現(xiàn)代分子生物學(xué)(筆記)-朱玉賢-第三版

PAGE78第一章緒論分子生物學(xué)分子生物學(xué)的基本含義(p8)分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等所有生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)，是人類從分子水平上真正揭開生物世界的奧秘，由被動(dòng)地適應(yīng)自然界轉(zhuǎn)向主動(dòng)地改造和重組自然界的基礎(chǔ)學(xué)科。分子生物學(xué)與其它學(xué)科的關(guān)系分子生物學(xué)是由生物化學(xué)、生物物理學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、以至信息科學(xué)等多學(xué)科相互滲透、綜合融會(huì)而產(chǎn)生并發(fā)展起來的，凝聚了不同學(xué)科專長(zhǎng)的科學(xué)家的共同努力。它雖產(chǎn)生于上述各個(gè)學(xué)科，但已形成它獨(dú)特的理論體系和研究手段，成為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科。生物化學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系最為密切:生物化學(xué)是從化學(xué)角度研究生命現(xiàn)象的科學(xué)，它著重研究生物體內(nèi)各種生物分子的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)變與新陳代謝。傳統(tǒng)生物化學(xué)的中心內(nèi)容是代謝，包括糖、脂類、氨基酸、核苷酸、以及能量代謝等與生理功能的聯(lián)系。分子生物學(xué)則著重闡明生命的本質(zhì)主要研究生物大分子核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能、生命信息的傳遞和調(diào)控。細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系也十分密切:傳統(tǒng)的細(xì)胞生物學(xué)主要研究細(xì)胞和亞細(xì)胞器的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能。探討組成細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)比單純觀察大體結(jié)構(gòu)能更加深入認(rèn)識(shí)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，因此現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展越來越多地應(yīng)用分子生物學(xué)的理論和方法。分子生物學(xué)則是從研究各個(gè)生物大分子的結(jié)構(gòu)入手，但各個(gè)分子不能孤立發(fā)揮作用，生命絕非組成成分的隨意加和或混合，分子生物學(xué)還需要進(jìn)一步研究各生物分子間的高層次組織和相互作用，尤其是細(xì)胞整體反應(yīng)的分子機(jī)理，這在某種程度上是向細(xì)胞生物學(xué)的靠攏。第一章序論1859年發(fā)表了《物種起源》，用事實(shí)證明“物競(jìng)天擇，適者生存”的進(jìn)化論思想。指出：物種的變異是由于大自然的環(huán)境和生物群體的生存競(jìng)爭(zhēng)造成的，徹底否定了“創(chuàng)世說”。達(dá)爾文第一個(gè)認(rèn)識(shí)到生物世界的不連續(xù)性。意義：達(dá)爾文關(guān)于生物進(jìn)化的學(xué)說及其唯物主義的物種起源理論，是生物科學(xué)史上最偉大的創(chuàng)舉之一，具有不可磨滅的貢獻(xiàn)。細(xì)胞學(xué)說細(xì)胞學(xué)說的建立及其意義德國(guó)植物學(xué)家施萊登和德國(guó)動(dòng)物學(xué)家施旺共同提出：一切植物、動(dòng)物都是由細(xì)胞組成的，細(xì)胞是一切動(dòng)植物的基本單位。經(jīng)典遺傳學(xué)兩條基本規(guī)律:統(tǒng)一律：當(dāng)兩種不同植物雜交時(shí)，它們的下一代可能與親本之一完全相同；分離規(guī)律：將不同植物品種雜交后的F1代種子再進(jìn)行雜交或自交時(shí)，下一代就會(huì)按照一定的比例分離，因而具有不同的形式。1865年發(fā)表《植物雜交試驗(yàn)》，直到1900年才被人們重新發(fā)現(xiàn)。孟德爾被公認(rèn)為經(jīng)典遺傳學(xué)的奠基人?，F(xiàn)代遺傳學(xué)Morgan及其助手第一次將代表某一特性的基因同染色體聯(lián)系起來，使科學(xué)界普遍認(rèn)識(shí)了染色體的重要性并接受了孟德爾的遺傳學(xué)原理。Morgan特別指出：種質(zhì)必須由某些獨(dú)立的要素組成，我們把這些要素稱為遺傳因子或基因。第二節(jié)分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史準(zhǔn)備和醞釀階段（19世紀(jì)后期到20世紀(jì)50年代初）對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)上的兩點(diǎn)重大突破：1．確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)2．確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段（20世紀(jì)50年代初到70年代初）這一階段以1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型作為現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑開創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基本理論建立和發(fā)展的黃金時(shí)代。