九、核糖體提取

第九章核糖體(ribosome)

概述

核糖體的類型與結(jié)構(gòu)

多聚核糖體與蛋白質(zhì)的合成

第一節(jié)核糖體的類型與結(jié)構(gòu)核糖體是細胞內(nèi)一種核糖核蛋白顆粒，其惟一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質(zhì)多肽鏈,所以核糖體是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的分子機器。按核糖體存在的部位可分為三種類型:細胞質(zhì)核糖體、線粒體核糖體、葉綠體核糖體。按存在的生物類型可分為兩種類型:真核生物核糖體和原核生物核糖體。原核細胞的核糖體較小,沉降系數(shù)為70S，相對分子質(zhì)量為2.5x103kDa,由50S和30S兩個亞基組成;而真核細胞的核糖體體積較大,沉降系數(shù)是80S，相對分子質(zhì)量為3.9～4.5x103kDa,由60S和40S兩個亞基組成。在真核細胞中,核糖體進行蛋白質(zhì)合成時,既可以游離在細胞質(zhì)中,稱為游離核糖體,也可以附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表面,稱為膜旁核糖體或附著核糖體。真核細胞含有較多的核糖體,每個細胞平均有106～107個,而原核細胞中核糖體較少每個細胞平均只有15×102～18×103個。典型的原核生物大腸桿菌核糖體是由50S大亞基和30S小亞基組成的。在完整的核糖體中，rRNA約占2/3,蛋白質(zhì)約為1/3。50S大亞基含有34種不同的蛋白質(zhì)和兩種RNA分子，相對分子質(zhì)量大的rRNA的沉降系數(shù)為23S，相對分子質(zhì)量小的rRNA為5S。30S小亞基含有21種蛋白質(zhì)和一個16S的rRNA分子。真核細胞核糖體的沉降系數(shù)為80S，大亞基為60S，小亞基為40S。在大亞基中，有大約49種蛋白質(zhì)，另外有三種rRNA∶28SrRNA.5SrRNA和5.8SrRNA。小亞基含有大約33種蛋白質(zhì)，一種18S的rRNA。核糖體是細胞內(nèi)一種核糖核蛋白顆粒,其惟一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質(zhì)多肽鏈,是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的分子機器。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,核糖體概念的涵意有了進一步的發(fā)展。細胞內(nèi)除了從事蛋白質(zhì)合成的核糖體外,還有許多其它功能的核糖核蛋白體顆粒,通常是一些小分子的RNA同蛋白質(zhì)組成的顆粒,它們參與RNA的加工、RNA的編輯、基因表達的調(diào)控等。一、核糖體的基本類型與成分■核糖體的類型按存在的部位:有三種類型核糖體,細胞質(zhì)核糖體、線粒體核糖體、葉綠體核糖體。按存在的生物類型:分為兩種類型,即真核生物核糖體和原核生物核糖體。原核細胞的核糖體較小,沉降系數(shù)為70S,相對分子質(zhì)量為2.5x103kDa,由50S和30S兩個亞基組成；而真核細胞的核糖體體積較大,沉降系數(shù)是80S,相對分子質(zhì)量為3.9-4.5x103kDa,由60S和40S兩個亞基組成。主要成分 r蛋白質(zhì):40%，核糖體表面 rRNA:60%，核糖體內(nèi)部核糖體的分布常分布于蛋白質(zhì)合成旺盛的區(qū)域，其數(shù)量與蛋白質(zhì)合成程度有關(guān)。核糖體的大小亞單位在細胞內(nèi)常常游離于細胞質(zhì)基質(zhì)中，只有當(dāng)小亞單位與mRNA結(jié)合后，大亞單位才與小亞單位結(jié)合形成完整的核糖體。肽鏈合稱終止后，小亞單位解離，又游離存在于細胞質(zhì)基質(zhì)中。非共價鍵

各種來源的核糖體亞基組成來源完整核糖體核糖體亞基核糖體RNAs 細胞質(zhì)80S60S(大亞基)28S(真核生物)40S(小亞基)18S,5.8S,5S細胞質(zhì)70S50S(大亞基)23S(原核生物)30S(小亞基)16S,5S線粒體55-60S45S(大亞基)16S(哺乳動物)35S(小亞基)12S線粒體75S53S(大亞基)21S (酵母)35S(小亞基)14S線粒體78S60S(大亞基)26S(高等植物)45S(小亞基)18S,5S葉綠體70S50S(大亞基)23S30S(小亞基)16S,5S 核糖體的生物發(fā)生(biogenesis)核糖體的合成和裝配過程相當(dāng)復(fù)雜。真核細胞和原核細胞的核糖體合成和裝配過程各不相同。核糖體的生物發(fā)生包括蛋白質(zhì)和rRNA的合成、核糖體亞基的組裝等。

