BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀操作手冊

BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀

FACS101Handbook

本課程介紹「表面抗原流式分析」有關(guān)之基礎(chǔ)工作原理,如希望進(jìn)一步了解流式細(xì)胞技術(shù)

應(yīng)用，請至本公司網(wǎng)站訂閱FACSinformation電子報(bào)。

如需要本課程手冊，歡迎至本公司網(wǎng)站下載。

如需要免疫熒光染色方法，請至本公司網(wǎng)站下載。

一、BDFACSCalibur基本結(jié)構(gòu)

1.1儀器本體：

1.電源開關(guān)：在BDFACSCalibur儀器右側(cè)下方，先啟動儀器本體，再打開計(jì)算機(jī)。

2.光學(xué)系統(tǒng)：BDFACSCalibur基本配有一支波長488nm的氯離子雷射

以BDFACSCalibur基本型為例

>FSCDiodc只收488nm波長散射光

>SSCPMT只收488nm波長散射光

>FL1PMT熒光光譜峰值落在綠色范圍（波長515-545nm）

>FL2PMT熒光光譜峰值落在橙紅色范圍（波長564-606nm）

>FL3PMT熒光光譜峰值落在深紅色范圍（波長>650nm）

3.儀器面板：

儀器前方面板的右下方有三個(gè)流速控制鍵、及三個(gè)功能控制鍵。

流速控制:

LO：樣品流速：12?l/min

MED：樣品流速:35?l/min

HI:樣品流速:60?l/min

功能控制:

?RUN：此時(shí)上樣管加壓，使細(xì)胞懸液從進(jìn)樣針進(jìn)入流動室。（正常顯示綠

色；黃色時(shí)表示儀器不正常，請檢查是否失壓。）

?STANDBY：無樣品或暖機(jī)時(shí)之正常位置，此時(shí)鞘液停止流動，雷射功率

自動降低。

?PRIME：去除流動室中的氣泡，流動室施以反向壓力，將液流從流動室沖

入樣品管，持續(xù)一定時(shí)間后，以鞘液回注滿流動室。PRIME結(jié)束，儀器恢

?STANDBY狀態(tài)。

4.儲液箱抽屜：

在主機(jī)左下方之儲液箱抽屜?？上蚯袄_，內(nèi)含鞘流液筒、廢液筒、鞘液過濾

器SheathFilter,及空氣濾網(wǎng)Airfilter。請注意氣路減壓閥VENTTOGGLE之位

置。

?鞘液筒：位于抽屜左側(cè)，容積4升。裝八分滿鞘液簡，儀器可以運(yùn)行大約3

小時(shí)。筒上裝有液面感應(yīng)器，鞘液用完時(shí)，儀器軟件上會有顯示。鞘液筒蓋

上有金屬環(huán)扣，保證鞘液簡密閉。

?廢液筒：位于抽屜右側(cè)，容積4升。筒上裝有液面感應(yīng)器，廢液盛滿時(shí)，儀

器軟件上會有顯示。注意廢液可能有潛在的生物傳染性。

?鞘液過游器：0.22?m過濾器，去除鞘液中的雜質(zhì)，保證進(jìn)入流動室的鞘液

是干凈的。

?氣路減壓閥：沿筋頭方向移動閥門開關(guān)，鞘液筒減壓，氣壓恢復(fù)正常。在鞘

液筒添加鞘液時(shí)，需要減壓。

?空氣過濾網(wǎng)：用于過濾冷卻雷射的空氣。

5.上樣品區(qū)：

上樣品區(qū)是樣本管的上樣位置。它包括三個(gè)部分，一個(gè)是進(jìn)樣針

SamplelnjectionTube,將樣本輸入流動室，還有就是支撐架

TubeSupportArrris和液滴存留系統(tǒng)DropletContainmentSystem。

?進(jìn)樣針：是一根不銹鋼管，將細(xì)胞從樣本針中吸入流動室。進(jìn)樣管外有一套

管，是液滴保留系統(tǒng)的一部分。

?支撐架：用于支撐樣本管、并負(fù)責(zé)啟動液滴存留系統(tǒng)。支撐架有三個(gè)位置：

位于樣本管之下的中位，樣本管左側(cè)或右側(cè)。

液滴存留系統(tǒng)：系統(tǒng)由支撐架、真空幫浦和外套管組

成。當(dāng)支撐架位于左側(cè)或右側(cè)位置時(shí)，真空幫浦就會啟

動，將液體從外管吸入廢液筒內(nèi)。上樣時(shí)，須注意將支

撐架位于中位，以避免過多樣品被抽吸到廢液管內(nèi)（當(dāng)

支撐架位于中位，真空幫浦停止工作）。更換樣品時(shí)，

讓儀器保持RUN的模式，使得進(jìn)樣針可以反沖；切換到

STANDBY模式前，確保液路已沖洗徹底以免碎片沈積到

流動室中。

1.2Macintosh計(jì)算機(jī)與打印機(jī):

準(zhǔn)備您的細(xì)胞樣品

1.理想樣品濃度調(diào)至1-10X1()5cells/ml?一般實(shí)驗(yàn)只需0.5ml的樣品。

2.細(xì)胞樣品務(wù)必放至BDFALCON352052試管中，否則無法上機(jī)。

3.上機(jī)前務(wù)必去除樣品中之細(xì)胞團(tuán)塊，以防止管路堵塞？可使用附濾網(wǎng)

BDFALCON試管(Cat.No.352235)或35-55.'忡的尼龍篩網(wǎng).

