DB32T 1771-2011 豬支原體肺炎診斷技術(shù)

ICS65.020.30備案號(hào)：DB32DiagnosticTechniquesfor江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB32/T1771—2011為規(guī)范豬支原體肺炎診斷技術(shù)，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1—2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》編制。本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：劉茂軍、邵國(guó)青、馮志新、王海燕、周勇岐、蘇國(guó)東、孫佩元、甘源。1DB32/T1771—2011豬支原體肺炎診斷技術(shù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬支原體肺炎的診斷技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的分離鑒定和PCR法適用于本病的確診，間接血凝試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)適用于大批量樣品的2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修訂單）適用于本文件。GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB16548病害動(dòng)物和病害動(dòng)物產(chǎn)品生物安全處理規(guī)程N(yùn)Y/T541動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣方法NY/T1186豬支原體肺炎診斷技術(shù)DB32/T1461豬肺炎支原體檢測(cè)PCR法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)3.1豬支原體肺炎豬支原體肺炎（Mycoplasmalpneumoniaofswine，MPS)，俗稱為豬氣喘病或豬地方流行性肺炎（EnzooticPneumoniaofSwine,EPS）。它是由豬肺炎支原體（Mycoplasmahyopneumoniae）引起的一種呼吸道疾病，是全世界廣泛存在的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要豬病之一。我國(guó)是世界養(yǎng)豬大國(guó)，每年在MPS上損失百億元以上。本病還誘導(dǎo)免疫缺陷，特別是當(dāng)前藍(lán)耳病廣泛的存在，混合感染給養(yǎng)豬業(yè)帶來更大損失，對(duì)規(guī)?；B(yǎng)豬意義重大。我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。4流行病學(xué)診斷4.1易感動(dòng)物豬氣喘病僅發(fā)生于豬，不同品種、年齡、性別的豬均能感染，其中以哺乳豬和幼豬最易感，發(fā)病率高，病死率低；其次是妊娠后期的母豬和哺乳母豬，育肥豬發(fā)病較少。4.2易感季節(jié)一年四季均可發(fā)生，但冬春寒冷季節(jié)較多見。4.3誘發(fā)因素2DB32/T1771—2011豬舍通風(fēng)不良、豬群擁擠、氣候突變，陰濕寒冷、飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生條件不良可促進(jìn)本病發(fā)生，加重5臨床診斷5.1急性型病豬劇喘，腹式呼吸或犬坐姿勢(shì)，時(shí)發(fā)痙攣性陣咳。體溫一般正常。食欲大減或廢絕，日漸消瘦。病程約1周，病豬常因窒息而死，病死率高。5.2慢性型長(zhǎng)期咳嗽，清晨進(jìn)食前后及劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)最明顯，嚴(yán)重的可發(fā)生痙攣性咳嗽。病豬體溫不高，但消瘦，發(fā)育不良，被毛粗亂。病程長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月～3個(gè)月，有的在半年以上，病死率不高。6病理學(xué)診斷6.1大體病變特征性病變是肺的心葉、尖葉和膈葉前緣發(fā)生對(duì)稱性的紫紅色到灰色的實(shí)變，肺門淋巴結(jié)腫大、增生。刀切肺臟，質(zhì)度變硬、重量增加，氣管中有黏液性滲出物。病死豬及病料應(yīng)符合按GB16548的規(guī)定。6.2組織學(xué)病變典型病變組織通過用常規(guī)的病理切片、染色、脫色后觀察，支氣管和細(xì)支氣管上皮組織纖毛數(shù)量減少，小支氣管周圍的肺泡擴(kuò)大，泡腔充滿多量炎性滲出物，肺泡間組織有淋巴樣細(xì)胞增生。急性病例中，擴(kuò)張的泡腔內(nèi)充滿漿液性滲出物，雜有單核細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，少量淋巴細(xì)胞和脫落的肺泡上皮細(xì)胞。慢性病例，其肺泡腔內(nèi)的炎性滲出物中，主要是淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。