化學(xué)品 大型溞繁殖試驗 征求意見稿

1GB/TXXXXX—XXXX化學(xué)品大型溞繁殖試驗本文件描述了大型溞繁殖試驗的試驗原理、受試物信息、試驗準(zhǔn)備、試驗程序、質(zhì)量保證與質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)與報告。本文件適用于測試與評價可能暴露于水生生態(tài)環(huán)境的化學(xué)品對大型溞繁殖的影響。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T21801化學(xué)品快速生物降解性呼吸計量法試驗GB/T21802化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的MITI試驗（I）GB/T21803化學(xué)品快速生物降解性DOC消減試驗GB/T21830化學(xué)品溞類急性活動抑制試驗GB/T21831化學(xué)品快速生物降解性密閉瓶法試驗GB/T21845化學(xué)品水溶解度試驗GB/T21851化學(xué)品批平衡法檢測吸附/解吸附試驗GB/T21852化學(xué)品分配系數(shù)（正辛醇-水）高效液相色譜法試驗GB/T21853化學(xué)品分配系數(shù)（正辛醇-水）搖瓶法試驗GB/T21855化學(xué)品與pH有關(guān)的水解作用試驗GB/T21856化學(xué)品快速生物降解性二氧化碳產(chǎn)生試驗GB/T21857化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的OECD篩選試驗GB/T22052用液體蒸氣壓力計測定液體的蒸氣壓力溫度關(guān)系和初始分解溫度的方法GB/T22228工業(yè)用化學(xué)品固體及液體的蒸氣壓在10-1Pa至105Pa范圍內(nèi)的測定靜態(tài)法GB/T22229工業(yè)用化學(xué)品固體及液體的蒸氣壓在10-3Pa至1Pa范圍內(nèi)的測定蒸氣壓平衡法GB/T27850化學(xué)品快速生物降解性通則GB/T42426化學(xué)品蒸氣壓試驗OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.310快速生物降解—密閉瓶二氧化碳法（ReadyBiodegradability-CO2inSealedVessels）OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.316化學(xué)品在水中的光轉(zhuǎn)化（PhototransformationofChemicalsinWater）3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.12GB/TXXXXX—XXXX親溞parentanimals試驗開始時用于繁殖的雌溞。3.2幼溞offspring試驗期間親溞所產(chǎn)的溞。3.3繁殖量reproductiveoutput試驗期間親溞所產(chǎn)成活幼溞數(shù)。3.4死亡mortality溞體不動，即不能游動，或輕晃試驗容器，15s內(nèi)溞的附肢或后腹部也未見活動。3.5意外死亡Accidentalmortality由已知原因的意外導(dǎo)致、與受試物無關(guān)的死亡。3.6偶爾死亡Inadvertentmortality由未知原因?qū)е?、與受試物無關(guān)的死亡。3.7最低可觀察效應(yīng)濃度lowestobservedeffectconcentration;LOEC試驗期間，與對照組相比，觀察到的對受試生物產(chǎn)生顯著（p<0.05）效應(yīng)的最低受試物濃度。3.8無可觀察效應(yīng)濃度noobservedeffectconcentration;NOEC試驗中只略低于LOEC的受試物設(shè)置濃度，即試驗期間，與對照組相比，對受試生物未產(chǎn)生顯著（p<0.05）效應(yīng)的最高受試物設(shè)置濃度。3.9效應(yīng)濃度ECx引起受試生物繁殖量降低x％時的受試物濃度。3.10內(nèi)稟增長率intrinsicrateofincrease3GB/TXXXXX—XXXX綜合繁殖量與特定種齡死亡率來衡量種群增長能力的參數(shù)。穩(wěn)定狀態(tài)的種群，內(nèi)稟增長率為零；增長的種群，內(nèi)稟增長率為正；衰退的種群，內(nèi)稟增長率為負(fù)。