4.供流式分析的樣品是單細(xì)胞懸浮液，而且大部分樣品都需經(jīng)熒光染色。表面抗原

熒光染色的方法大致有兩種：直接免疫熒光、間接免疫熒光染色。研究生可至本

公司網(wǎng)站下載染色方法

?直接免疫熒光染色

?Lysed-No-WashProcedure

?Lysed-And-WashProcedure,SimulTEST&HLA-B27

?PeripheralBloodMononuclearCellProcedure

?LeukemiaandLymphomaProcedurel

?LeukemiaandLymphomaProcedure2,B-cellClonalityAssay

?間接免疫熒光染色

?滴定抗體濃度

?常用試劑

5.如因特殊因素?zé)o法下教上述實(shí)驗(yàn)方法，請e-mail：或。

二、開機(jī)、關(guān)機(jī)標(biāo)準(zhǔn)操作

2.1FACSCalibur開機(jī)

1.開啟細(xì)胞儀電源。

2.開啟其它周邊配備電源，如打印機(jī)及M0機(jī)。

3.開啟計(jì)算機(jī)。

4.確認(rèn)鞘流液筒有八分滿的FACSFIow,確實(shí)旋緊（鞘液筒容量為4L）。

5.將廢液倒掉，并在廢液筒中加入200nli家用漂白水（廢液筒容量為4L）。

6.將減壓閥方向調(diào)在加壓（Pressurize）位置，

7.排除液流管路與過濾器中的氣泡。

8.取下樣品管，執(zhí)行PRIME功能兩次。

9.使用ImIPBS,HIGHRUN兩分鐘。

10.可開始分析樣品。

2.2FACSCalibur關(guān)機(jī)

關(guān)機(jī)前必要?jiǎng)幼鳎呵逑催M(jìn)樣管和外套管，防止進(jìn)樣管堵塞、或有染料殘留。

1.將樣品支持架左移，取2mlFACSCIean（10%Bleach）上樣品，讓儀器的真空

系統(tǒng)抽取約1ml的液體。

2.將樣品支持架回正，按HIRUN,然后讓FACSCIean清洗管路10分鐘。

3.按Standby,取下樣品管，執(zhí)行PRIME功能兩次。

4,取2mleIH2O,重復(fù)上述步驟1-3。

5.注意最后只留約1mldH2O在試管中。

6.按STANDBY五分鐘，使風(fēng)扇冷卻雷射后，關(guān)閉細(xì)胞儀（必要?jiǎng)幼?，以保護(hù)雷

射光源。）

7.倒掉廢液，棄回填200ml漂白水。

8.將減壓閥放在「VENT漏氣」位置。將鞘流液筒充填至八分滿。

9.退出軟件“File"w“Quit”（如有對話選項(xiàng)，選擇“Don'tsave”）。確認(rèn)退出

計(jì)算機(jī)中所有BD應(yīng)用軟件，所有數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)己儲存?zhèn)浞荨?/p>

10.關(guān)閉計(jì)算機(jī)?！癝pecial”名“Shutdown”，

三、上機(jī)分析流程

建議首次試機(jī)避免進(jìn)行大量試驗(yàn)，僅需準(zhǔn)備下列樣品。

（1）Negativecontrol（不加任何抗體）。

（2）CD3-FITC（FL1單染）。

（3）CD19-PE（FL2單染）。

（4）CD3-FITC/CD19-PE（FL1/FL2雙染）。

3.1Calibur開機(jī)

1.先開啟細(xì)胞儀本體再打開計(jì)算機(jī)。*秘技1:如順序相反，儀器和計(jì)算機(jī)之間無法

建立正常通訊.無法執(zhí)行“cocaecffocytomefer”。解決之道，兩者都關(guān)機(jī)、然后

以正確方式重開。

2.向前拉開儲液箱抽屜，檢查鞘液筒、廢液筒水量，如需充填鞘液，將減壓閥方向

調(diào)在VENT位置（箭頭方向）。

3.儀器會對鞘流液筒打氣加壓，請確認(rèn)筒蓋確實(shí)旋緊。*秘技2：將減壓閥方向調(diào)在

加壓（向前），立置。減壓閥如在VENT（箭頭方向）位置，按RUN功能鍵時(shí)將

顯示橙黃色（表示儀器不正常，請檢查是否失壓），正常為綠色顯示。

3.2開啟CellQuest軟件、編輯實(shí)驗(yàn)文件

4.在蘋果菜單下點(diǎn)擊CELLQuest啟動軟件。桌面會出現(xiàn)一'UntiQed'實(shí)驗(yàn)文件，可

點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。

5.從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，拖曳對角線至適當(dāng)大

小，然后放開鼠標(biāo)。出現(xiàn)散點(diǎn)圖對話方框。

6.在出現(xiàn)的散點(diǎn)圖對話方框中點(diǎn)擊PlotSource,選擇Acquisition（收?。?，確認(rèn)X和

丫軸參數(shù)預(yù)設(shè)為FSC-H1024、SSC-H1024.在顏色方框中點(diǎn)擊

MulticolorGatmg（收取樣品時(shí)，門內(nèi)細(xì)胞將出現(xiàn)顏色）。點(diǎn)擊OK。此時(shí)實(shí)驗(yàn)