在此期間的主要進(jìn)展包括：遺傳信息傳遞中心法則的建立對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)DNA雙螺旋發(fā)現(xiàn)的意義：確立了核酸作為信息分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；提出了堿基配對(duì)是核酸復(fù)制、遺傳信息傳遞的基本方式；從而最后確定了核酸是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，為認(rèn)識(shí)核酸與蛋白質(zhì)的關(guān)系及其在生命中的作用打下了最重要的基礎(chǔ)。Crick于1954年所提出遺傳信息傳遞的中心法則（CentralDogma）：初步認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并開始改造生命的深入發(fā)展階段（20世紀(jì)70年代后至今）基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為標(biāo)志。其間的重大成就包括：重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展基因組研究的發(fā)展單克隆抗體及基因工程抗體的建立和發(fā)展基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理研究成為新的前沿領(lǐng)域第三節(jié)分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容一．DNA重組技術(shù)（recombinantDNAtechnology）定義：又稱為基因工程，根據(jù)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的原理，將一種生物的遺傳物質(zhì)DNA轉(zhuǎn)移到另一生物體中，使后者獲得新的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。DNA重組技術(shù)的應(yīng)用：利用微生物基因工程生產(chǎn)重組基因工程藥物轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物體細(xì)胞克隆基因表達(dá)與調(diào)控的基礎(chǔ)研究二．生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究三．基因組、功能基因組與生物信息學(xué)的研究基因組、蛋白質(zhì)組與生物信息學(xué)基因組(Genome)：細(xì)胞或生物體一條完整單體的全部染色體遺傳物質(zhì)的總和。人類基因組計(jì)劃（HumanGenomeProject,HGP）：測(cè)定出人基因組全部DNA3109鹼基對(duì)的序列、確定人類約5-10萬個(gè)基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)?；蚪M、蛋白質(zhì)組與生物信息學(xué)蛋白組計(jì)劃（Proteomeproject）:又稱為后基因組計(jì)劃或功能基因組計(jì)劃，用于揭示并闡明細(xì)胞、組織乃至整個(gè)生物個(gè)體全部蛋白質(zhì)及其功能。生物信息學(xué)（Bioinformatics）:是在生命科學(xué)的研究中，以計(jì)算機(jī)為工具對(duì)生物信息進(jìn)行儲(chǔ)存、檢索和分析的科學(xué)。四．基因表達(dá)調(diào)控研究第二章染色體與DNA本章內(nèi)容1.染色體2.DNA的結(jié)構(gòu)3.DNA的復(fù)制4.原核生物和真核生物DNA復(fù)制特點(diǎn)5.DNA的修復(fù)6.DNA的轉(zhuǎn)座第一節(jié)染色體(chromosome)概念：染色體(chromosome)：原指真核生物細(xì)胞分裂中期具有一定形態(tài)特征的染色質(zhì)?，F(xiàn)在這一概念已擴(kuò)大為包括原核生物及細(xì)胞器在內(nèi)的基因載體的總稱。染色質(zhì)(chromatin)：由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，在分裂間期染色體結(jié)構(gòu)疏松，稱為染色質(zhì)。其實(shí)染色質(zhì)與染色體只是同一物質(zhì)在不同細(xì)胞周期的表現(xiàn)。常染色質(zhì)(euchromatin)：是進(jìn)行活躍轉(zhuǎn)錄的部位，呈疏松的環(huán)狀，電鏡下表現(xiàn)為淺染，易被核酸酶在一些敏感的位點(diǎn)(hypersensitivesites)降解。異染色質(zhì)(heterochromatin)：在間期核中處于凝縮狀態(tài)，無轉(zhuǎn)錄活性，也叫非活動(dòng)染色質(zhì)(inactivechromatin)，是遺傳惰性區(qū)。在細(xì)胞周期中表現(xiàn)為晚復(fù)制，早凝縮，即異固縮現(xiàn)象(heteropycnosis)。原核細(xì)胞與真核細(xì)胞特征分析染色體特性：分子結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定能夠自我復(fù)制，使親、子代之間保持連續(xù)性能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，從而控制整個(gè)生命過程能夠產(chǎn)生可遺傳的變異真核細(xì)胞染色體的組成DNA30%--40%組蛋白(histone)30%--40%非組蛋白(NHP)變化很大少量RNA染色體中的蛋白質(zhì)組蛋白(histone)：一類小的帶有豐富正電荷(富含Lys、Arg)的核蛋白，與DNA有高親和力。