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分子生物學(xué)研究方法
PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用一.多聚酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaciton,PCR)(一)原理熱變性(94度)引物退火(55度)延伸(72度)DNA聚合酶dNTP變性退火引物經(jīng)25~30次循環(huán),目的DNA增加166-7(二)。PCR反應(yīng)的主要成分和作用1。DNA聚合酶:PCR反應(yīng)使用的是耐熱DNA聚合酶。比如:TaqDNA聚合酶。可分為兩大類:(1)具有校正功能的(有3‘5’核酸酶活性)比如:Vent,pfu,pwo等(2)不具有校正功能的(無(wú)3‘5’核酸酶活性)比如:一般的TaqDNA聚合酶2。引物(1)引物長(zhǎng)度以15~30個(gè)bp為宜。引物過(guò)短會(huì)使特異性降低,過(guò)長(zhǎng)時(shí)則成本增加,且也會(huì)降低特異性。(2)引物堿基盡可能隨機(jī)分布,避免出現(xiàn)嘌呤,嘧啶堆積現(xiàn)象,引物G+C含量宜在45~55%左右。(3)引物內(nèi)部不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu),兩個(gè)引物之間尤其在3‘末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在。(4)引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。要求在引物設(shè)計(jì)時(shí)進(jìn)行輔助檢索分析。(5)引物3‘末端堿基:原則上要求引物3’末端與模板DNA一定要配對(duì)。另外引物3‘末端的末位堿基在很大程度上影響著TaqDNA聚合酶的延伸效率。研究表明,引物3‘末端堿基在錯(cuò)誤配對(duì)時(shí),不同堿基的引發(fā)效率存在很大差異。當(dāng)末位堿基為A時(shí),即使在錯(cuò)配的情況下,也能引發(fā)鏈的合成。而末位堿基為T時(shí),錯(cuò)配時(shí)引發(fā)效率大大降低。G,C居于中間,所以3‘末端的末位堿基最好選T,G,C而不選A.(6)引物5‘末端堿基:PCR反應(yīng)物5’末端堿基并沒(méi)有嚴(yán)格限制,只要與模板DNA結(jié)合的引物程度足夠,其5‘末端堿基可以不與模板DNA匹配,而呈游離狀態(tài)。這樣引物設(shè)計(jì)時(shí)可以在5‘末端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或其他短的序列??梢约覣TG起始密碼,可以加錯(cuò)配堿基造成突變。3。PCR反應(yīng)緩沖液:組成50mMKCl10mMTris.Cl(pH8.4)1.5mMMgCl2Mg++是Taq酶活性所必需的金屬離子。Mg++濃度的高低能影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增片斷的產(chǎn)率。1.5~2.0mMMg++是比較合適的。Mg++過(guò)量能增加非特異性擴(kuò)增并影響產(chǎn)率。4。底物dNTP濃度在PCR反應(yīng)中,dNTP濃度應(yīng)在20~200uM,dNTP濃度過(guò)高可加快反應(yīng)速度。同時(shí),還可增加堿基的錯(cuò)誤摻入率和實(shí)驗(yàn)成本。反之,低濃度的dNTP會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度的下降,但可提高實(shí)驗(yàn)的精確性。此外,由于dNTP可能與Mg++結(jié)合,因此應(yīng)注意Mg++濃度和dNTP濃度之間的關(guān)系。(三).怎樣提高PCR的特異性1.熱啟動(dòng)(hot-start)
比如(1)將Taq酶與其它反應(yīng)體系通過(guò)石蠟分隔開(kāi)
(2)利用Taq酶的單克隆抗體抑制其活性。2.Touchdown
先在高于退火溫度下進(jìn)行幾輪PCR循環(huán),然后再在退火溫度下進(jìn)行大量擴(kuò)增。3.NestedPCR
先在要擴(kuò)增片斷的外側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)引物,進(jìn)行PCR,然后以此PCR產(chǎn)物為模板,再在內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增出我們所要的目的片斷。二PCR的應(yīng)用(一)未知DNA片斷的克隆
1,基因組DNA步移法1234
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