第十四章 免疫學檢測技術課件

第十四章免疫學檢測技術第十四章免疫學檢測技術第十四章免疫學檢測技術抗原和抗體可以發(fā)生高度專一性的結合第十四章免疫學檢測技術

抗原和抗體可以發(fā)生高度專一性的結合第十四章免疫學檢測技術抗原和抗體可以發(fā)生高度專一性的結合第十四章免疫學檢測技術抗原或抗體檢測原理：借助抗原和抗體在體外特異結合后出現的各種現象，對標本中的抗原或抗體進行定性或定量的檢測。Equivalence–Latticeformation抗原和抗體可以發(fā)生高度專一性的結合第十四章免疫學檢測技術抗原或抗體檢測原理第十四章免疫學檢測技術免疫學（Immunology）：是研究抗原性物質、免疫系統、免疫應答的規(guī)律及免疫應答的調節(jié)的一門科學。免疫的定義（Immunity）：免疫是機體識別自我與非自我的過程。排除異己，維護自身穩(wěn)定的生理反應。第十四章免疫學檢測技術免疫的功能：1.抵抗感染（Defense）：機體能抵抗病原微生物侵襲的能力。又稱免疫防御?？咕?、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲免疫2.自身穩(wěn)定（Homeostasis）：機體在新陳代謝過程中，產生大量的衰老死亡細胞，免疫的第二個功能就是清除這些細胞，維持機體的生理平衡。3.免疫監(jiān)視（Immunologicalsurveillance）：機體細胞會因物理、化學和病毒等生物因素的影響，使細胞發(fā)生癌變，形成腫瘤等，機體可識別、清除這些細胞，這是免疫系統的第三個功能。當這一功能低下或失調時，會導致腫瘤或癌癥。第十四章免疫學檢測技術抗原（Antigen）抗原概念凡能刺激機體產生特異性抗體和致敏淋巴細胞，并能與相應抗體或致敏淋巴細胞在體內或體外發(fā)生反應的物質?？乖裕ˋntigenicity）：包括免疫原性和反應原性二個方面免疫原性：抗原能刺激機體產生抗體和致敏淋巴細胞的性能。反應原性：抗原與特異性抗體或致敏淋巴細胞在體內或體外發(fā)生反應的性能。第十四章免疫學檢測技術抗原（Antigen）構成抗原的條件1.異物性：機體免疫細胞能識別自身和異己物質，只有外源性的物質才具有免疫原性，產生免疫反應。親緣關系越遠，差異越大，抗原性越強。自身抗原：自身組織發(fā)生異常變異、免疫功能紊亂、眼球晶體蛋白、精子蛋白、甲狀腺蛋白大分子膠體：一般在10kD以上。

3.具有復雜的立體結構或空間構象.

如明膠分子量雖然為100kD，但結構簡單，免疫原性差。第十四章免疫學檢測技術抗原如何被識別抗原的特異性抗原決定簇：抗原分子表面具有免疫活性的化學基因,是抗原與抗體結合的部位?？乖肿又锌乖奶禺愋杂煽乖瓫Q定簇決定。第十四章免疫學檢測技術第十四章免疫學檢測技術一種細菌可以刺激多少種抗體產生？抗原第十四章免疫學檢測技術一種細菌可以刺激多少種抗體產生？根據抗原的化學性質分：天然抗原：微生物及其產物抗原如菌體抗原（O抗原）鞭毛抗原（H抗原）表面抗原（如大腸桿菌的K抗原）細菌的毒素抗原病毒抗原（V抗原）人工抗原：人工合成多肽、蛋白等第十四章免疫學檢測技術抗體（Antibody)

一、概念是抗原刺激B淋巴細胞,使之增殖分化成漿細胞而產生的能與抗原發(fā)生特異性反應的免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)第十四章免疫學檢測技術抗體（Antibody)

