經(jīng)過基因的突變和重組，構(gòu)建一個(gè)人工突變酶庫(kù)，通過一定的篩選或選擇方法最終獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進(jìn)化酶。定向進(jìn)化技術(shù)第九章進(jìn)化酶定向進(jìn)化的原理第九章進(jìn)化酶定向進(jìn)化＝隨機(jī)突變＋選擇第九章進(jìn)化酶隨機(jī)突變的策略易錯(cuò)PCR技術(shù)(error-pronePCR)DNA改組(DNAshuflling)：由美國(guó)Stemmer于1994年首次提出一項(xiàng)體外重組技術(shù)體外隨機(jī)引發(fā)重組(RPR)：1998年,Arnold提出了一種有效的新方法交錯(cuò)延伸技術(shù)(StEP)：由Zhao等提出,是一種簡(jiǎn)化的DNAshuffling技術(shù)

第九章進(jìn)化酶易錯(cuò)PCR易錯(cuò)PCR（errorpronePCR）是指在擴(kuò)增目的基因的同時(shí)引入堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變，形成突變體庫(kù)，然后通過選擇或篩選獲得所希望的突變體。連續(xù)易錯(cuò)PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即將一次PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘變。第九章進(jìn)化酶DNA改組

DNA改組(DNAshuffling)又稱有性PCR(sexualPCR)，原理如圖所示。第九章進(jìn)化酶體外隨機(jī)引發(fā)重組

體外隨機(jī)引發(fā)重組(randompriminginvitrorecombination,RPR)以單鏈DNA為模板，配合一套隨機(jī)序列引物，先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短DNA片段，由于堿基的錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會(huì)有少量的點(diǎn)突變，在隨后的PCR反應(yīng)中，它們互為引物進(jìn)行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長(zhǎng)度。第九章進(jìn)化酶交錯(cuò)延伸

交錯(cuò)延伸(staggerextensionprocess,StEP)在PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步,縮短其反應(yīng)時(shí)間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過程反復(fù)進(jìn)行，直到產(chǎn)生完整的基因長(zhǎng)度。第九章進(jìn)化酶定向進(jìn)化的篩選策略瓊脂板涂布法在特殊條件下培養(yǎng)突變菌，通過宿主菌的生長(zhǎng)情況、培養(yǎng)基顏色、特定反應(yīng)的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因。微孔板懸浮法在含生色底物平板上培養(yǎng)，挑取具有活性的克隆接種到96孔板上檢測(cè)吸光度。使用微流控芯片。微球細(xì)胞固定法與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合，將單個(gè)細(xì)胞附著在單個(gè)固體珠上，突變體進(jìn)行分離和篩選。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動(dòng)系統(tǒng)，排成單行，逐個(gè)通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行測(cè)定。突變體分離第九章進(jìn)化酶通過酶促反應(yīng)的特征加入底物顯色熒光共振能量轉(zhuǎn)移同位素標(biāo)記底物通過檢測(cè)底物消耗或產(chǎn)物生成進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)酶檢測(cè)信號(hào)探測(cè)分光光度計(jì)和熒光酶標(biāo)儀氣相色譜和高效液相色譜質(zhì)譜和核磁第九章進(jìn)化酶定向進(jìn)化與自然進(jìn)化的異同點(diǎn)定向進(jìn)化的實(shí)質(zhì)是達(dá)爾文進(jìn)化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用。定向進(jìn)化是在體外模擬突變、重組和選擇的自然進(jìn)化，使進(jìn)化朝著人們需要的方向發(fā)展。兩者的不同：進(jìn)化動(dòng)力不同：保守突變非保守取代；進(jìn)化方向不同：適應(yīng)突變的積累；進(jìn)化速度不同：非常漫長(zhǎng)只需幾年、甚至幾天；

進(jìn)化目標(biāo)不同：適應(yīng)環(huán)境超越生物學(xué)意義的要求，探索所希望的蛋白質(zhì)在順序空間的可及性。

第九章進(jìn)化酶定向進(jìn)化技術(shù)Fig.1.Publicationrateofthe‘directedevolution’articlesinbiomedicalliteraturebetween1995and2004.TheanalysiswasachievedusingtheNationalInstitutesofHealthMEDLINEbibliographicdatabase.Thefigureshowsthetotalnumberofarticlespublishedeachyear,whichcontainthekeywords‘directedevolution’intheirtitles.第九章進(jìn)化酶目標(biāo)酶所需功能方法結(jié)果實(shí)施菌種卡那霉素核苷基轉(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性定位誘變+選擇在60-50℃酶半衰期增加200倍耐熱脂肪芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶作用于有機(jī)溶劑易錯(cuò)PCR+選擇在60％二甲基亞砜主仆女冠活力增強(qiáng)170倍枯草桿菌β-內(nèi)酰胺酶作用于新底物DNA改組+選擇對(duì)cefotaxime的抗性增加32000倍大腸桿菌對(duì)硝基苯酯酶有機(jī)溶劑中的底物特異性和活性易錯(cuò)PCR+重組活力增加60-150倍大腸桿菌胸苷激酶第五特異性基因理療交錯(cuò)延伸+選擇活力增加43倍大腸桿菌β-半乳糖苷酶底物特異性DNA改組+選擇活力增加66倍底物特異性增加1000倍大腸桿菌砷酸脫毒途徑砷酸抗性DNA改組+選擇抗性增加12倍大腸桿菌定向進(jìn)化的應(yīng)用第九章進(jìn)化酶展望

總之，具有新功能和特性的酶可以通過從