熒光定量PCR原理及實(shí)驗(yàn)步驟_第1頁(yè)
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熒光定量PCR原理及實(shí)驗(yàn)步驟一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理常規(guī)PCR技術(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。幾個(gè)概念：擴(kuò)增曲線：熒光閾值：Ct值：標(biāo)準(zhǔn)曲線SYBRGreen工作原理：1、SYBRGreen

能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位2、SYBRGreen

只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光3、變性時(shí)，DNA雙鏈分開(kāi)，無(wú)熒光4、復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)。二、實(shí)驗(yàn)步驟1.實(shí)驗(yàn)前先在大型儀器共享平臺(tái)上預(yù)約多元熒光定量PCR儀。將所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解凍。計(jì)算好所有引物和SYBgreen的用量。反應(yīng)體系（25μL）如下：H2O11μLSYBgreen12.5Μl上游引物0.25μL下游引物0.25μLcDNA1μL可先將H2O和SYBgreen按照所需量配好后，分裝，再根據(jù)需要加引

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