3.11檢出限limitofdetection可檢出但不能定量的最低濃度。3.12檢測限limitofdetermination可定量測定的最低濃度。4試驗原理將溞齡小于24h的幼雌溞（親溞）暴露于一定濃度范圍的受試物溶液中開始試驗。試驗周期為21d。試驗結(jié)束時，應(yīng)對繁殖的成活幼溞的總數(shù)量和每只存活親溞繁殖的存活幼溞的總數(shù)量進(jìn)行評價（即不包括試驗期間死亡的幼溞）。親溞的繁殖量也可用其他方式表示，如從產(chǎn)生頭胎幼溞開始平均每只親溞每天產(chǎn)生的存活幼溞數(shù)量，不過這些結(jié)果應(yīng)另外計算。如果試驗期間親溞意外死亡和/或偶爾死亡，或者轉(zhuǎn)化為雄溞，這些平行應(yīng)在數(shù)據(jù)評估中被排除。通過對暴露于受試物中的親溞繁殖量與對照組的比較，確定最低可觀察效應(yīng)濃度（LOEC）和無可觀察效應(yīng)濃度（NOEC）。如可能，利用回歸模型估算ECx（如EC50、EC20或EC10）。還應(yīng)記錄存活的親溞數(shù)量和產(chǎn)頭胎溞的時間。生長情況（體長）和內(nèi)稟增長率等其他參數(shù)也應(yīng)研究。5受試物信息5.1在試驗前，應(yīng)已知受試物的下列信息：a)按照GB/T21845的方法測定的水中溶解度；b)按照GB/T22052、GB/T22228、GB/T22229、GB/T42426的方法測定的蒸氣壓和亨利常數(shù)；c)在水溶液中的定量分析方法、回收率以及檢測限；d)按照GB/T21830的方法測定的溞類急性活動抑制試驗數(shù)據(jù)。5.2可能需要受試物的下列信息：a)標(biāo)識信息（通用名、化學(xué)名），結(jié)構(gòu)式；b)純度；c)按照GB/T21855的方法測定的水解作用；d)按照OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.316的方法測定的光穩(wěn)定性；e)按照GB/T21852或GB/T21853的方法測定的正辛醇-水分配系數(shù)（Pow）；f)按照GB/T21801、GB/T21802、GB/T21803、GB/T21831、GB/T21856、GB/T21857、GB/T27850或OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則No.310的方法測定的快速生物降解性試驗結(jié)果。6參比物無推薦參比物。4GB/TXXXXX—XXXX7試驗準(zhǔn)備7.1儀器和設(shè)備7.1.1接觸到試驗溶液的試驗容器和其他設(shè)備宜是全玻璃制品或由其他化學(xué)惰性材料制成。試驗容器通常為燒杯。7.1.2需用下列部分或全部儀器設(shè)備：a)溶解氧測定儀（帶有微電極或其他能測定少量樣品的溶解氧濃度的適當(dāng)裝置）；b)適當(dāng)?shù)臏囟瓤刂圃O(shè)備；c)pH計；d)測定水硬度的設(shè)備；e)總有機(jī)碳（TOC）測定儀或化學(xué)需氧量（COD）測定儀；f)控制光照的設(shè)備以及測定光照強(qiáng)度的設(shè)備等。7.2受試生物準(zhǔn)備7.2.1受試生物的選擇受試生物為大型溞（DaphniamagnaStraus）。無性繁殖系宜用基因型鑒定。研究表明，在本文件給定條件下培育，品系A(chǔ)（來源于法國的IRCHA）始終滿足質(zhì)量控制要求，即存活親溞所產(chǎn)存活幼溞的平均值不少于60只。若能滿足質(zhì)量控制要求，也可使用其他的溞類品系。7.2.2受試生物的馴養(yǎng)試驗開始時，試驗用溞應(yīng)是溞齡小于24h的非頭胎溞。試驗用溞應(yīng)來源于同一個健康的保種培養(yǎng)容器，即未表現(xiàn)任何受脅迫現(xiàn)象（如死亡率高，出現(xiàn)雄溞和冬卵，初產(chǎn)延遲，體色異常等）。日常培養(yǎng)的條件（光照、溫度、培養(yǎng)基、喂食單位體積的動物數(shù)量）應(yīng)和試驗條件一致，如果試驗時所用培養(yǎng)基與日常使用的培養(yǎng)基不同，試驗前宜將試驗用溞在試驗條件下馴養(yǎng)3周（即一代），以避免新培養(yǎng)基對親溞產(chǎn)生脅迫作用。7.3試驗培養(yǎng)基7.3.1宜使用規(guī)定的培養(yǎng)基，如ElendtM4和M7培養(yǎng)基（見附錄A）。