DB22T 1606-2012 副豬嗜血桿菌病診斷技術(shù)規(guī)程　　

備案號(hào)：35740-2013DB22DB22/T1606—2012副豬嗜血桿菌病診斷技術(shù)規(guī)程TechnicalspecificationofdiagnosisforHaemophilusparasuis2012-12-01發(fā)布2013-01-01實(shí)施吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)GB16548病害動(dòng)物和病害動(dòng)物產(chǎn)品生NY/T541動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣鏡下觀察滲出物，可見(jiàn)纖維蛋白，中性粒細(xì)胞和較少量的巨噬細(xì)胞。病死豬及病料的處理應(yīng)符合GB24.4.2細(xì)菌涂片，革蘭氏染色鏡檢。如果為革蘭氏陰性小桿狀或多形性小桿菌，再進(jìn)4.4.3巧克力瓊脂平板生長(zhǎng)良好，而鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板沒(méi)有菌落生成則菌培養(yǎng)物接種于添加有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的脲酶、氧化酶、吲芽糖、蔗糖、果糖、核糖、半乳糖、硝酸鹽還原酶等細(xì)菌微量生化鑒定管，置37℃培養(yǎng)48h。按細(xì)菌3PCR引物P15′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT–3′和P25′-GGCTTCGT按NY/T541規(guī)定的方法，采集待檢豬的病料置于-20℃保存。取約1g病料，剪碎后勻漿器加5mL規(guī)定處理待檢豬。取可疑培養(yǎng)物10000r/min離心54高速10000r/min離心5min，取上清-20℃保存?zhèn)溆?。分離純化的菌株用接種環(huán)刮取2個(gè)菌制備1%瓊脂糖凝膠，內(nèi)加適量溴化乙錠或其替代物，取PCR產(chǎn)物10μL～20μL分別與適量加樣緩沖液混合后，加入到樣品孔，9V/cm恒壓下電泳15mi5用微量移液器先向反應(yīng)板每孔中加25μL稀釋劑，再向第1孔加人1:32、1:64），混勻后從第6孔取出25μL棄去。向每孔中加入25μL2%致敏紅細(xì)胞，血清的最終稀釋倍數(shù)為1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128。同時(shí)應(yīng)設(shè)陰、陽(yáng)性血清對(duì)照及致敏紅細(xì)胞空白對(duì)照。置6病原學(xué)特性A.1病原菌副豬嗜血桿菌為格蘭氏陰性菌，非溶血性，NAD依賴型細(xì)菌，有多近呈衛(wèi)星生長(zhǎng)，菌落直徑達(dá)1～2毫米。該菌對(duì)外界抵抗力不強(qiáng)，干燥環(huán)境易死亡，60℃可存活5min~20min，4℃可存活7d～10d，對(duì)結(jié)晶紫、桿菌肽、紅霉素、林可霉素、土霉素、卡那霉素、磺胺類6、7、8、9、11