組蛋白是染色體的結(jié)構(gòu)蛋白，它與DNA組成核小體。組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3及H4。非組蛋白(non-histoneprotein)：是染色體上與特異DNA序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，所以又稱為序列特異性DNA結(jié)合蛋白。組蛋白具有如下特性：1、進(jìn)化上的極端保守性。2、無組織特異性。3、肽鏈上氨基酸分布的不對(duì)稱性。4、組蛋白的修飾作用。5、富含賴氨酸的組蛋白H5。非組蛋白：非組蛋白大約占組蛋白總量的60－70%，種類很多。（1）HMG蛋白(highmobilitygroupprotein)，能與DNA結(jié)合(不牢固)，也能與H1作用,可能與DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。（2）DNA結(jié)合蛋白：可能是一些與DNA的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶或調(diào)節(jié)物質(zhì)。（3）A24非組蛋白：與H2A差不多，位于核小體內(nèi)，功能不祥。非組蛋白的一般特性：1.非組蛋白的多樣性；非組蛋白的量大約是組蛋白的60%～70%，但它的種類卻很多，約在20-100種之間，其中常見的有15-20種。2.非組蛋白的組織專一性和種屬專一性。DNAC值：通常指一種生物單倍體基因組DNA的總量。C值反常現(xiàn)象：真核細(xì)胞基因組的最大特點(diǎn)是它含有大量的重復(fù)序列，而且功能DNA序列大多被不編碼蛋白質(zhì)的非功能DNA所隔開，這就是著名的“C值反?，F(xiàn)象”。染色體中的DNA根據(jù)DNA的動(dòng)力學(xué)研究，真核細(xì)胞DNA可分為：高度重復(fù)序列：幾百→幾萬copy。如：衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA。中度重復(fù)序列：10→幾百copy。如：各種rDNA、tDNA及組蛋白基因。低度重復(fù)序列：2→10copy。如：血紅蛋白。單拷貝序列：大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因和基因間間隔序列。只有一個(gè)拷貝。如：蛋清蛋白。染色體折疊DNA核小體螺線管圓筒超螺旋（1）核小體染色質(zhì)纖維細(xì)絲是許多核小體連成的念珠狀結(jié)構(gòu)。核小體(nucleosome)：DNA繞在組蛋白八聚體(H2A、H2B、H3、H4各一對(duì))核心外1.8周(146bp)，形成核小體核心顆粒。（2）螺線管10nm的染色質(zhì)細(xì)絲盤繞成螺旋管狀的30nm纖維粗絲，通稱螺線管（solenoid）。螺線管的每一螺旋包含6個(gè)核小體，其壓縮比為6。這種螺線管是分裂間期染色質(zhì)和分裂中期染色體的基本組分。（3）上述螺線管可進(jìn)一步壓縮形成超螺旋。由30nm螺線管纏繞而成一細(xì)長(zhǎng)、中空的圓筒，直徑為4000nm，壓縮比是40。（4）超螺旋進(jìn)一步壓縮1/5便成為染色體單體，總壓縮比是7×6×40×5，將近一萬倍。原核生物基因組特點(diǎn)：1、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)練2、存在轉(zhuǎn)錄單元多順反子mRNA3、有重疊基因Sanger1977在《Nature》上發(fā)表了ΦX174DNA的全部核苷酸序列，正式發(fā)現(xiàn)了重疊基因。第二節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)一、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)所謂DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，就是指4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該DNA分子的化學(xué)構(gòu)成?；咎攸c(diǎn)①DNA分子是由兩條互相平行的脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤繞而成的。②DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架，堿基排列在內(nèi)側(cè)。③兩條鏈上的堿基通過氫鍵相結(jié)合，形成堿基對(duì)，它的組成有一定的規(guī)律。這就是嘌呤與嘧啶配對(duì)，而且腺嘌呤（A）只能與胸腺嘧啶（T）配對(duì)，鳥嘌呤（G）只能與胞嘧啶（C）配對(duì)。2、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所生成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。通常情況下，DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)分兩大類：一類是右手螺旋，如A-DNA和B-DNA；另一類是左手螺旋，即Z-DNA。3、DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)是指DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。超螺旋結(jié)構(gòu)是DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式，可分為正超螺旋與負(fù)超螺旋兩大類。DNA分子的超螺旋化可以用一個(gè)數(shù)學(xué)公式來表示：L=T+W其中L為連接數(shù)（linkingnumber），是指環(huán)形DNA分子兩條鏈間交叉的次數(shù)。只要不發(fā)生鏈的斷裂，L是個(gè)常量。