若能滿足大型溞培養(yǎng)的要求，也可考慮其他培養(yǎng)基。7.3.2如果使用的培養(yǎng)基中含有未規(guī)定的添加成分，應(yīng)在報告中詳細(xì)說明，特別是含有含碳組分。宜測定培養(yǎng)基的總有機(jī)碳（TOC）和（或）化學(xué)需氧量（COD）。培養(yǎng)基（在添加藻類食物之前）中的TOC應(yīng)小于2mg/L。7.3.3當(dāng)受試物含有金屬元素時，應(yīng)特別注意培養(yǎng)基的性質(zhì)（如硬度、螯合能力）有可能發(fā)生改變并改變受試物的毒性效應(yīng)。不宜使用ElendtM4和M7培養(yǎng)基，同樣盡量避免用含有已知螯合劑的其他培養(yǎng)基測含有金屬元素的物質(zhì)?？蛇x擇替代培養(yǎng)基，如參考美國材料與試驗協(xié)會（ASTM）指南配制不含有乙二胺四乙酸（EDTA）的硬質(zhì)淡水，并加入海藻提取物。盡管海藻中的有機(jī)物與金屬也有微弱的螯合作用，這種參考ASTM指南配制的硬質(zhì)淡水和海藻提取物的混合物也適合大型溞的長期培養(yǎng)和試驗。7.3.4試驗開始和試驗期間溶解氧濃度應(yīng)大于3mg/L。pH值在6~9范圍內(nèi)，在同一個試驗中變化不應(yīng)超過1.5個單位。硬度大于140mg/L(以CaCO3計)。7.4試驗溶液5GB/TXXXXX—XXXX7.4.1所選濃度的試驗溶液一般通過稀釋貯備液準(zhǔn)備。貯備液宜是將受試物加入到試驗用水中，用機(jī)械的方法（如振蕩、攪拌或者超聲波處理，或者其他適當(dāng)?shù)姆椒ǎ┗旌吓渲贫伞?.4.2應(yīng)盡量避免使用溶劑、乳化劑或分散劑，如不得已要使用這些物質(zhì)來配制適當(dāng)濃度的貯備液，除了試驗濃度組之外，應(yīng)設(shè)置足夠數(shù)量平行的稀釋水對照組和溶劑對照組。常用的溶劑有丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺和三甘醇。常用的分散劑有聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、0.01%的甲基纖維素甲醚和聚氧乙烯化氫化蓖麻油。有機(jī)溶劑或分散劑在溶液中的最大允許濃度不應(yīng)超過0.1mL/L。在此濃度下，上述溶劑和分散劑無毒且不會提高物質(zhì)的水中溶解度。任何情況下，受試物的濃度不能超過其在試驗用水中的溶解度。8試驗程序8.1暴露條件8.1.1試驗周期試驗周期為21d。8.1.2負(fù)荷親溞分開培養(yǎng)，每個容器一只，容器中培養(yǎng)基體積50mL~200mL。盡管允許合并各平行的溶液進(jìn)行化學(xué)分析，有時為了分析測定受試物濃度，需要增加溶液的體積。如果溶液體積超過100mL，需要加大對大型溞的喂食量，并滿足喂食標(biāo)準(zhǔn)。對于流水式試驗，由于技術(shù)原因，試驗可分成4個平行，每組10只溞，放在一個較大的容器中，如果試驗設(shè)計有變化應(yīng)在報告中注明。8.1.3受試生物分組8.1.3.1對于半靜態(tài)試驗，每個試驗濃度至少10只溞，并單獨分開培養(yǎng)，對照組同樣處理。8.1.3.2對于流水式試驗，宜將40只溞分成4組，每組10只。也可減少溞的數(shù)量，至少20只，平均分成2個或4個平行。注：如果親溞有偶爾死亡/意外死亡，就無法計算試驗結(jié)束時每只存活親溞的繁殖量。因此，繁殖量用試驗開始時8.1.3.3親溞應(yīng)隨機(jī)分配到各試驗容器中，而且此后的操作也都應(yīng)按照隨機(jī)的方式進(jìn)行。否則會導(dǎo)致對濃度影響的錯誤分析。尤其是按處理組或濃度順序放置時，一些與時間有關(guān)的影響因素，如操作者疲勞或其他過失，都會對高濃度組導(dǎo)致更大的影響。此外，如果試驗結(jié)果可能受初始因素或環(huán)境的影響，如各組試驗容器在實驗室中的位置，應(yīng)考慮結(jié)束試驗。8.1.4喂食8.1.4.1對于半靜態(tài)試驗，宜每天喂食，至少每周3次（即換液時喂食）。應(yīng)考慮添加藻懸浮液稀釋受試物溶液暴露濃度的可能性，并使用濃縮的藻懸浮液盡量避免此類情況發(fā)生。由其他試驗方式（如采用流水式試驗）造成的差異應(yīng)在報告中說明。