文件會出現(xiàn)FSC/SSC散點(diǎn)圖。

7.說明：散點(diǎn)圖（Dotplot）,乂稱二維散點(diǎn)圖是流式分析最常用圖譜，它可以顯示

兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)的相互關(guān)系。在圖中，橫坐標(biāo)X軸為為熒光1強(qiáng)度的相對值，單

位是道數(shù)，縱坐標(biāo)丫軸則通常表示熒光2或光散射強(qiáng)度的相對值。儀器使用者

可因應(yīng)實(shí)驗(yàn)需求來修改所有圖譜中顯示之參數(shù)。第一圖X和丫軸參數(shù)分別設(shè)為

FSC-H1024.SSC-H1024；第二圖X和丫軸參數(shù)分別設(shè)為FL1-H1024、FL2-

H1024o修改動作為輕擊圖譜上X和丫軸參數(shù)，并依需要選擇之（FSC：細(xì)胞

大小，SSC：細(xì)胞折射率,FL1：FITC綠色熒光，F(xiàn)L2：PE橙色熒光,FL3：

PerCP紅色熒光）。

8.從屏幕上方Plcs菜單中選擇DotPlot功能，可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖，在

出現(xiàn)的對話方用內(nèi)選擇X軸：FL1-H1024,Y軸：FL2-H1024。點(diǎn)擊0K,

FL1/FL2的散點(diǎn)圖出現(xiàn)。完成后可將重制圖移至原圖右方。

9.在工具板中選擇四象限工具，在FL1/FL2散點(diǎn)圖上拖動Quadrant的中心將它設(shè)

定在(x,y)=(101,101)處，這些象限將指定陰性/陽性區(qū)域。蜜

建立儀器和計(jì)算機(jī)之間通訊

10.從Acquire菜單中選擇ConnecttoCytometer,此時(shí)會出現(xiàn)Acquisitioncontrol

對話方框。如果無法選擇ConnecttoCytomeier,參考秘技#1。如果沒見到

Acquisitioncontrol對話，可到屏幕上方VV/'cdows菜單中選擇

口出E近過壬京美AcquisitionControlWEWW巧巨王

File：

0Setup[Acqui"]f[Sw][-j

ShowAcquisitionControla

儀舞設(shè)置文件

注意：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量，取決「最適化儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件不能在數(shù)據(jù)收取

后再更改，研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件

(Instrumentsettings),含信號器高壓(Detector7Amps),閾值

(Threshold),熒光補(bǔ)償(Compensation)等儀器條件的組合。一般而言，儀器

設(shè)定的順序?yàn)镈e:ector/Amps-Threshold-Compensationo

11.檢杳現(xiàn)有儀器條件，從Cytometer菜單中選擇

Cytometer，口丘而

Detectors/Amps。出現(xiàn)Detectors/Amps窗口。在Oetectors/Rmps

Detectors/Amps窗口確認(rèn)FSC與SSC為LIN(線Threshold■

性放大)，其它FL1-3為LOG(對數(shù)放大)，將其Compensation

Status

拖至空白區(qū)。

InstrumentSetting

SortCounters

Time-DelayCalibral

12.從Cytometer菜單中選擇Threshold,出現(xiàn)Threshold窗11在Threshold窗11：

確認(rèn)FSC為設(shè)閾參數(shù)，初步確認(rèn)預(yù)設(shè)閾值52。將其拖至空白區(qū)。

13.從Cytometer菜單中選擇Compensation,確認(rèn)所有預(yù)設(shè)數(shù)值皆為零。將其拖至

空白區(qū)。

3.3上樣品、設(shè)置儀器

14.使儀器處于HighRUN,支撐架左移，上陰性對照管樣品，支撐架回位。確認(rèn)

Acquisitioncontrol窗口中與Setup前需打叉或打勾（即不儲存數(shù)據(jù)），點(diǎn)擊

Acquire。

調(diào)節(jié)FSC/SSC探測器（電壓）

15.觀察FSC/SSC圖的變化。FSC電壓（Voltage）預(yù)設(shè)為E00,可調(diào)節(jié)AmpGain

從1.00-9.99使主要細(xì)胞群得以清楚顯示（如細(xì)胞較大，將FSC電壓設(shè)置于

E-1；較小細(xì)胞，將FSC電壓設(shè)置于E01），調(diào)節(jié)SSC電壓使主要細(xì)胞群得以

清楚呈現(xiàn)。調(diào)節(jié)FSC/SSC圖的原則，在于能得到一獨(dú)立離散的細(xì)胞族群，該

細(xì)胞群不與其它族群、細(xì)胞碎片有重迭現(xiàn)象,調(diào)整定位后，點(diǎn)擊

Acquisitioncontrol窗口中的Pause.