一、概念二、免疫球蛋白的基本結構免疫球蛋白：在人和動物血液、組織液及其他分泌液中的一類結構相似的球蛋白。1.由4條肽鏈組成：2條重鏈，2條輕鏈2.一個抗體單分子：2個抗原結合位點第十四章免疫學檢測技術抗體（Antibody)第十四章免疫學檢測技術抗體（Antibody，Ab)免疫球蛋白的雙重性免疫球蛋白是一種蛋白質，是抗體(Ab1)；同時又可引起機體產生抗體（抗抗體,Ab2），所以既是抗體又是抗原。

AgAb1Ab2

第十四章免疫學檢測技術第十四章免疫學檢測技術抗體（Antibody，Ab)免疫球蛋白的雙重性免疫球蛋白的功能

1.與抗原結合

2.激活補體

3.組織結合

4.調理作用

5.抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC）第十四章免疫學檢測技術免疫球蛋白的功能

第十四章免疫學檢測技術抗體（Antibody)的產生與功能

第十四章免疫學檢測技術抗體產生的主要過程抗體第十四章免疫學檢測技術第十四章免疫學檢測技術注射抗原（如類毒素）血清抗體？抗原？

抗體的制備第十四章免疫學檢測技術抗體的制備抗血清：指抗原人工免疫實驗動物，獲得含特異性抗體的血清。多克隆抗體(PAb)：多個抗原決定簇免疫機體所產生的多種抗體的混合物。單克隆抗體（monoclonalantibody，MAb）：只針對某一特定的抗原決定簇，純度高的抗體。第十四章免疫學檢測技術多克隆抗體與單克隆抗體第十四章免疫學檢測技術多克隆抗體與單克隆抗體的制備第十四章免疫學檢測技術單克隆抗體的制備

骨髓瘤細胞脾臟淋巴細胞（HGPRT-TK-)（HGPRT+TK+）在HAT中不能生長體外培養(yǎng)過程中死亡↓←PEG

雜交瘤細胞

(HGPRT+、TK+)↓

在HAT中大量長期繁殖↓克隆化↓產生單抗

第十四章免疫學檢測技術第一節(jié)免疫學檢測技術原理

抗原或抗體檢測原理：

抗原抗體的結合具有高度專一性

借助抗原和抗體在體外特異結合后出現的各種現象，對標本中的抗原或抗體進行定性或定量的檢測。第十四章免疫學檢測技術對抗原或抗體進行定性或定量的檢測的原理AbexcessAgexcessEquivalence–Latticeformation第十四章免疫學檢測技術對抗原或抗體進行定性或定量檢測的原理

根據抗原抗體形成的免疫復合物的濃度進行定量檢測。P312第十四章免疫學檢測技術第一節(jié)免疫學檢測技術原理

可作為抗原進行檢查的物質：微生物及其大分子產物人和動物細胞人和動物體內的各種大分子各種半抗原第十四章免疫學檢測技術抗原或抗體檢測原理第十四章免疫學檢測技術較早的抗原抗體反應檢測方法1、凝集反應（Agglutination)2、沉淀反應(Precipitation)3、補體結合試驗(Complementfixationtest)4、中和試驗(Neutralizationtest)第十四章免疫學檢測技術

一、凝聚反應(Agglutination)

二、沉淀反應

1、溶液中的沉淀反應

2、凝膠擴散沉淀

3、免疫電泳血清免疫電泳火箭電泳對流免疫電泳

三、補體參與的反應四、免疫標記的抗原抗體技術酶聯免疫吸附（ELISA）第十四章免疫學檢測技術一、凝集反應

凝集反應是指顆?？乖c相應抗體結合反應出現的可見性現象。顆?？乖缤暾募毦?、紅細胞等與相應抗體相混合，在一定條件下出現凝集。凝集反應中抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。第十四章免疫學檢測技術一、凝集反應