[現(xiàn)為Pseudokirchneriellasubcapitata(11)]和柵藻（Scenedesumssubspicatus）。喂食量應(yīng)以提供給每只親溞的有機(jī)碳數(shù)量為基礎(chǔ)。研究表明，大型溞的喂食量在0.1mg~0.2mg(以碳計)?(溞-1?d-1)6GB/TXXXXX—XXXX之間，可滿足繁殖試驗的要求。試驗期間的喂食量可保持穩(wěn)定不變，也可在初期稍低，隨著親溞的生長逐漸增加喂食量，但始終應(yīng)在推薦的0.1mg~0.2mg(以碳計)?(溞-1?d-1)范圍內(nèi)。8.1.4.3如果用替代測定的方法，如藻細(xì)胞數(shù)量法或光吸收法，來計算喂食率（由于碳含量測定受時間限制，為方便起見，可用這些方法替代每個實驗室都應(yīng)單獨建立碳含量和藻細(xì)胞濃度之間的直線圖（見附錄B）。直線圖應(yīng)至少每年校準(zhǔn)一次，如果藻類的培養(yǎng)條件發(fā)生變化，還應(yīng)增加校準(zhǔn)頻率。此外發(fā)現(xiàn)光吸收法比藻細(xì)胞數(shù)量法更適合作為替代測定的方法。8.1.4.4應(yīng)給大型溞喂食經(jīng)濃縮的藻液，以減少進(jìn)入試驗容器中的藻培養(yǎng)基。濃縮藻液可通過離心獲得，然后用蒸餾水、去離子水或溞培養(yǎng)基使其重新懸浮。8.1.5光照每天16h光照，在試驗容器水面的光照強(qiáng)度不超過15μE.m-2.s-1~20μE.m-2.s-1。8.1.6試驗溫度試驗溶液的溫度應(yīng)控制在18℃~22℃。同一試驗中，19℃~21℃或20℃~22℃)。可另增加一個試驗容器監(jiān)測溫度變化。8.1.7曝氣試驗期間不曝氣。8.1.8確定濃度范圍的預(yù)試驗宜先進(jìn)行一個尋找濃度范圍的預(yù)試驗，例如設(shè)置5個試驗濃度組和1個對照組；每個試驗濃度組設(shè)置2個平行，對照組不設(shè)平行。與受試物性質(zhì)類似的化合物的溞類和/或其他水生生物的急性毒性試驗結(jié)果，或者參考文獻(xiàn)，對于確定預(yù)試驗濃度范圍可能有參考作用。預(yù)試驗進(jìn)行21天，或到足以可靠地預(yù)估出效應(yīng)水平為止。試驗結(jié)束時，評估溞類的繁殖情況，記錄親溞和幼溞的數(shù)量。8.1.9正式試驗8.1.9.1應(yīng)預(yù)先知道受試物的毒性（通過急性毒性試驗或8.1.8中的預(yù)試驗得知以助于選擇適當(dāng)?shù)脑囼灊舛取?.1.9.2正式試驗一般包括5個濃度，按幾何級數(shù)排列，濃度的間隔系數(shù)不大于3.2，每個濃度應(yīng)有適當(dāng)?shù)钠叫袛?shù)量和溞數(shù)（見8.1.3）。如果試驗濃度少于5個，應(yīng)在試驗報告中給予合理解釋。受試物濃度不應(yīng)超過其在試驗溶液中的溶解度。8.1.9.3設(shè)置濃度范圍時，應(yīng)注意：a)若旨在評估繁殖效應(yīng)的ECx，應(yīng)有足夠多的試驗濃度來計算ECx和置信區(qū)間。使用的測試濃度宜涵蓋預(yù)估的ECx，即ECx是通過內(nèi)插而不是外推得到的。隨后統(tǒng)計分析的優(yōu)點是試驗濃度更多(例如10個)、每個濃度的平行較少(例如5個，從而保持容器總數(shù)恒定)，以及有10個對照b)若旨在獲得LOEC和（或）NOEC，最低試驗濃度組的繁殖量不應(yīng)顯著低于對照組。否則，應(yīng)降低試驗濃度重新試驗。最高試驗濃度組的繁殖量應(yīng)顯著低于對照組。否則，應(yīng)提高試驗濃度重新試驗，除非在初始試驗中使用的最高試驗濃度是慢性效應(yīng)試驗所需的最高試驗濃度(如10mg/L)。7GB/TXXXXX—XXXX8.1.10限度試驗8.1.10.1若在8.1.8中預(yù)試驗受試物的最高濃度(例如10mg/L)下沒有觀察到效應(yīng)，或者根據(jù)受試物對其他生物的低毒性和/或低吸收資料推測受試物有可能是低毒或無毒時，該繁殖試驗可按限度試驗進(jìn)行，使用一個試驗濃度組（例如10mg/L）和對照組。試驗組和對照組各設(shè)10個平行。8.1.10.2如在流水式系統(tǒng)中進(jìn)行限度試驗，可適當(dāng)減少平行。8.1.10.3限度試驗將提供機(jī)會，以證明在該限定濃度下沒有統(tǒng)計學(xué)意義上顯著效應(yīng)；但如果發(fā)現(xiàn)有顯著效應(yīng)，則應(yīng)進(jìn)行完整的正式試驗。