T為雙螺旋的盤繞數(shù)（twistingnumber），W為超螺旋數(shù)（writhingnumber），它們是變量。2．3DNA的復(fù)制2.3.1DNA的半保留復(fù)制機(jī)理2.3.2復(fù)制的起點(diǎn)、方向和速度2.3.3復(fù)制的幾種主要方式一、DNA的復(fù)制1、DNA的半保留復(fù)制每個(gè)子代分子的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合成的，所以這種復(fù)制方式被稱為DNA的半保留復(fù)制（semiconservativereplication）。DNA的這種半保留復(fù)制保證了DNA在代謝上的穩(wěn)定性。2、復(fù)制的起點(diǎn)與方向一般把生物體的復(fù)制單位稱為復(fù)制子（replicon）。一個(gè)復(fù)制子只含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。多復(fù)制子：DNA復(fù)制時(shí)，原核生物一般只有一個(gè)起始位點(diǎn)，而真核生物則有多個(gè)起始位點(diǎn)，因而在復(fù)制時(shí)呈現(xiàn)多復(fù)制泡，也稱為多復(fù)制子。DNA的復(fù)制主要是從固定的起始點(diǎn)以雙向等速?gòu)?fù)制方式進(jìn)行的（圖2-18）。復(fù)制叉以DNA分子上某一特定順序?yàn)槠瘘c(diǎn)，向兩個(gè)方向等速生長(zhǎng)前進(jìn)。拓?fù)洚悩?gòu)酶I拓?fù)洚悩?gòu)酶I解開負(fù)超螺旋，并與解鏈酶共同作用，在復(fù)制起點(diǎn)處解開雙鏈。參與解鏈的除一組解鏈酶外，還有Dna蛋白等。DNA解鏈酶（DNAhelicase）DNA解鏈酶能通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA。單鏈結(jié)合蛋白（SSB蛋白）SSB蛋白的作用是保證被解鏈酶解開的單鏈在復(fù)制完成前能保持單鏈結(jié)構(gòu)，它以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，待單鏈復(fù)制后才掉下，重新循環(huán)。所以，SSB蛋白只保持單鏈的存在，并不能起解鏈的作用。3、DNA的半不連續(xù)復(fù)制與岡崎片段DNA復(fù)制時(shí)，短時(shí)間內(nèi)合成的約1000個(gè)核苷酸左右的小片段，稱之為岡崎片段(Okazakifragment)DNA復(fù)制過程中至少有一條鏈?zhǔn)紫群铣奢^短的片段，然后再由連接酶連成大分子DNA?，F(xiàn)在已知一般原核生物的岡崎片段要長(zhǎng)些，真核生物中的要短些。進(jìn)一步研究還證明，這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界是有普遍性的，因而稱之為雙螺旋的半不連續(xù)復(fù)制。DNA鏈的延伸：DNA復(fù)制體(replisome)：在復(fù)制叉附近，形成了以兩套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引發(fā)體和解鏈酶構(gòu)成的類似核糖體大小的復(fù)合體，稱為DNA復(fù)制體。4、滯后鏈的引發(fā)DNA復(fù)制時(shí)，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶從RNA引物3'端開始合成新的DNA鏈。滯后鏈的引發(fā)過程往往由引發(fā)體（primosome）來完成。引發(fā)體由6種蛋白質(zhì)n、n'、n''、DnaB、C和I共同組成，只有當(dāng)引發(fā)前體（preprimosome）把這6種蛋白質(zhì)合在一起并與引發(fā)酶（primase）進(jìn)一步組裝后形成引發(fā)體，才能發(fā)揮其功效。5、鏈的終止當(dāng)復(fù)制叉前移，遇到20bp重復(fù)性終止子序列（Ter）時(shí)，Ter-Tus復(fù)合物能阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復(fù)制叉到達(dá)后在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNA。6、復(fù)制的幾種方式(1)環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制環(huán)狀雙鏈DNA的復(fù)制可分為θ型、滾環(huán)型和D-環(huán)型幾種類型。(a)θ型復(fù)制的起始點(diǎn)涉及到DNA雙鏈的解旋和松開，形成兩個(gè)方向相反的復(fù)制叉。前導(dǎo)鏈DNA開始復(fù)制前，復(fù)制原點(diǎn)的核酸序列被轉(zhuǎn)錄生成短RNA鏈，作為起始DNA復(fù)制的引物。(b)滾環(huán)型（rollingcircle）這是單向復(fù)制的特殊方式。如ΦX174的雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型（RF）就是以這種方式復(fù)制的。DNA的合成由對(duì)正鏈原點(diǎn)的專一性切割開始，所形成的自由5‘端被從雙鏈環(huán)中置換出來并為單鏈DNA結(jié)合蛋白所覆蓋，使其3’—OH端在DNA聚合酶的作用下不斷延伸。在這個(gè)過程中，單鏈尾巴的延伸與雙鏈DNA的繞軸旋轉(zhuǎn)同步。（c）D-環(huán)型（D-loop）這也是一種單向復(fù)制的特殊方式。這種方式首先在動(dòng)物線粒體DNA的復(fù)制中被發(fā)現(xiàn)。雙鏈環(huán)在固定點(diǎn)解開進(jìn)行復(fù)制。但兩條鏈的合成是高度不對(duì)稱的，一條鏈上迅速合成出互補(bǔ)鏈，另一條鏈則成為游離的單鏈環(huán)（即D-環(huán)）。（2）線性DNA雙鏈的復(fù)制線性DNA復(fù)制中RNA引物被切除后，留下5'端部分單鏈DNA，不能為DNA聚合酶所作用，使子鏈短于母鏈。