核糖體rRNA基因的轉(zhuǎn)錄與加工核糖體的組成成分是蛋白質(zhì)和rRNA,所以編碼核糖體的基因分為兩類,一類是蛋白質(zhì)基因,另一類是rRNA基因。在生活細胞中,特別是在活躍進行蛋白質(zhì)合成的細胞中,需要大量的核糖體,這就意味著需要合成大量的rRNA和核糖體蛋白質(zhì)。

■編碼rRNA基因的過量擴增細胞為了滿足大量需求的rRNA，通過兩種方式擴大rRNA基因的拷貝數(shù):●在染色體上增加rRNA基因的拷貝數(shù)，如在細菌E.coli的基因組中有七套rRNA基因，而典型的真核生物細胞含有幾百到幾千個28S、18S和5.8SrRNA基因的拷貝，5SrRNA基因的拷貝數(shù)多達50000個?！裢ㄟ^基因擴增(geneamplification)?？茖W(xué)家用兩棲類的卵細胞(卵母細胞)研究在發(fā)育過程中rRNA基因的擴增。發(fā)現(xiàn)兩棲類卵母細胞在發(fā)育的早期，rRNA基因的數(shù)量擴增到1000多倍?！稣婧松?8S、5.8S、28SrRNA和5SrRNA基因編碼rRNA基因的DNA稱為rDNA。真核生物有四種rRNA基因,其中18S、5.8S和28SrRNA基因是串聯(lián)在一起的,每個基因被間隔區(qū)隔開,5SrRNA基因則位于不同染色體上?！?8S、5.8S、28SrRNA基因轉(zhuǎn)錄與加工18SrRNA.5.8SrRNA和28SrRNA基因首先轉(zhuǎn)錄成一個45S的前體rRNA(pre-rRNA)，大約是這3個rRNA總長的2倍。能夠轉(zhuǎn)錄這3個rRNA前體的DNA區(qū)域稱為一個轉(zhuǎn)錄單位，意指它們有一個共同的轉(zhuǎn)錄起點和轉(zhuǎn)錄終點?！褶D(zhuǎn)錄酶:真核生物中參與rRNA基因轉(zhuǎn)錄的酶是RNA聚合酶Ⅰ?！袂绑w加工前體rRNA在核仁中被酶剪切成3個rRNA產(chǎn)物,轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)則被降解掉。根據(jù)3H標(biāo)記的尿嘧啶和放線菌素D研究人的培養(yǎng)細胞前體rRNA的合成的結(jié)果推測了前體rRNA的加工過程。核輸入與核輸出■5SrRNA基因的轉(zhuǎn)錄與加工5SrRNA是核糖體大亞基的一個組份,原核生物和真核生物都有5SrRNA,而且結(jié)構(gòu)相似?！?SrRNA基因:真核生物的5SrRNA基因與其他三種rRNA基因不在同一條染色體上,它是由核仁以外的染色體基因轉(zhuǎn)錄的,然后運輸?shù)胶巳蕛?nèi)參與核糖體的裝配。二、核糖體蛋白質(zhì)與rRNA的功能分析核糖體上具有一系列與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的結(jié)合位點與催化位點在蛋白質(zhì)合成中肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性研究核糖體的功能位點原核生物核糖體中有四種與RNA分子結(jié)合的位點,其中一個是與mRNA結(jié)合的位點,另三個是與tRNA結(jié)合的位點。A位點(Asite)P位點(Psite)E位點(exitsite,Esite)mRNA結(jié)合位點與新?lián)饺氲陌滨?tRNA的結(jié)合位點——氨?；稽c,又稱A位點。與延伸中的肽酰-tRNA的結(jié)合位點——肽?；稽c,又稱P位點。肽酰轉(zhuǎn)移后與即將釋放的tRNA的結(jié)合位點——E位點(exitsite)。與肽酰tRNA從A位點轉(zhuǎn)移到P位點有關(guān)的轉(zhuǎn)移酶(即延伸因子EF-G)的結(jié)合位點--GTP酶的結(jié)合位點。肽酰轉(zhuǎn)移酶的催化位點。與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的其它起始因子、延伸因子和終止因子的結(jié)合位點。核糖體的功能位點在蛋白質(zhì)合成中肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性研究

核糖體蛋白

在核糖體中rRNA是起主要作用的結(jié)構(gòu)成分

r蛋白質(zhì)的主要功能

核糖體蛋白很難確定哪一種蛋白具有催化功能:在E.coli中核糖體蛋白突變甚至缺失對蛋白質(zhì)合并沒有表現(xiàn)出“全”或“無”的影響。多數(shù)抗蛋白質(zhì)合成抑制劑的突變株，并非由于r蛋白的基因突變而往往是rRNA基因突變。在整個進化過程中rRNA的結(jié)構(gòu)比核糖體蛋白的結(jié)構(gòu)具有更高的保守性。在核糖體中rRNA是起主要作用的結(jié)構(gòu)成分