8.1.11對照組8.1.11.1應(yīng)設(shè)置試驗培養(yǎng)基對照組（空白對照組）。若使用溶劑或分散劑，還應(yīng)增設(shè)溶劑對照組或分散劑對照組，溶劑或分散劑的濃度應(yīng)與含有受試物的容器中的一致。各對照組應(yīng)設(shè)適當(dāng)數(shù)量的平行（見8.1.3）。8.1.11.2對照組每只親溞間的繁殖量的變異系數(shù)應(yīng)不大于25%；對于親溞使用單獨培養(yǎng)方式設(shè)計的試驗，應(yīng)在報告中注明。8.1.12試驗培養(yǎng)基更換8.1.12.1根據(jù)受試物的穩(wěn)定性確定試驗培養(yǎng)基的更換頻率，但至少每周3次。若在為期最長3d的穩(wěn)定性預(yù)試驗中表明受試物不穩(wěn)定（如在配制濃度值的80%~120%范圍外或低于初始濃度測定值的80%應(yīng)考慮增加更換頻率，或使用流水式系統(tǒng)。8.1.12.2半靜態(tài)試驗的溶液更換時，應(yīng)準(zhǔn)備另一套試驗容器用于放置親溞，可用內(nèi)徑合適的玻璃吸管轉(zhuǎn)移親溞。轉(zhuǎn)移親溞時應(yīng)盡量少吸原容器培養(yǎng)基的體積。8.2觀察試驗期間的觀察結(jié)果應(yīng)形成記錄表格（見附錄C和附錄D的示例）。如果要求測定其他參數(shù)，其他觀察指標(biāo)也應(yīng)記錄（見4原理和8.5其他參數(shù)）。8.3幼溞從頭胎溞開始，每天從試驗器皿中移出幼溞并計數(shù)，以避免消耗食物影響親溞。計數(shù)存活的幼溞，對死胎和死亡的幼溞也要進(jìn)行記錄。8.4死亡率試驗期間應(yīng)每天記錄親溞的死亡情況，或者至少與幼溞記數(shù)次數(shù)相同。8.5其他參數(shù)盡管本方法設(shè)計的主要目的是評價受試物對溞繁殖能力的影響，其他的影響因素也可能被充分定量以滿足統(tǒng)計分析的要求?？捎涗浢恐淮婊钣H溞的繁殖量，即試驗期間每只存活親溞所產(chǎn)成活幼溞數(shù)。這可與主要反應(yīng)變量（在試驗開始每只親溞繁殖的幼溞，這里的親溞是指試驗期間沒有意外死亡或偶爾死亡的親溞）進(jìn)行比較。如果暴露的平行中發(fā)生親溞死亡，則應(yīng)考慮死亡率是否符合一個濃度-反應(yīng)模型，例如，是否存在一個對受試物濃度的反應(yīng)有正斜率的顯著回歸（這里可使用一個類似Cochran-Armitage趨勢檢驗的統(tǒng)計檢驗）。如果死亡率不符合一個濃度-反應(yīng)模型，則應(yīng)將那些具有親溞死亡的平行排除在試驗結(jié)果分析之外。如果死亡率符合一個濃度-反應(yīng)模型，則親溞死亡應(yīng)歸因于受試物的影響，并且8GB/TXXXXX—XXXX不應(yīng)從試驗結(jié)果的分析中排除這些平行。既然有足夠的信息表明可能的亞致死效應(yīng)會比單一的繁殖力更能說明問題，因此生長情況測量是非常值得一提的參數(shù)；另外宜在試驗結(jié)束時測定親溞的體長（不包括尾刺）。其他用來測量或計算的參數(shù)包括：親溞頭胎（及隨后的幾胎）產(chǎn)溞時間、每只親溞產(chǎn)溞總胎數(shù)和每胎產(chǎn)溞數(shù)、死胎數(shù)量、雄溞數(shù)或冬卵、種群內(nèi)稟增長率。幼溞性別鑒定見附件F。8.6分析測定頻率8.6.1至少每周測定一次對照組和最高試驗濃度組的新、舊溶液的溶解氧濃度、溫度、硬度和pH值。8.6.2試驗期間，應(yīng)定期測定受試物濃度。8.6.3半靜態(tài)試驗的受試物濃度應(yīng)保持在配制濃度的±20%的范圍內(nèi)（見5和8.1.12）。宜在試驗開始后第一周內(nèi)的新制備時和更換試液時至少測定一次最高和最低濃度組的新配制的溶液（新、舊溶液應(yīng)為同一試液中的樣品）。此后，至少每周分析一次。8.6.4當(dāng)受試物濃度不在配制濃度的±20%范圍內(nèi)，應(yīng)分析所有新、舊試驗溶液。當(dāng)初始濃度是可重復(fù)且穩(wěn)定的，即在配制濃度的80%~120%范圍內(nèi)，第2周~3周內(nèi)可只測最高與最低濃度組。在所有情況下，僅在每一濃度的一個平行容器被更新之前測定受試物濃度。8.6.5若采用流水式試驗，除無需測定待更新試驗溶液之外，半靜態(tài)試驗中所述采樣方法同樣適用。在試驗第一周，宜增加隨機(jī)采樣次數(shù)（例如三次）以確保試驗濃度保持穩(wěn)定。