T4和T7噬菌體DNA通過其末端的簡(jiǎn)并性使不同鏈的3'端因互補(bǔ)而結(jié)合，其缺口被聚合酶作用填滿，再經(jīng)DNA連接酶作用生成二聯(lián)體。這個(gè)過程可重復(fù)進(jìn)行直到生成原長(zhǎng)20多倍的多聯(lián)體，并由噬菌體DNA編碼的核酸酶特異切割形成單位長(zhǎng)度的DNA分子。二、原核和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)1、原核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)大腸桿菌DNA聚合酶I、II和III的性質(zhì)比較原核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ：有3’→5’外切酶活性和5’→3’外切酶活性。保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。DNA聚合酶Ⅱ：活性低，其3’→5’核酸外切酶活性可起校正作用。主要起修復(fù)DNA的作用。DNA聚合酶Ⅲ：7種亞單位9個(gè)亞基。只具3’→5’外切酶活性，主導(dǎo)聚合酶。Klenowfragment：用枯草桿菌蛋白酶處理大腸桿菌DNA聚合酶，獲得兩個(gè)片段，大片段分子量76000U，稱為Klenow片段。它保留著聚合酶和3’→5’外切酶的活性，廣泛使用于DNA序列分析中。三、真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)真核生物DNA復(fù)制的起始需要起始原點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物（ORC）參與。真核生物DNA復(fù)制叉的移動(dòng)速度大約只有50bp秒，還不到大腸桿菌的120。真核生物的染色體在全部完成復(fù)制之前，各個(gè)起始點(diǎn)上DNA的復(fù)制不能再開始。真核生物DNA聚合酶的特性比較2.4.3DNA復(fù)制的調(diào)控原核細(xì)胞DNA的復(fù)制調(diào)控：復(fù)制叉的多少?zèng)Q定了復(fù)制頻率的高低。真核細(xì)胞DNA的復(fù)制調(diào)控：1.細(xì)胞生活周期水平調(diào)控2.染色體水平調(diào)控3.復(fù)制子水平調(diào)控真核和原核生物DNA復(fù)制的比較相同：1.半保留復(fù)制2.都有引發(fā)、延長(zhǎng)、終止三個(gè)階段3.都必須有相應(yīng)功能的蛋白質(zhì)和DNA聚合酶參與區(qū)別：1.真：多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)；原：一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)2.真：所有復(fù)制受一種調(diào)控；原：一個(gè)復(fù)制子上有多個(gè)復(fù)制叉2.5DNA的修復(fù)DNA修復(fù)系統(tǒng)功能錯(cuò)配修復(fù)恢復(fù)錯(cuò)配堿基切除修復(fù)切除突變的堿基核苷酸切除修復(fù)修復(fù)被破壞的DNADNA直接修復(fù)修復(fù)嘧啶二體或甲基化DNA2.6DNA的轉(zhuǎn)座2.6.1轉(zhuǎn)座子的分類和結(jié)構(gòu)特征2.6.2轉(zhuǎn)座作用的機(jī)制2.6.3轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng)2.6.4真核生物中的轉(zhuǎn)座子移動(dòng)基因(Movablegene)：又稱為轉(zhuǎn)位因子(Transposableelements)，是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位。由于它可以從染色體基因組上的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一位置，甚至在不同染色體之間躍遷，因此有時(shí)也稱為跳躍基因(Jumpinggene)。原核生物的轉(zhuǎn)座因子可分為：插入序列(insertionsequence，IS)：最簡(jiǎn)單的不含有任何宿主基因的轉(zhuǎn)位因子。片段長(zhǎng)度700—2500bp。復(fù)合轉(zhuǎn)座子(transposon，Tn)：是一類攜帶某些與轉(zhuǎn)座無關(guān)的抗性基因(或其它宿主基因)的轉(zhuǎn)座子。分子量＞2000bp。轉(zhuǎn)座噬菌體(Mu，D108)：具有轉(zhuǎn)座功能的一類可引起突變的溶源性噬菌體。插入序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.在IS兩端含有長(zhǎng)度為10—40bp反向重疊序列2.含有一個(gè)編碼轉(zhuǎn)座酶的長(zhǎng)編碼區(qū)。3.插入時(shí)在DNA位點(diǎn)產(chǎn)生一個(gè)短的(3—9bp)正向重復(fù)序列。復(fù)合轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.兩翼為兩個(gè)相同或相似的IS序列。2.中部為某種抗性基因。3.IS序列一般不能單獨(dú)移動(dòng)。Conclusiona)轉(zhuǎn)座過程是由Donor提供Tncopy到targetsite，涉及酶切、復(fù)制、重組的遺傳學(xué)過程。b)轉(zhuǎn)座完成后，在Tn的兩端出現(xiàn)targetsite序列的正向重復(fù)，其長(zhǎng)度取決于staggeredcutting的長(zhǎng)度。