Gating圈選

細(xì)胞檢品中，常含有大小不同、性質(zhì)相異的細(xì)胞群體。我們常用前方散射與側(cè)方敵射

的二維位圖，即散射光圖譜（ScatterPlot）,來圈選出不同細(xì)胞群的范圍，選擇性顯

示出有意義的細(xì)胞群體，如下圖圈選白血球之淋巴細(xì)胞族群。

16.在工具板中選擇多邊形的Region,在FSC/SSC散點(diǎn)圖上劃定淋巴細(xì)胞R1區(qū)域

（如下圖）。分析樣品時(shí)，區(qū)域內(nèi)細(xì)胞應(yīng)會呈現(xiàn)成紅色，可移動或改變形狀來圈選

有意義的細(xì)胞。如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域，您可以在工具列中點(diǎn)選Gatesf

Regionlist.以鼠標(biāo)點(diǎn)選R1.再按Delete犍刪除R1|x.域°刪除R1

區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫R1。H

17.選取希望Gate的FL1/FL2散點(diǎn)圖，從Plots菜單中選擇尸0mlafdotpQt。在出現(xiàn)的

對話方框內(nèi)，將NoGa招改選G7=R7。點(diǎn)擊0K。

調(diào)節(jié)FL1、FL2的探測器（電壓）

18.點(diǎn)擊AcquisitiorControl窗口中的Restart。在Detector/Amps窗口中調(diào)節(jié)FL1、

FL2的電壓，使Negativecontrol細(xì)胞群

著落在所選直方圖或散點(diǎn)圖之10°-101

處。

19.在Threshold窗口，適當(dāng)?shù)靥岣逨SC閾值>52,以去除碎片或低階噪音。唯需注

意不要切掉主要細(xì)胞族群。

20.點(diǎn)擊Acquisitioncontrol窗口中的Pause、Aborto移去陰性對照管，關(guān)閉

Detector/Amps>Threshold窗口，我們已設(shè)定好有意義細(xì)胞群之自體熒光。

調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償

說明：最適化的最后?步是調(diào)節(jié)光譜重迭。（如是單色熒光實(shí)驗(yàn)可跳過此步驟）如是

2色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1,FL1-%FL2（若3色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-

%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的補(bǔ)償）。

換上單染管。點(diǎn)擊

21.HighRUN,CD3-FITC|j：：:：：：：■Compensation：：：：：：：：Ei

Acquisitioncontrol窗口中的Acquire。調(diào)節(jié)FL2-%FL1FL1-0.0|||%FL2

使FITC陽性細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的右下象限。補(bǔ)償

Fl2口XA。?口XIAI?KFl1

1L?.叭R1L1

調(diào)節(jié)可通過點(diǎn)擊??來選擇或直接拖動滑標(biāo)上下移動。調(diào)

rL1ZoUn.Une?w/brLion

節(jié)完畢，點(diǎn)擊Acquisitioncontrol窗口中的Pause。

FL3-0.0用%FL2

FL3-O.offi%FL4

中

FL4-(J.Oift%FL3

年

22.移去單染CD3,換上單染CD19-PE管。點(diǎn)擊□：：：：：：：：Compensation：.

Acquisitioncontrol窗口中的Restart。調(diào)節(jié)FL1-%FL2FL1-0.3[t|%FL2

使PE+細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的左上象限。調(diào)節(jié)完畢，F(xiàn)L2-36.3lt'|%FL1

點(diǎn)擊Acquisitioncontrol窗口中的Pause。FL2-0.0[f|%FL3

FL3-22.6@%FL2

FL3-仇噂％FL4

FL4-氏噂%FL3

23.最后以CD3-FITC/CD19-PE雙染樣

本上機(jī)，點(diǎn)擊Acquisitioncontrol窗

口中的Restart,確定三群細(xì)胞工整

垂直。當(dāng)您已完成2色熒光之光譜重

迭時(shí)，點(diǎn)擊Acquisitioncontrol窗口

中的Pause.Aborto

24.移去樣本管，換.上dH2O管，讓儀器暫且處于Standby狀態(tài)。關(guān)閉Compensation

窗口。您己完成2色熒光之最適化。

3.4收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

決定儲存細(xì)胞總數(shù)

25.預(yù)設(shè)之「儲存細(xì)胞總數(shù)」為10000。如需修改，從

Acquire菜單中選擇Acquisition&Storage,并在出現(xiàn)

的窗口功，確認(rèn)「Collectioncriteria」從ParameterDescription

10000ofAII,再點(diǎn)擊OK。CustomKeywords

Counters

FriitRpagpntIist...

EditPanels...