應(yīng)每天檢查稀釋率及受試物濃度（即稀釋水和受試物貯備液流速）。8.6.6在整個試驗期間，若證明受試物濃度保持在配制濃度或初始測定濃度的±20%范圍內(nèi)，那么結(jié)果應(yīng)以配制濃度或初始測定濃度為基礎(chǔ)。若偏差大于配制濃度或初始測定濃度的±20%，結(jié)果應(yīng)以時間-加權(quán)平均值（參見附錄E）表示。9質(zhì)量保證與質(zhì)量控制9.1試驗開始時所用親溞溞齡小于24h，且為非頭胎溞。9.2試驗結(jié)束時，親溞（雌溞）的死亡率不超過20%，且平均每只存活親溞所產(chǎn)成活幼溞不少于60只。10數(shù)據(jù)與報告10.1結(jié)果處理10.1.1一般要求按每個試驗容器（即平行）計算每只親溞所產(chǎn)成活幼溞總數(shù)。任一平行中，若親溞在試驗期間意外死亡或偶爾死亡，或轉(zhuǎn)化成雄溞，則應(yīng)在結(jié)果處理時排除此平行。然后，按扣除后的平行數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。如果在暴露的平行中發(fā)生親溞死亡，則應(yīng)考慮這些死亡是否遵循一個濃度-反應(yīng)模型。例如，如果對受試物濃度的反應(yīng)有一個正斜率的顯著的回歸(可用一個類似于Cochran-Armitage趨勢檢驗的統(tǒng)計檢驗)。如果死亡率不符合濃度-反應(yīng)模型，則應(yīng)將那些具有親溞死亡的平行從試驗結(jié)果的分析中排除。如果這些死亡率符合濃度-反應(yīng)模型，則這些親溞死亡應(yīng)歸因于受試物的影響，并且不應(yīng)從試驗結(jié)果的分析中排除這些平行9GB/TXXXXX—XXXX總之，當(dāng)用LOEC、NOEC或者ECx來表示效應(yīng)時，宜用以上提到的2個反應(yīng)變量計算繁殖效應(yīng)，即：試驗期間非偶爾/意外死亡的每只親溞所產(chǎn)成活幼溞總數(shù)和每只存活親溞所產(chǎn)成活幼溞數(shù)。然后用這2個反應(yīng)變量中的任何一個計算最后的結(jié)果，即最小的LOEC、NOEC或者ECx。在使用統(tǒng)計分析之前，如方差分析（ANOVA）、通過Studentt檢驗、Dunnett’s檢驗、Williams檢驗或者stepdownJonckheere-Terpstra檢驗比較試驗濃度組和對照組，如果要滿足特殊的統(tǒng)計檢驗方法的需要，宜先考慮數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換。如果要用非參數(shù)的檢驗方法可考慮用Dunn’s或者M(jìn)ann-Whitney’s檢驗。95%的置信區(qū)間以單個處理的方法進(jìn)行計算。未處理的對照組中存活的親溞數(shù)量是試驗的一個有效性指標(biāo)，并且應(yīng)予以記錄和報告。另外，所有有害效應(yīng)，如異常行為和毒理學(xué)上的顯著效應(yīng)，同樣應(yīng)在最后的報告中說明。10.1.2ECx的結(jié)果處理用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法（如邏輯回歸或者威布爾分布函數(shù)、trimmedSpearman-Karber方法、或簡單的插值法）計算ECx值及相關(guān)的置信區(qū)間。為了計算EC10、EC50或任何其他ECx，應(yīng)對完整的數(shù)據(jù)集進(jìn)行回歸分析。10.1.3NOEC/LOEC的結(jié)果處理如果用統(tǒng)計分析確定NOEC/LOEC，應(yīng)根據(jù)OECD的54號文件“關(guān)于目前處理生態(tài)毒性數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析方法：應(yīng)用指南”使用合適的統(tǒng)計學(xué)方法。通常，用p=0.05的單側(cè)假設(shè)檢驗將試驗濃度組的有害效應(yīng)與對照組相比。正態(tài)分布和方差齊性可用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計檢驗方法進(jìn)行檢驗，如Shapiro-Wilk（p=0.05）和Levene檢驗（p=0.05）。可進(jìn)行單邊方差分析和后續(xù)的多重比較檢驗。