c)轉(zhuǎn)座因子的IR序列是轉(zhuǎn)座酶的重要識(shí)別位點(diǎn)，與轉(zhuǎn)座，切除有關(guān)d)Cointegrater是轉(zhuǎn)座過程的中間體(具有兩個(gè)Tn和兩個(gè)replicon),其穩(wěn)定性依Tn不同而異，或resolution完成轉(zhuǎn)座過程.e)Cointegrater可能導(dǎo)致Tn和抗性的積累。轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng)1.誘變效應(yīng)（提高重組頻率、形成易變基因…）2.切除效應(yīng)(倒位、缺失、重復(fù)、footprinting)3.雙轉(zhuǎn)座效應(yīng)（外顯子改組exonshuffling）4.位置效應(yīng)（啟動(dòng)表達(dá)、增強(qiáng)表達(dá)…）5.轉(zhuǎn)座爆炸（激活表達(dá)、基因內(nèi)重排突變基因形成）轉(zhuǎn)位作用的機(jī)制：靶序列的復(fù)制。轉(zhuǎn)位作用的遺傳學(xué)效應(yīng)：引起插入突變；產(chǎn)生新基因；產(chǎn)生染色體畸變；引起生物進(jìn)化。轉(zhuǎn)座因子的應(yīng)用：利用轉(zhuǎn)座子分離、克隆基因；利用Tn進(jìn)行基因定位；作為基因轉(zhuǎn)移載體。真核生物中的轉(zhuǎn)座子1、玉米中的控制因子自主性因子：具有自主剪接和轉(zhuǎn)座的功能；非自主性因子：?jiǎn)为?dú)存在時(shí)是穩(wěn)定的，不能轉(zhuǎn)座，當(dāng)基因組中存在與非自主性因子同家族的自主性因子時(shí)，它才具備轉(zhuǎn)座功能，成為與自主性因子相同的轉(zhuǎn)座子。Ac－Ds體系、Spm,En轉(zhuǎn)座子。2、果蠅中的轉(zhuǎn)座子Copia類、P轉(zhuǎn)座子等。本章重點(diǎn)染色體及DNA結(jié)構(gòu)DNA復(fù)制習(xí)題1.DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制,若一完全被標(biāo)記的DNA分子,置于無放射標(biāo)記的溶液中復(fù)制兩代,所產(chǎn)生的4個(gè)DNA分子中放射性狀況如何A.兩個(gè)分子有放射性,兩個(gè)分子無放射性B.均有放射性C.兩條鏈中的半條具有放射性D.兩條鏈中的一條具有放射性E.均無放射性2.DNA復(fù)制時(shí)哪種酶不需要A.DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶B.DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶C.連接酶D.RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶E.拓?fù)洚悩?gòu)酶3.原核生物的DNA聚合酶A.DNA聚合酶Ⅰ有7種、9個(gè)亞單位B.DNA聚合酶Ⅱ有最強(qiáng)的外切核酸酶的活性C.DNA聚合酶Ⅲ是真正的起復(fù)制作用的酶D.催化過程產(chǎn)生的焦磷酸是主要底物E.用4種脫氧核苷作底物生物信息的傳遞(上)—從DNA到RNA基因表達(dá)：是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯、產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的整個(gè)過程。轉(zhuǎn)錄(transcription)：以DNA為模板，按照堿基互補(bǔ)原則合成一條單鏈RNA，從而將DNA中的遺傳信息轉(zhuǎn)移到RNA中去的過程稱為轉(zhuǎn)錄。編碼鏈(codingstrand)=有意義鏈模板鏈(templatestrand)=反義鏈不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)：轉(zhuǎn)錄僅發(fā)生在DNA的一條鏈上。啟動(dòng)子(promoter)：是DNA轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)的一段序列，它能指導(dǎo)全酶與模板正確的結(jié)合，并活化酶使之具有起始特異性轉(zhuǎn)錄形式。終止子(terminator)：轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)，其作用是在DNA模板特異位置處終止RNA的合成。轉(zhuǎn)錄單位：DNA鏈上從啟動(dòng)子直到終止子為止的長(zhǎng)度稱為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。3.1RNA的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄的基本過程都包括：模板識(shí)別、轉(zhuǎn)錄起始、通過啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄的延伸和終止。1、模板識(shí)別階段主要指RNA聚合酶與啟動(dòng)子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過程。轉(zhuǎn)錄起始前，啟動(dòng)子附近的DNA雙鏈分開形成轉(zhuǎn)錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板DNA的堿基配對(duì)。2、轉(zhuǎn)錄起始就是RNA鏈上第一個(gè)核苷酸鍵的產(chǎn)生。3、轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個(gè)核苷酸短鏈?zhǔn)峭ㄟ^啟動(dòng)子階段，通過啟動(dòng)子的時(shí)間越短，該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率也越高。4、RNA聚合酶離開啟動(dòng)子，沿DNA鏈移動(dòng)并使新生RNA鏈不斷伸長(zhǎng)的過程就是轉(zhuǎn)錄的延伸。