QuantiQuest

DisconnectfromCytom

26.找個(gè)檔案匣準(zhǔn)備儲存數(shù)據(jù)。從Acquire菜單中選擇ParameterDescription,出現(xiàn)

ParameterDescription對話方框。點(diǎn)擊Folder,并在隨后出現(xiàn)之對話方框，選

擇FYourFolder］或新建活頁夾，點(diǎn)擊此對話方框的Select'YourFolder'。

27.命名即將儲存之文件名：點(diǎn)擊ParameterDescription對話方框的File,出現(xiàn)文

件名編輯窗口。在CustomPrefix中：輸入文件名，點(diǎn)擊此對話方框的0乩日

期為最常用之文件名系統(tǒng)。

28.Optional：如有需要，可選擇或在P1-

□ParameterDescriptionE

P5后的空格中輸入相關(guān)參數(shù)名。如

Window：untitled

P1：Size,P2：Granularity,P3：Folder：FACStationG.eatFolder：

：

CD3FITCo輸入?yún)?shù)名會存入實(shí)驗(yàn)檔FileNameData.001

SampleID：［

案中，顯示在圖譜上。PatientID：

Comments：

口Panel(IMKLymphD

計(jì)數(shù)器Counters

29.從Acquire菜單中選擇Coucfws.窗口會顯示樣品分析速率、與總數(shù)進(jìn)度。

口?Counters——?京m三—回

TotalEvents：3825------------------

Events/Second：150Reset

ElapsedTime：0：0：24

收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

30.你可以開始收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)了。HIGHRUN,將第一管樣品放到檢測區(qū)，在

Acquisitioncontrol窗口中，將匕Setup改成，Setup,此時(shí)CellQuest會自動顯

YourFolder：為資料文件名。點(diǎn)擊“Acquire”便可啟動樣品之分析測定與數(shù)

據(jù)儲存。當(dāng)計(jì)算機(jī)成功地收取足夠數(shù)據(jù)，會自動儲存數(shù)據(jù)文件，并會以“嘟”

聲告知，CellQuest會自動升哥附加檔名成。等待下一指示。

31.你可以換上下一管樣品，點(diǎn)擊“Acquire”啟動樣品之分析測定與數(shù)據(jù)儲存。可繼

續(xù)分析直到所有檢品都分析完畢。

3.5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之儲存與備份：

32.不建議長期使用硬盤儲存數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，可考慮以燒光盤(如配有CD-RW)、口袋

硬盤(FlashDrive)來備份大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以免占用原有硬盤的內(nèi)存，影響數(shù)

據(jù)處理速度?？蓪浞莺笾?dāng)?shù)據(jù)，拿到另一率果計(jì)算機(jī)或個(gè)人PC進(jìn)行離機(jī)分

析。

33.確認(rèn)所有檔案皆己備份后，以鼠標(biāo)圈選欲刪除數(shù)據(jù)，將其拖拉至Trash簡。

退出軟件

34.檢品分析完畢后，記得從屏幕上方File指令欄選擇EditCytometer

New

SaveAs,儲存實(shí)驗(yàn)文件，以備日后使用，不需每次

Open...

重新編輯。Close

SaveFCSFilet.

35.從屏幕上方Cytometer指令欄，選擇Instrumentsetting,出現(xiàn)Instrumentsetting

窗口。點(diǎn)系print打印此次實(shí)驗(yàn)條件，可貼入實(shí)驗(yàn)筆記留底，再點(diǎn)擊Save以儲存

此一實(shí)驗(yàn)的儀器條件，供日后再使用。點(diǎn)系SAVE后會出現(xiàn)文件保存對話方

框，選擇文件目錄及文件名（例：YourFoldsr：/YourSettingl），點(diǎn)擊Save.

點(diǎn)擊Done。

36.檢品分析完畢后，用鼠標(biāo)從屏幕上方Acquire指令欄中，選取

DisconnecttoCytometer以斷絕計(jì)算機(jī)與儀器間之聯(lián)機(jī)。之后如不分析數(shù)據(jù)，您

可退出軟件“File"w“Quit”（遇有選項(xiàng)永遠(yuǎn)選擇"Don'tsave”），進(jìn)行關(guān)機(jī)程

序。

管路清洗

37.以2ml10%漂白水取代樣品，將樣品架置于左位以外管吸除約1mL再將樣品

架置于中位HIRUN十分鐘。改用2mlDlwater。重復(fù)上述程序，樣品架上留約

1mlDlwatero按STANDBY五分鐘。

關(guān)主機(jī)、關(guān)計(jì)算機(jī)

四、數(shù)據(jù)分析

FCSIistmode數(shù)據(jù)文件：

說明：FCSIistmode數(shù)據(jù)文件是流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)格式檔案（FCS2.0）。該文件含有從流

式細(xì)胞儀收取的平均10,000個(gè)細(xì)胞數(shù)的資料，含有4~6個(gè)參數(shù)。一般軟件無法打開

listmode數(shù)據(jù)文件，需藉助如CellQuest,WinList,WinMDI,等Flow分析軟件，才可開啟、

繪圖、并進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

4.1開啟一CellQuest實(shí)驗(yàn)文件

1.從屏幕上方File菜單中選擇New。桌面會出現(xiàn)一'Untitled'實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文