多重比較（如Dunnett's檢驗）或者step-down趨勢檢驗（如Williams或者stepdownJonckheere-Terpstra檢驗）可用來計算各個試驗濃度組與對照組之間是否存在顯著差異（p=0.05根據(jù)OECD的54號指南文件選擇推薦的檢驗方法）。另外，非參數(shù)檢驗方法（如根據(jù)Holm或者Jonckheere-Terpstra趨勢檢驗得到的Bonferroni-U檢驗）可用來確定NOEC和LOEC。10.1.4限度試驗的結(jié)果處理如果進(jìn)行限度試驗（僅比較對照組和一個試驗濃度組并且滿足參數(shù)檢驗方法的先決條件（正態(tài)分布和方差齊性可用Student檢驗(t檢驗)方法評估度量響應(yīng)。如果這些要求都沒有滿足，可使用一個不等方差的t檢驗方法（如Welch檢驗）或者如Mann-Whitney-U檢驗的一個非參數(shù)檢驗方法。為了確定對照組間（對照組和溶劑對照組、分散劑對照組）的顯著性差異，每個對照組的各個平行可進(jìn)行限度試驗。如果這些試驗檢查不出顯著性差異，那所有對照組和溶劑對照組的平行可合并。否則，所有試驗濃度組應(yīng)與溶劑對照組進(jìn)行比較。10.2試驗報告試驗報告應(yīng)包括下列內(nèi)容：a)受試物：.通用名、化學(xué)名、CAS號；.物理屬性和相關(guān)理化性質(zhì)；.化學(xué)鑒定數(shù)據(jù)，包括純度。b)受試生物：.品系（無論是否進(jìn)行過遺傳鑒定），提供者（如果已知）和培養(yǎng)條件；.如果不使用大型溞，而用其他種類，應(yīng)做鑒定并在報告中說明。c)試驗條件：GB/TXXXXX—XXXX.試驗程序（如半靜態(tài)或流水式試驗，體積，每升負(fù)荷溞數(shù)）；.光照周期和光照強(qiáng)度；.試驗設(shè)計（平行數(shù)，每一平行的溞數(shù)）；.所用培養(yǎng)基的詳細(xì)說明；.若另外添加有機(jī)物，包括成分、來源、制備方法、貯備液中的TOC/COD、試驗培養(yǎng)基TOC/COD測定值；.喂食的詳細(xì)資料，包括喂食量（以mgC/(溞?d)為單位）和喂食時間表（例如食物類型，包括藻的名稱、品系、培養(yǎng)條件）；.試驗貯備液的配制方法和更新頻率（若使用助溶劑，應(yīng)給出其濃度）。d)試驗結(jié)果：.關(guān)于受試物穩(wěn)定性的任何預(yù)試驗結(jié)果；.配制試驗濃度和確定試驗容器中受試物濃度的所有分析結(jié)果（參見附錄5的示例數(shù)據(jù)表測定方法的回收率與檢測限；.每個容器中受試物的實測濃度。添加回收試驗的方法和儀器的最低檢測限；.試驗容器中的水質(zhì)（pH值、溫度和溶解氧濃度、TOC和/或COD、硬度）；.試驗期間每只親溞所產(chǎn)存活幼溞的完整記錄（參見附錄4的示例數(shù)據(jù)表）；.親溞死亡數(shù)及其死亡時間（參見附錄4的示例數(shù)據(jù)表）；.對照組繁殖量的變異系數(shù)（以試驗結(jié)束時每只存活親溞所產(chǎn)成活幼溞總數(shù)為基礎(chǔ)）；.以試驗結(jié)束時每一平行中每只存活親溞（不包括試驗期間偶爾死亡和/或意外死亡的親溞）所產(chǎn)成活幼溞總數(shù)對受試物濃度作圖；.每個平行中每只存活的親溞所產(chǎn)成活幼溞總數(shù)對受試物濃度作適當(dāng)?shù)膱D；.若適用，應(yīng)報告繁殖的最低可觀察效應(yīng)濃度（LOEC），包括對所使用的統(tǒng)計方法的描述和被檢測到的效應(yīng)的大小（實驗開始前先進(jìn)行有力的分析，為LOEC的測定起輔助作用報告繁殖的無可觀察效應(yīng)濃度（NOEC）；用來計算LOEC和NOEC值的反應(yīng)變量的信息(或者作為試驗期間每個非偶爾死亡/意外死亡的親溞所產(chǎn)的總的成活幼溞數(shù)，又或者作為每只存活親溞所產(chǎn)成活幼溞總數(shù))，若適用，應(yīng)報告親溞死亡的LOEC/NOEC；.最低可觀察效應(yīng)濃度（LOEC），無可觀察效應(yīng)濃度（NOEC），若可能，也可記錄親溞死亡的LOEC和（或）NOEC；.若適用，ECx和置信區(qū)間，用于計算的模型曲線，濃度-反應(yīng)曲線的斜率及其標(biāo)準(zhǔn)誤差；.其他觀察到或測定的生物學(xué)效應(yīng)（如親溞生長等），并加以合理的解釋；.