5、當(dāng)RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)時(shí)，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，這就是轉(zhuǎn)錄的終止。3.1.1轉(zhuǎn)錄的基本過程RNA合成的基本特點(diǎn)：1.底物是：ATP、GTP、CTP、UTP2.在聚合酶作用下形成磷酸酯鍵3.RNA的堿基順序由DNA的順序決定4.僅以一條DNA鏈作為模板5.合成方向?yàn)?’→3’6.合成中不需要引物3.1.2轉(zhuǎn)錄機(jī)器的主要成分原核生物RNA聚合酶：亞基基因相對(duì)分子量亞基數(shù)組分功能αrpoA3.65×1042核心酶核心酶組裝，啟動(dòng)子識(shí)別βrpoB1.51×1051核心酶β和β’共同形成RNA合成的活性中心β’rpoC1.55×1051核心酶？11×1041核心酶未知σrpoD7.0×1041σ因子存在多種σ因子，用于識(shí)別不同的啟動(dòng)子1、RNA聚合酶大多數(shù)原核生物RNA聚合酶的組成是相同的，大腸桿菌RNA聚合酶由2個(gè)α亞基、一個(gè)β亞基、一個(gè)β’亞基和一個(gè)ω亞基組成，稱為核心酶。加上一個(gè)σ亞基后則成為聚合酶全酶（holoenzyme），相對(duì)分子質(zhì)量為4.65×105。研究發(fā)現(xiàn)，由β和β’亞基組成了聚合酶的催化中心，它們?cè)谛蛄猩吓c真核生物RNA聚合酶的兩個(gè)大亞基有同源性。β亞基能與模板DNA、新生RNA鏈及核苷酸底物相結(jié)合。σ因子可以極大地提高RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子區(qū)DNA序列的親和力，加入σ因子以后，RNA聚合酶全酶識(shí)別啟動(dòng)子序列的特異性總共提高了107倍。σ因子的作用是負(fù)責(zé)模板鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，轉(zhuǎn)錄的起始從化學(xué)過程來看是單個(gè)核苷酸與開鏈啟動(dòng)子-酶復(fù)合物相結(jié)合構(gòu)成新生RNA的5’端，再以磷酸二酯鍵的形式與第二個(gè)核苷酸相結(jié)合，起始的終止反映在σ因子的釋放。過去認(rèn)為二核苷酸的形成就是轉(zhuǎn)錄起始的終止，實(shí)際上，只有當(dāng)新生RNA鏈達(dá)到6-9個(gè)核苷酸時(shí)才能形成穩(wěn)定的酶-DNA-RNA三元復(fù)合物，才釋放σ因子，轉(zhuǎn)錄進(jìn)入延伸期。真核生物RNA聚合酶真核生物中共有3類RNA聚合酶。真核生物RNA聚合酶一般有8-14個(gè)亞基所組成，相對(duì)分子質(zhì)量超過5×105。除了細(xì)胞核中的RNA聚合酶之外，真核生物線粒體和葉綠體中還存在著不同的RNA聚合酶。線粒體RNA聚合酶只有一條多肽鏈，相對(duì)分子質(zhì)量小于7×104，是已知最小的RNA聚合酶之一，與T7噬菌體RNA聚合酶有同源性。葉綠體RNA聚合酶比較大，結(jié)構(gòu)上與細(xì)菌中的聚合酶相似，由多個(gè)亞基組成，部分亞基由葉綠體基因組編碼。線粒體和葉綠體RNA聚合酶活性不受α-鵝膏覃堿所抑制。常用的轉(zhuǎn)錄抑制劑及其作用：抑制劑靶酶抑制作用利福霉素細(xì)菌的全酶與β亞基結(jié)合，阻止起始鏈霉溶菌素細(xì)菌的核心酶與β亞基結(jié)合，阻止延長(zhǎng)放線菌素D真核RNA聚合酶Ⅰ與DNA結(jié)合，并阻止延長(zhǎng)α-鵝膏蕈堿真核RNA聚合酶Ⅱ與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合起始復(fù)合物的形成轉(zhuǎn)錄可被分為4個(gè)階段，即啟動(dòng)子的選擇、轉(zhuǎn)錄起始、RNA鏈的延伸和終止。原核生物中：?jiǎn)?dòng)子選擇階段包括RNA聚合酶全酶對(duì)啟動(dòng)子的識(shí)別，聚合酶與啟動(dòng)子可逆性結(jié)合形成封閉復(fù)合物（closedcomplex）。真核生物RNA聚合酶Ⅱ所形成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物：除了RNA聚合酶之外，真核生物轉(zhuǎn)錄起始過程中至少還需要7種輔助因子參與一般情況下，該復(fù)合物可以進(jìn)入兩條不同的反應(yīng)途徑，一是合成并釋放2-9個(gè)核苷酸的短RNA轉(zhuǎn)錄物，即所謂的流產(chǎn)式起始；二是盡快釋放σ亞基，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物通過上游啟動(dòng)子區(qū)并生成由核心酶、DNA和新生RNA所組成的轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物。RNA聚合酶的核心酶雖可合成RNA，但不能找到模板DNA上的起始位點(diǎn)。只有帶б因子的全酶才能專一地與DNA上的啟動(dòng)子結(jié)合，選擇其中一條鏈作為模板，合成均一的產(chǎn)物。б因子的作用只是起始而已，一旦轉(zhuǎn)錄開始，它就脫離了起始復(fù)合物，而由核心酶負(fù)責(zé)RNA鏈的延伸。因此，聚合酶全酶的作用是啟動(dòng)子的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，而核心酶的作用是鏈的延伸。真核生物RNAPolII的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物真核生物轉(zhuǎn)錄起始除RNA聚合酶外，至少還需要7種輔助因子參與，如TBP，TFIIA，TFIIB，TFIID，TFIIE，TFIIF和TFIIH。