凝集反應是指顆?？乖c相應抗體結合反應出現的可見性現象。顆?？乖缤暾募毦?、紅細胞等與相應抗體相混合，在一定條件下出現凝集。第十四章免疫學檢測技術二、沉淀反應

當抗原是可溶性分子時，與抗體結合則形成沉淀。1、絮狀沉淀反應一系列試管中加入等量的抗體和遞增量的抗原，在中性條件下37度保溫1-2h，便可見到絮狀的蛋白質沉淀。可用于尋找抗原抗體反應的合適比例，檢測抗原抗體的分子比。2、環(huán)狀沉淀反應在試管中加入抗體后，小心加入相應抗原，使抗原抗體步混合，37度保溫10-20min，在二者界面上出現環(huán)狀沉淀。不能用于定量測定。第十四章免疫學檢測技術3、雙向擴散：又稱瓊脂擴散，是利用瓊脂凝膠作介質的一種沉淀反應。瓊脂是多孔的網狀結構，可使大分子物質通過，分子的擴散作用使分別兩處的抗原抗體相遇，比例合適時形成沉淀?？捎^測到沉淀弧。沉淀弧的特征與位置取決于抗原分子的大小、結構、擴散系數和濃度等。當抗原、抗體存在多種體系時，會出現多條沉淀弧。二、沉淀反應第十四章免疫學檢測技術雙向擴散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在普通載玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗體用于測定抗體效價，中心孔滴入抗體，外周孔滴入抗原，用于檢測抗原的存在和定性抗原。第十四章免疫學檢測技術二、沉淀反應

抗原抗體為單一體系時，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同：抗原抗體為多體系時，出現的沉淀弧有多條，彼此互不干擾。第十四章免疫學檢測技術4、單向免疫擴散：又稱單向瓊脂擴散，是定量抗原的一種檢測方法。與雙向擴散不同的是在瓊脂中含有一定量的抗體，孔內加入未知量的相應抗原。在37度保溫過程中，孔內的抗原向周圍擴散，與抗體形成沉淀圈。根據沉淀圈的大小確定抗原的含量二、沉淀反應第十四章免疫學檢測技術二、沉淀反應

另外還有其他眾多的免疫檢測技術和手段，其機理都利用了抗原抗體的沉淀反應。例如微量免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳等。第十四章免疫學檢測技術免疫電泳第十四章免疫學檢測技術二、抗原或抗體檢測的現代方法：

P3121.免疫熒光技術2.酶聯免疫分析法3.放射免疫分析法第十四章免疫學檢測技術第一節(jié)免疫學檢測技術原理

二、抗原或抗體檢測的方法：免疫熒光技術

將結合有熒光素的熒光抗體進行抗原抗體反應的技術

常用的熒光素有異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC)和羅丹明（rhodamineB200,RB200)等。它們可與抗體球蛋白中賴氨酸的氨基結合，在藍紫光激發(fā)下，可分別出現鮮明的黃綠色及玫瑰紅色。第十四章免疫學檢測技術第一節(jié)免疫學檢測技術原理

二、抗原或抗體檢測的方法：免疫熒光技術直接熒光法間接熒光法

第十四章免疫學檢測技術第一節(jié)免疫學檢測技術原理二、抗原或抗體檢測的現代方法：

P3132.酶聯免疫分析法3.放射免疫分析法第十四章免疫學檢測技術第二節(jié)免疫熒光技術在食品檢測中

的應用

一、基本原理：將試劑抗原或試劑抗體用熒光素進行標記，試劑與標本中相應的抗體或抗原反應后，測定復合物中的熒光素，這種免疫技術，稱為免疫熒光素技術。第十四章免疫學檢測技術第二節(jié)免疫熒光技術在食品檢測中

的應用

一、基本原理：免疫熒光素技術第十四章免疫學檢測技術第二節(jié)免疫熒光技術在食品檢測中

的應用二、抗體的熒光標記P315（一）熒光抗體的制備攪拌法透析法（二）熒光抗體的鑒定鑒定指標：效價、熒光素與蛋白質的結合比率第十四章免疫學檢測技術第二節(jié)免疫熒光技術在食品檢測中