件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。

4.2散點(diǎn)圖之統(tǒng)計(jì)分析（雙色）

2從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，然后拖動對角線至適當(dāng)大

小。Plot拖曳完成后可以在右方看到DotPlot對話框。

3.在DotPlot方框中，PlotSource應(yīng)預(yù)設(shè)為Analysis,可點(diǎn)擊SelectFile鈕，并用隨

后之方框來開啟預(yù)存之SampleFiles,它們的路徑位于MacHD：

BDApplications：CellQuestFolder：SampleFileSo連續(xù)雙擊鼠標(biāo)來打開次目錄，

找到檔案后，點(diǎn)擊Open來開啟NORM001檔案。X與Y參數(shù)項(xiàng)會出現(xiàn)默認(rèn)值一

FSC-H256與SSC-H256,在Color方框中點(diǎn)擊MulticolorGating,確認(rèn)無誤之

后，點(diǎn)擊0K便完成了一個(gè)NORM001的FSC/SSC散點(diǎn)圖。

4.工具板中選擇多角形區(qū)隔工具，將Cursor■移至FSC/SSC散點(diǎn)圖上，并沿,jj

著淋巴球聚落周邊畫出范圍，連點(diǎn)擊兩次可關(guān)閉該區(qū)域。你已完成R1回斗

區(qū)域的界定，我們將以此區(qū)域來圈選淋巴細(xì)胞。(如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域，|回

您可以在工具列中點(diǎn)選Gates-Regionlist,以鼠標(biāo)點(diǎn)選R1,再按

Delete鍵刪除R1區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫R1。)

5.從Plots菜單中選擇DotPlot可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖，屏幕上會出現(xiàn)一

DotPlot對話方框。點(diǎn)擊XParameter?鈕來顯示NORM001檔案中所有的參數(shù)項(xiàng)

(FSC,SSC,FL1,FL2)將X參數(shù)項(xiàng)改成rFL1-H256Gamma-1J,丫參數(shù)項(xiàng)改成

rFL2-H256Gammd-2j。從Gale輸入欄中將NoGale改成G1=R1。

6.點(diǎn)擊0K便完成了一個(gè)以G1圈選的

FL1/FL2散點(diǎn)圖，可將復(fù)制圖移至

原圖右方。NORM001檔案為本組

實(shí)驗(yàn)之陰性對照組，我們將以之來

界定陰性與陽性之界限。

7.從屏幕左列工具板中，選取QuadrantMarker工具，然后在FL1/FL2散點(diǎn)圖中心處

點(diǎn)擊并拖曳至定點(diǎn)，一般而言是緊挨著陰性細(xì)胞聚落。

8.FL1/FL2二維散點(diǎn)圖現(xiàn)在被區(qū)隔出四個(gè)象限，欲計(jì)算名象線中細(xì)胞的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，從

屏幕上方Stats菜單中選擇QuadrantStats?？梢缘玫皆搱D之四象限統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

UL：左上象限，UR：右上象限，LL：左下象限，LR：右下象限

打印報(bào)告、輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值

9.從屏幕上方File菜單中選擇PrintOne,可以打印工作中實(shí)驗(yàn)文件。

10.點(diǎn)選四象限統(tǒng)計(jì)表，從屏幕上方File菜單中選擇Exportstatistics可輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值

至Excel檔案。在出現(xiàn)方框中命名檔案，并決定欲存放檔案匣，點(diǎn)擊Save,,

4.3開啟其它ListModeData

11.如欲接著分析存在同一檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表（文

件中所有圖譜的四角會出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上），接著從Plots菜單選擇

NextDataFile,軟件會自動以新檔案來替換現(xiàn)有檔案，您只要確認(rèn)圈選范圍、與

QuadrantMarker的位置是否恰當(dāng)，即可打印報(bào)告、或輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值。

12.對于存在不同檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表（文件中所有

圖譜的四角會出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上），接著從Plots菜單選擇

ChangeDataFiles,并在隨后出現(xiàn)之對話方框，選擇所在新目錄與欲分析檔案。

點(diǎn)擊OPEN。可調(diào)整圈選區(qū)域，QuadrantMarker陰陽界限，軟件會重新計(jì)算、

統(tǒng)計(jì)報(bào)告。

13.常規(guī)使用之實(shí)驗(yàn)文件（內(nèi)含散點(diǎn)圖、圈選區(qū)格、四象限分界、以及統(tǒng)計(jì)報(bào)告），我們

建議您將它另存新檔File-SaveAs,以備后需，分析其它檔案便輕而易舉。

4.3直方圖之統(tǒng)計(jì)分析（單色）

1.從屏幕上方File菜單中選擇New。桌面會出現(xiàn)一'Untitled'實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文