對于試驗中任何偏離本導(dǎo)則的解釋說明。GB/TXXXXX—XXXXElendtM4和M7培養(yǎng)基的制備A.1對ElendtM4和M7培養(yǎng)基的適應(yīng)根據(jù)一些實驗室的經(jīng)驗，很難將溞直接轉(zhuǎn)移到M4和M7培養(yǎng)基中。應(yīng)通過逐步適應(yīng)的過程：即將溞從原培養(yǎng)基中取出，放入比例較低的Elendt培養(yǎng)基中，如30%的Elendt培養(yǎng)基中，然后增大Elendt培養(yǎng)基的比例到60%，再逐漸增至100%。大約需要一個月左右。A.2配制A.2.1微量元素首先使用合格的純凈水，如去離子水、蒸餾水或反滲透水分別配制各微量元素的貯備液Ⅰ。再用貯備液Ⅰ制備貯備液Ⅱ,它含有所有微量元素（混合液），見表A.1。表A.1ElendtM4和M7培養(yǎng)基貯備液Ⅱ的制備HBOMnClOONaMoOOOONaSeONHVONaEDTAO--FeSOO--A.2.2M4和M7培養(yǎng)基用貯備液Ⅱ、常量營養(yǎng)元素和維生素配制M4和M7培養(yǎng)基，具體見表A.2。GB/TXXXXX—XXXX表A.2M4和M7培養(yǎng)基的配制OMgSOONaHCONaSiOONaNOKHPOKHPO-混合維生素貯備液以較小分裝冷藏保存。在使用前把維生素加入到培養(yǎng)基中。GB/TXXXXX—XXXX（資料性）總有機(jī)碳(TOC)分析與喂食的藻中TOC含量的線性圖繪制喂食的藻中的碳含量通常不能直接測定，可用替代測量參數(shù)（例如藻細(xì)胞數(shù)或光吸收）的相關(guān)性（即線性圖）來確定碳含量。測定TOC，高溫氧化法優(yōu)于紫外（UV）或過硫酸鹽法。繪制線性圖，采用離心法將藻從生長的培養(yǎng)基中分離，隨后用蒸餾水重新懸浮。在每一濃度用三個平行測定替代參數(shù)和TOC濃度。分析蒸餾水空白并從藻樣TOC濃度推出TOC濃度。線性圖的線性部分涵蓋碳濃度范圍要求。如圖B.1、圖B.2、圖B.3的例子所示。注：這幾個圖僅為示例，不能用于交流，各實圖B.1總有機(jī)碳（TOC）分析與喂食的藻中TOC含量示意圖一GB/TXXXXX—XXXX圖B.2總有機(jī)碳（TOC）分析與喂食的藻中TOC含量示意圖二圖B.3總有機(jī)碳（TOC）分析與喂食的藻中TOC含量示意圖三GB/TXXXXX—XXXX（資料性）培養(yǎng)基更換，物理-化學(xué)監(jiān)測數(shù)據(jù)，喂食、大型溞繁殖和親溞死亡率數(shù)據(jù)記錄表示例C.1大型溞繁殖試驗觀察記錄表示例見表C.1表C.1大型溞繁殖試驗觀察記錄表試驗號：開始日期：品系：培養(yǎng)基：食物類型：受試物：配制濃度：0123456789新舊新舊新舊GB/TXXXXX—XXXXGB/TXXXXX—XXXX化學(xué)分析結(jié)果記錄數(shù)據(jù)表示例D.1化學(xué)分析結(jié)果記錄數(shù)據(jù)表見表D.1和表D.2表D.1化學(xué)分析測定濃度記錄數(shù)據(jù)表表D.2測定濃度記錄數(shù)據(jù)表（以配制濃度的百分率表示）GB/TXXXXX—XXXX時間-加權(quán)平均值的計算E.1時間—加權(quán)平均值的計算若受試物濃度在更換培養(yǎng)基期間是下降的，應(yīng)基于生物學(xué)和統(tǒng)計學(xué)的考慮，選擇某個濃度作為親溞暴露濃度范圍的代表。若繁殖主要受峰值濃度影響，則應(yīng)使用最高濃度，若認(rèn)為受試物的蓄積和長期效應(yīng)更為重要，則時間-加權(quán)平均濃度更合適。時間-加權(quán)平均濃度的示例如圖E.1所示：圖E.1時間-加權(quán)平均值示例圖E.1是個簡化了的試驗的示例，試驗持續(xù)7d，在第0d、2d、4d更新培養(yǎng)基。圖E.1中“之”字形線代表任意時間點的濃度，假定濃度是沿著某一指數(shù)衰減過程下降的；6個方形點代表在每一個更換周期開始與結(jié)束時測定的濃度；粗實線表示時間-加權(quán)平均值的位置。因時間-加權(quán)平均值下的面積與濃度曲線下的面積相等，可經(jīng)計算得出時間-加權(quán)平均值。上例的計算見表E.1。GB/TXXXXX—XXXX表E.1時間-加權(quán)平均值計算dCCS122233每一個更新周期指數(shù)曲線下的面積用式（E.1）進(jìn)行計算。S=C0-C