的應用三、標本的制作P316

食品衛(wèi)生檢驗中，熒光標記抗體檢測標本的制作方法是將樣品增菌液涂在載玻片上，涂片應薄而均勻，干燥后用化學方法固定，然后進行熒光染色。第十四章免疫學檢測技術第二節(jié)免疫熒光技術在食品檢測中的應用五、熒光顯微鏡檢查?染色當天即作鏡檢?通風良好的暗室內進行?選擇好光源或濾光片第十四章免疫學檢測技術第二節(jié)免疫熒光技術在食品檢測中的應用五、熒光顯微鏡檢查?染色當天即作鏡檢?通風良好的暗室內進行?選擇好光源或濾光片第十四章免疫學檢測技術第二節(jié)免疫熒光技術在食品檢測中的應用

四、熒光抗體染色方法直接法間接法第十四章免疫學檢測技術第二節(jié)免疫熒光技術在食品檢測中的應用四、熒光抗體染色方法

直接法間接法第十四章免疫學檢測技術

使用了兩種抗體：一抗、二抗

二抗如何獲得？第十四章免疫學檢測技術第二節(jié)免疫熒光技術在食品檢測中

的應用六、在食品檢驗中的應用P317

免疫熒光檢測技術已經廣泛應用于醫(yī)藥衛(wèi)生領域，可檢測細菌、病毒、寄生蟲等，在食品衛(wèi)生領域也應用的越來越多。第十四章免疫學檢測技術第三節(jié)免疫酶技術在食品檢測中的應用

一、基本原理P319

利用酶催化底物反應的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學反應的檢測敏感性的一種標記免疫技術。酶聯免疫吸附劑測定enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA第十四章免疫學檢測技術第三節(jié)免疫酶技術在食品檢測中的應用ELISA基本原理

①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。

②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

第十四章免疫學檢測技術第三節(jié)免疫酶技術在食品檢測中的應用ELISA基本原理

在測定時，把受檢酶標抗體或抗原和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。第十四章免疫學檢測技術第三節(jié)免疫酶技術在食品檢測中的應用ELISA基本原理堿性磷酸酶或過氧化物酶第十四章免疫學檢測技術第三節(jié)免疫酶技術在食品檢測中的應用酶聯免疫吸附劑測定enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA二、ELISA的種類P320直接法測定抗原間接法測定抗體雙抗體夾心法測定抗原雙抗原夾心法測定抗原競爭法測定抗原第十四章免疫學檢測技術第三節(jié)免疫酶技術在食品檢測中的應用第十四章免疫學檢測技術第三節(jié)免疫酶技術在食品檢測中的應用二、ELISA的種類雙抗原夾心法測定抗原第十四章免疫學檢測技術第三節(jié)免疫酶技術在食品檢測中的應用二、ELISA的種類雙抗體夾心法測定抗原第十四章免疫學檢測技術第十四章免疫學檢測技術第十四章免疫學檢測技術ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。（一）雙抗體夾心法

第十四章免疫學檢測技術ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體?？稍O計出各種不同類型的檢測方法。（一）雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。（2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。（3）加酶標抗體：（4）加底物：第十四章免疫學檢測技術（一）雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：

（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：（2）加受檢標本：（3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。（4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。第十四章免疫學檢測技術二、ELISA的種類雙抗體夾心法測定抗原第十四章免疫學檢測技術三、抗體的酶標記P321?戊二醛法?過碘酸鹽氧化法第三節(jié)免疫酶技術在食品檢測中的應用第十四章免疫學檢測技術第三節(jié)免疫酶技術在食品檢測中的應用四、酶與底物酶與抗原、抗體或半抗原在交聯劑作用下連接。是ELISA成敗的關鍵試劑。P323表14-1五、固相載體最常用的是聚苯乙烯

ELISA載體的形狀主要有三種：小試管、小珠、微量反應板（酶標板）第十四章免疫學檢測技術第十四章免疫學檢測技術第三節(jié)免疫酶技術在食品檢測中的應用六、最適工作濃度的選擇以夾心法測抗原為例，可用棋盤滴定法。P323表14-2第十四章免疫學檢測技術第三節(jié)免疫酶技術在食品檢測中的應用七、ELISA測定方法