件的右上角的放大鈕，將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。

2.從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，然后拖曳對角線至適當(dāng)大

小。Plot拖曳完成后可以在右方看到DotPlot對話框。

3.在DotPlot方框中，PlotSourcc應(yīng)預(yù)設(shè)為Analysis,可點(diǎn)擊ScIcctFilc鈕，并用隨后

之方框來開啟預(yù)存之SampleFiles,它們的路徑位于MacHD：BDApplications：

CellQuestFolder：SampleFileSo連續(xù)雙擊鼠標(biāo)來打開次目錄，找到檔案后，點(diǎn)擊

Open來開啟NORM001檔案。X與丫參數(shù)項(xiàng)會出現(xiàn)默認(rèn)值一FSC-H256與SSC-

H256,在Color方框中點(diǎn)擊MulticolorGating,確認(rèn)無誤之后，點(diǎn)擊OK便完成了

一個(gè)NORM001的FSC/SSC散點(diǎn)圖。

4.工具板中選擇多角形區(qū)隔工具，將Cursor移至FSC/SSC散點(diǎn)圖上，并沿>—q―R

著淋巴球聚落周邊畫出范圍，連點(diǎn)擊兩次可關(guān)比該區(qū)域。你已完成R1區(qū)羋4

區(qū)域的界定，我們將以此區(qū)域來圈選淋巴細(xì)胞。(如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域，|?忙不

您可以在工具列中點(diǎn)選Gates-Regionlist,以鼠標(biāo)點(diǎn)選R1,再按

Delete鍵刪除R1IX域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫R1。)

5.從Plots菜單中選擇Histogram,屏幕上會出現(xiàn)一Histogram對話方框。點(diǎn)擊

SelectFile鈕，再點(diǎn)擊Open來開啟NORM001檔案。

說明：直方圖(Histogram)表明一個(gè)參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量之間的

關(guān)系，在圖中，橫坐標(biāo)X軸為熒光或光散射強(qiáng)度的相對值，

單位是道數(shù)(channelnumber),縱坐標(biāo)Y軸則通常表示細(xì)

胞出現(xiàn)的頻率，即相對細(xì)胞數(shù)。

6.點(diǎn)擊Parameter鈕來顯示NORM001檔案中所有的參數(shù)項(xiàng)，將參數(shù)項(xiàng)改成IFL2-

H256Gamma-2j。從Gate輸入欄中將NoGate改成G1=R1,點(diǎn)擊0K便完成了一

個(gè)以G1圈選的FL2直方圖，圖形的X軸為橙黃色熒光強(qiáng)度，丫軸為細(xì)胞頻率，

NORM001檔案為本組實(shí)驗(yàn)之陰性對照組，我們將以之來界定陰性與陽性之界限。

7.從屏幕左列工具板中，選取HistogramMarker工具，然后在圖的左緣處點(diǎn)擊并拖曳

至定點(diǎn)，一般而言是陰性信號的右緣。放開鼠標(biāo)后即完成Marked(M1)。重復(fù)前述

步驟以增畫另一Marker,一般而言M2始自M1的右緣，終于圖的右界。

8.FL2直方圖現(xiàn)在被區(qū)隔出兩個(gè)區(qū)域，欲計(jì)算各區(qū)域中細(xì)胞的數(shù)StatsBatchAcquire

HistogramStats

據(jù)數(shù)據(jù)，同'從Stats指令欄中選擇HistogramStatSoK-SStats-

RegionStats

GateStats

QuadrantStats

Edit.

NewExpression

EditExpression

打印報(bào)告、輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值

9.從屏幕上方File菜單中選擇PrintOne,可以打印工作中實(shí)驗(yàn)文件。

10.點(diǎn)選四象限統(tǒng)計(jì)表，從屏幕上方File菜單中選擇Exportstatistics可輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值至

Excel檔案。在出現(xiàn)方框中命名檔案，并決定欲存放檔案回，點(diǎn)擊Save.

4.3開啟其它ListModeData

11.如欲接著分析存在同一檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表（文件

中所有圖譜的四角會出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上），接著從Plots菜單選擇

NextDataFile,軟件會自動以新檔案來替換現(xiàn)有檔案，您只要確認(rèn)圈選范圍、與

QuadrantMarker的位置是否恰當(dāng)，即可打印報(bào)告、或輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值。

12.對于存在不同檔案同方系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖電方式詵取所有圖表（文件中所有圖

譜的四角會出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上），接著從Plots菜單選擇

ChangeDataFiles,并在隨后出現(xiàn)之對話方框，選擇所在新目錄與欲分析檔案。點(diǎn)

擊OPEN?？烧{(diào)整圈選區(qū)域，Markers界限，軟件會重新計(jì)算、統(tǒng)計(jì)報(bào)告。

13.常規(guī)使用之實(shí)驗(yàn)文件（內(nèi)含散點(diǎn)圖、圈選區(qū)格、四象限分界、以及統(tǒng)計(jì)報(bào)告），我們

建議您將它另存新檔File-SaveAs,以備后需，分析其它檔案便輕而易舉。

五、錯(cuò)誤信號、疑難排除

5.1儀器狀態(tài)（Status）：

在CELLQuest菜單位于Cytometer菜單中。用來

口WWWWWStatus三三三三三"EW

在收取的任何時(shí)候查看流式細(xì)胞儀的運(yùn)行狀態(tài)，以

TestPulses:

利解決儀器運(yùn)行中出現(xiàn)的問題。

Status：Standby

狀態(tài)：顯示儀器運(yùn)行模式LaserPower：5.15

LaserCurrent:3.78an岷s

NotReady：激光器正在預(yù)熱、鞘液桶空、廢SampleVoltage：10.23

液桶滿。SheathFluid：OK

WasteTank:OK

Ready：樣本管放置在進(jìn)樣區(qū)，且支撐臂位于

中位，樣本管加壓，儀器在RUN狀態(tài)。

Standby：儀器在Standby狀態(tài)、或儀器在Run狀態(tài)而無樣本管在進(jìn)樣區(qū)上、

或支撐架位于側(cè)位、或樣本管未完全加壓。Standby時(shí)儀器的雷射電

源降低。

5.2常見故障排除程序

5.2.1樣品試管上不去

>誤用不適合的試管。（請用BDFalcon352052）

>試管支持架需調(diào)整。旋轉(zhuǎn)調(diào)整試管支持架（順時(shí)鐘向卜、逆時(shí)鐘向上）。

>BalSeal磨損。（汰換Balseal）

5.2.2儀器處于NOTREADY狀況

檢查以下情況：

>鞘液筒中的鞘液是否用完。

>廢液筒中的廢液是否已裝滿.

>開機(jī)需要5分鐘時(shí)間預(yù)熱。

>鞘液筒的汶面檢測器連接是否松動、或未連接。

5.2.3儀器處于STANDBY狀況（儀器失壓）

如果儀器未加壓，上樣管放好后，雖然控制面板處于RUN模式，但儀器仍未能達(dá)到

READY狀況，此時(shí)儀器仍處于STANDBY狀況。這可能是由于鞘液筒蓋漏氣、壓力

閥未加壓，樣本管不能被加壓等原因造成的壓力問題。此時(shí)，樣本不能良好地進(jìn)入

流動室，無法檢測，

此時(shí)，檢查以下情況：

>壓力閥未加壓。

>鞘液筒是否漏氣（蓋緊鞘液筒蓋）。

>樣本管是否有破損。

>上樣針上的Balseal是否己磨損。

>鞘液筒上的藍(lán)色接頭是否連接好。

5.2.4儀器訊號噪聲過高

鞘液過濾器中有氣泡，儀器記錄了氣泡產(chǎn)生的信號，造成了噪聲數(shù)據(jù)的干擾。氣泡

還可以改變樣本流，造成檢測結(jié)果不理想；此時(shí)，儀淵需要做PRIME,排除液路中

的氣泡干擾。如果鞘液筒吸干了，應(yīng)該重新裝滿鞘液，然后先取下樣品管進(jìn)行5-10

次PRIME,再換上3mldH2O上樣管HIRUN30分鐘，待鞘液流中的氣泡排除之后，

再進(jìn)行樣本測定。

5.2.5計(jì)算機(jī)屏幕上見不到細(xì)胞顯示

檢查以下情況：

>如果儀器一直處于STANDBY狀態(tài)，則檢查SystemStatuso

>如果STATUS窗日顯示READY,則檢查樣本管中細(xì)胞濃度是否夠，上樣前

是否混勻了。

>檢查實(shí)驗(yàn)的Instrumentsettings是否正確。

>檢杳閾值是否設(shè)置過高，導(dǎo)致無法檢測目亦細(xì)胞群。

>檢查CELLQuest軟件Cytometer目錄下的Status窗口，是否己被更新。如

果未更新，說明儀器與計(jì)算機(jī)之間的通訊發(fā)生了故障，此時(shí)，應(yīng)關(guān)閉計(jì)算機(jī)

和FACSCalibur,重新打開儀器，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

>PRIME儀器液流，去除流動室中可能存在的氣泡。若流動室中存在氣泡，可

能使樣本流的位置偏離激光束，導(dǎo)致無細(xì)胞信號。

5.2.6加樣針有鞘液反流

檢查以下情況：

>檢查上樣針外管是否安好，可以將外管旋下，向上推動，重新擰緊。

>更換上樣針上部的。型膠環(huán)。

>檢查液流保存系統(tǒng)的真空幫浦是否工作。如果樣本管支撐架位于旁位時(shí)，聽

不到真空幫浦的工作聲音，可能是真空幫浦停了，關(guān)閉FACSCalibur,再啟

動：移開支撐架時(shí)，如果馬達(dá)仍然不動，請致電BD客戶服務(wù)部門尋求存

助。

實(shí)驗(yàn)文件1：2ColorACQ

實(shí)驗(yàn)文件2：2ColorANA

表一、常用熒光染劑

測量參數(shù)熒光染劑吸光波長(nm)熒光波長(nm)

標(biāo)示抗體用染劑Fluorescein,FITC490520

Phycoerythrin-R,PE495578

Peridinin-490677

chlorophyll,PerCP

Cy-Chrome495670

PE-TexasRed495620

PE-Cyanine5495670

核酸含量分析EthidiumBromide510(+dsDNA)595

Propidiumlodide536(+dsDNA)623

AcridineOrange480(+DNA)520

440-70(+RNA)650

ThiazoleOrange509(+RNA)533

PyronineY560-562(+dsRNA)565-574

497(+ssRNA)563

細(xì)胞ViabilityPropidiumlodide536623

YOPRO-1480515

AcridineOrange480520

7-AAD