具有肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性；

為tRNA提供結(jié)合位點(A位點、P位點和E位點)；

為多種蛋白質(zhì)合成因子提供結(jié)合位點；

在蛋白質(zhì)合成起始時參與同mRNA選擇性地結(jié)合以及在肽鏈的延伸中與mRNA結(jié)合；

核糖體大小亞單位的結(jié)合、校正閱讀(proofreading)、無意義鏈或框架漂移的校正、以及抗菌素的作用等都與rRNA有關(guān)。r蛋白質(zhì)的主要功能

對rRNA折疊成有功能的三維結(jié)構(gòu)是十分重要的；

在蛋白質(zhì)合成中,某些r蛋白可能對核糖體的構(gòu)象起“微調(diào)”作用；

在核糖體的結(jié)合位點上甚至可能在催化作用中,核糖體蛋白與rRNA共同行使功能。第二節(jié)多聚核糖體與蛋白質(zhì)的合成

多聚核糖體(polyribosome或polysome)

蛋白質(zhì)的合成

RNA在生命起源中的地位及其演化過程

多聚核糖體(polyribosome或polysome)概念:核糖體在細胞內(nèi)并不是單個獨立地執(zhí)行功能，而是由多個甚至幾十個核糖體串連在一條mRNA分子上高效地進行肽鏈的合成，這種具有特殊功能與形態(tài)結(jié)構(gòu)的核糖體與mRNA的聚合體稱為多聚核糖體。

多聚核糖體的生物學(xué)意義: 細胞內(nèi)各種多肽的合成,不論其分子量的大小或是mRNA的長短如何,單位時間內(nèi)所合成的多肽分子數(shù)目都大體相等。 以多聚核糖體的形式進行多肽合成，對mRNA的利用及對其濃度的調(diào)控更為經(jīng)濟和有效。多聚核糖體蛋白質(zhì)合成的基本過程蛋白質(zhì)合成，或稱mRNA翻譯是細胞中最復(fù)雜的合成活動。蛋白質(zhì)的合成需要攜帶氨基酸的各種tRNA.核糖體、mRNA.不同功能的蛋白質(zhì)、陽離子、GTP等的參與。蛋白質(zhì)的合成，是三種不同類型的RNA通力合作的結(jié)果。在核糖體上合成多肽鏈，分為三個完全不同的過程:鏈的起始、鏈的延伸、鏈的終止。1、蛋白質(zhì)合成的起始(initiation)蛋白質(zhì)合成的起始涉及到mRNA.起始tRNA和核糖體小亞基之間的相互作用，最后裝配成完整的核糖體。2、多肽鏈的延伸(elongation)一旦起始復(fù)合物形成，蛋白質(zhì)的合成隨即開始，此過程稱為蛋白質(zhì)合成的延伸。延伸涉及四個重復(fù)的步驟∶①氨酰tRNA進入核糖體的A位點；②肽鍵形成；③轉(zhuǎn)位;④脫氨酰tRNA釋放。上述四步的循環(huán)，使肽鏈不斷延長。在整個過程中，需要GTP和一些延長因子的參與。3.終止(termination)蛋白質(zhì)合成的終止是指核糖體沿著mRNA移動，如果進入A位的是終止密碼子，由于沒有與之匹配的反密碼子，而終止蛋白質(zhì)的合成。一共有三種終止密碼子:UAA.UAG、UGA，其中任何一種進入A位都會終止蛋白質(zhì)的合成，并導(dǎo)致多肽鏈從核糖體釋放出來。

RNA在生命起源中的地位

及其演化過程

生命是自我復(fù)制的體系

DNA代替了RNA的遺傳信息功能

蛋白質(zhì)取代了絕大部分RNA酶的功能

生命是自我復(fù)制的體系三種生物大分子，只有RNA既具有信息載體功能又具有酶的催化功能。因此，推測RNA可能是生命起源中最早的生物大分子。核酶(ribosome):具有催化作用的RNA。由RNA催化產(chǎn)生了蛋白質(zhì)DNA代替了RNA的遺傳信息功能DNA雙鏈比RNA單鏈穩(wěn)定；DNA鏈中胸腺嘧啶代替了RNA鏈中的尿嘧啶,使之易于修復(fù)。蛋白質(zhì)取代了絕大部分RNA酶的功能蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性與構(gòu)象的多變性；與RNA相比,蛋白質(zhì)能更為有效地催化多種生化反應(yīng),并提供更為復(fù)雜的細胞結(jié)構(gòu)成分,逐漸演化成今天的細胞。原核生物與真核生物核糖體成分的比較

E.coli核糖體小亞單位中rRNA與r蛋白的相互關(guān)系示意圖線條表示相互作用及作用力的強（粗線）與弱（細線）（引自Albertsetal,1989）E.coli（a）核糖體小亞