7病原學(xué)診斷7.1病原分離與鑒定7.1.1材料準(zhǔn)備除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682—2008的滅菌二級(jí)水。Hank's液,KM2液體培養(yǎng)基，KM2固體培養(yǎng)基,兔抗豬肺炎支原體高免血清和健康兔血清，滅菌棉拭子。7.1.2病料采集按NY/T541規(guī)定的方法采樣。病豬用棉拭子深擦病豬的喉頭或鼻腔，采集呼吸道分泌物。病死豬及剖殺豬，無菌操作采取具有特征的病肺與健肺連接處的肺組織。7.1.3病原分離7.1.3.1液體培養(yǎng)將病肺組織切成2mm3以下的碎塊，浸入Hank's液中洗滌，除去血液和組織碎塊，取3塊～5塊浸泡在盛有5mLKM2液體培養(yǎng)基的試管中；棉拭子浸入約1mLKM2液體培養(yǎng)基中清洗，并壓出棉花中殘液，在37℃進(jìn)行培養(yǎng)。1代～3代分離時(shí)須每經(jīng)3d～5d，以20%的接種量連續(xù)進(jìn)行移植；至4代～5代以后，DB32/T1771—2011再經(jīng)5d～7d連續(xù)轉(zhuǎn)移以提高分離率。通過連續(xù)繼代，當(dāng)培養(yǎng)物出現(xiàn)有規(guī)則的變色時(shí)，應(yīng)涂片鏡檢；觀察到典型的支原體7.1.3.2固體培養(yǎng)將液體培養(yǎng)物作適當(dāng)稀釋后再接種于固體培養(yǎng)基上，在含5%～l0%CO2的環(huán)境中37℃培養(yǎng)3d~10d。培養(yǎng)時(shí)應(yīng)逐日在低倍鏡下觀察，若出現(xiàn)圓形、邊緣整齊、似露滴狀、中央有顆粒、稍隆起的小菌落，判為可疑菌落，需進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。7.1.4病原鑒定7.1.4.1代謝抑制試驗(yàn)取不含血清的KM2培養(yǎng)基加入兔抗豬肺炎支原體J株高免血清，按20%接種分離菌株，37℃培養(yǎng)5d～10d，進(jìn)行代謝抑制試驗(yàn)。同時(shí)接種加入健康兔血清的KM2培養(yǎng)基作為對(duì)照。如對(duì)照變色，鏡檢有大量支原體菌體存在，試驗(yàn)組未變色，則判定分離菌株為豬肺炎支原體。7.1.4.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）支原體培養(yǎng)物按照7.2的方法檢測(cè)和判定。7.1.5結(jié)果判定以上實(shí)驗(yàn)皆為陽性判為豬肺炎支原體。7.2豬肺炎支原體聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）采集的待檢豬肺臟和可疑培養(yǎng)物樣品，按DB32/T1461規(guī)定的方法進(jìn)行檢測(cè)和判定。8血清學(xué)檢測(cè)按NY/T1186第5章規(guī)定的方法進(jìn)行檢測(cè)和判定。8.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）8.2.1材料準(zhǔn)備豬肺炎支原體酶聯(lián)抗原，酶標(biāo)抗體，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，酶標(biāo)板及其他必要的試驗(yàn)溶液和酶標(biāo)儀、移液器等儀器。8.2.2操作步驟8.2.2.1包被用包被液將豬肺炎支原體酶聯(lián)抗原稀釋到工作濃度加入做好標(biāo)記的酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100μL，37℃作用1h后，置4℃冰箱過夜。8.2.2.2洗滌甩掉酶標(biāo)板孔內(nèi)的液體，加入洗滌液，室溫下浸泡3min，甩去洗滌液，再重新加入洗滌液，連續(xù)洗3次，最后一次甩掉洗滌液后，拍干酶標(biāo)板。4DB32/T1771—20118.2.2.3封閉各孔加人封閉液100μL，37℃作用1h。按8.2.2.2步驟洗滌。8.2.2.4加入待檢血清和陰、陽性血清對(duì)照待檢血清用稀釋液稀釋，每孔加100μL。同時(shí)將陰、陽性血清作對(duì)照。37℃作用1.5h，重復(fù)8.2.2.28.2.2.5加入酶標(biāo)抗體用稀釋液將酶標(biāo)抗體按工作濃度稀釋，每孔加入100μL，37℃作用1h，重復(fù)8.2.2.2步驟。8.2.2.6加入底物每孔加100μL，室溫避光顯色5min～10min。8.2.2.7終止反應(yīng)每孔加入50μL終止液終止反應(yīng)。8.2.2.8測(cè)定光吸收值(OD)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值(OD)。8.2.3結(jié)果判定用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，以空白對(duì)照調(diào)零，S為各檢測(cè)孔的值，N為陰性對(duì)照的平均值，P為陽性對(duì)照的平均值。P／N≥2.1時(shí)，試驗(yàn)成立。S／N≥2.1時(shí)判定為陽性，反之，判為陰性。9最終結(jié)論判定下列任何情況之一，均可判為豬肺炎支原體感染豬：a）發(fā)病不分年齡、季節(jié)、個(gè)體臨床表現(xiàn)明顯，病例解