1、加樣

2、保溫

3、洗滌

4、比色

5、結果判定第十四章免疫學檢測技術第三節(jié)免疫酶技術在食品檢測中的應用封閉P330

封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的操作與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，可以高濃度使用（5%）。第十四章免疫學檢測技術采用酶標法（ELISA）進行三聚氰胺檢測

ThermoMK3型酶標儀第十四章免疫學檢測技術

酶標儀原理與結構

第十四章免疫學檢測技術第三節(jié)免疫酶技術在食品檢測中的應用八、酶免疫技術在食品檢驗中的應用?用于細菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生蟲的檢測。?用于蛋白質、激素、其他生理活性物質、藥物殘留、抗生素等的檢測。?應用實例：ELISA法檢測致瀉性大腸埃希氏菌腸毒素。第十四章免疫學檢測技術常規(guī)鑒定ELISA法檢測致瀉性大腸埃希氏菌腸毒素第十四章免疫學檢測技術ELISA法檢測腸毒素第十四章免疫學檢測技術

第四節(jié)放射免疫技術在食品檢測中的應用

第十四章免疫學檢測技術標記免疫分析技術用標記示蹤技術觀察抗原抗體一級反應的分析方法特點：敏感性高，反應時間短，可用儀器檢測結果三大標記免疫分析技術：

放射免疫、熒光免疫、酶免疫

檢測方法檢測范圍生化、常規(guī)免疫mg~μg（10-3~10-6g）熒光免疫、酶免疫μg~ng（10-6~10-9g）放射免疫、發(fā)光免疫ng~pg（10-9~10-12g）PCRpg~fg（10-12~10-15g）第十四章免疫學檢測技術

第四節(jié)放射免疫技術在食品檢測中的應用

放射免疫分析（RIA）一、基本原理放射免疫分析的基本原理是標記抗原Ag*和非標記抗原Ag對特異性抗體Ab的競爭結合反應。反應式為：Ag*+AbAg*Ab+

Ag

AgAb第十四章免疫學檢測技術標記抗原抗體非標記抗原圖14-6第十四章免疫學檢測技術放射免疫RIA以標記抗原與反應系統中未標記抗原競爭結合特異性抗體來測定待檢樣品中抗原量。

免疫放射IRMA以過量標記抗體與抗原非競爭結合，采用固相免疫吸附載體分離游離和結合標記抗體。放射受體分析RRA放射配體結合分析RBA其它一、基本原理第十四章免疫學檢測技術第四節(jié)放射免疫技術在食品檢測中的應用

二、標記物

P333常用的核素有兩大類γ射線：131I、125I、57Cr和60Coβ射線：14C、3H和32P。使用最廣泛的是：125I①性質活潑、易制備標記物②對被標記物的免疫活性影響?、蹨y量方法簡便、已推廣④半衰期較長、核素豐度高第十四章免疫學檢測技術B、F分離技術——第二抗體沉淀法第十四章免疫學檢測技術第四節(jié)放射免疫技術在食品檢測中的應用

測量儀器（1）γ計數儀（2）β液閃儀第十四章免疫學檢測技術

化學發(fā)光（chemiluminescence）是指伴隨化學反應過程所產生的光的發(fā)射現象?；瘜W發(fā)光發(fā)光免疫分析技術（Luminescentimmunoassay，LIA）

第十四章免疫學檢測技術

光照發(fā)光（photoluminescence）是指發(fā)光劑（熒光素）經短波長的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā)態(tài)，在其回復至基態(tài)時，發(fā)射出較長波長的可見光（熒光）。

生物發(fā)光（bioluminescence）是指發(fā)生在生物體內的發(fā)光現象，如螢火蟲的發(fā)光，反應底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復基態(tài)時多余的能量以光子的形式釋放出來。第十四章免疫學檢測技術