3.2啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始2、啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始啟動(dòng)子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與范本DNA準(zhǔn)確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。轉(zhuǎn)錄的起始是基因表達(dá)的關(guān)鍵階段，而這一階段的重要問題是RNA聚合酶與啟動(dòng)子的相互作用。3.2.1啟動(dòng)子區(qū)的基本結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄單元(transcriptionunit)：是一段從啟動(dòng)子開始至終止子結(jié)束的DNA序列，RNA聚合酶從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)開始沿著模板前進(jìn)，直到終止子為止，轉(zhuǎn)錄出一條RNA鏈。轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)是指與新生RNA鏈第一個(gè)核苷酸相對(duì)應(yīng)DNA鏈上的堿基，研究證實(shí)通常為一個(gè)嘌呤。常把起點(diǎn)前面，即5’末端的序列稱為上游(upstream)，而把其后面即3’末端的序列稱為下游(downstream)。在啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)有一個(gè)由5個(gè)核苷酸組成的共同序列，是RNA聚合酶的緊密結(jié)合點(diǎn)，現(xiàn)在稱為Pribnow區(qū)(Pribnowbox)，這個(gè)區(qū)的中央大約位于起點(diǎn)上游10bp處，所以又稱為-10區(qū)。絕大部分啟動(dòng)子都存在位于-10bp處的TATA區(qū)和-35bp處的TTGACA區(qū)。這兩段共同序列是RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，能與σ因子相互識(shí)別而具有很高的親和力。Pribnow區(qū)（Pribnowbox）這個(gè)區(qū)的中央大約位于起點(diǎn)上游10bp處，所以又稱為–10區(qū)。TTGACA。這個(gè)區(qū)的中央大約位于起點(diǎn)上游35bp處，所以又稱為–35區(qū)。–10位的TATA區(qū)和–35位的TTGACA區(qū)是RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，能與σ因子相互識(shí)別而具有很高的親和力。在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中發(fā)現(xiàn)了類似Pribnow區(qū)的Hogness區(qū)（Hognessbox），這是位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游–25～–30bp處的共同序列TATAAA，也稱為TATA區(qū)（圖3-7）。另外，在起始位點(diǎn)上游–70～–78bp處還有另一段共同序列CCAAT，這是與原核生物中–35bp區(qū)相對(duì)應(yīng)的序列，稱為CAAT區(qū)（CAATbox）。在–70～–80區(qū)含有CCAAT序列（CAATbox），在–80～–110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GCbox）。3.2.2啟動(dòng)子區(qū)的識(shí)別氫鍵互補(bǔ)學(xué)說：RNA聚合酶并不直接識(shí)別堿基對(duì)本身，而是通過氫鍵互補(bǔ)的方式加以識(shí)別。這種氫鍵互補(bǔ)學(xué)說較為圓滿地解釋了啟動(dòng)子功能既受DNA序列影響，又受其構(gòu)象影響這一事實(shí)。3.2.3酶與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合在RNA聚合酶與啟動(dòng)子相互作用的過程中，聚合酶首先與啟動(dòng)子區(qū)閉合雙鏈DNA相結(jié)合，形成二元閉合復(fù)合物，然后經(jīng)過解鏈得到二元開鏈復(fù)合物。DNA開鏈?zhǔn)前凑誅NA模板序列正確引入核苷酸底物的必要條件。RNA聚合酶既是雙鏈DNA結(jié)合蛋白，又是單鏈DNA結(jié)合蛋白。3.2.4-10區(qū)和-35區(qū)的最佳間距在原核生物中，-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離大約是16~19bp，小于15bp或大于20bp都會(huì)降低啟動(dòng)子的活性。在細(xì)菌中常見兩種啟動(dòng)子突變，一種叫下降突變(downmutation)，如果把Pribnow區(qū)從TATAAT變成AATAAT就會(huì)大大降低其結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平；另一類突變叫上升突變(upmutation)，即增加Pribnow區(qū)共同序列的同一性。3.2.5增強(qiáng)子及其功能能強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄起始的序列為增強(qiáng)子或強(qiáng)化子(enhancer)。增強(qiáng)子很可能通過影響染色質(zhì)DNA-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或改變超螺旋的密度而改變模板的整體結(jié)構(gòu)，從而使得RNA聚合酶更容易與范本DNA相結(jié)合，起始基因轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子與啟動(dòng)子的區(qū)別：1.增強(qiáng)子對(duì)于啟動(dòng)子的位置不固定，而能有很大的變動(dòng)；2.它能在兩個(gè)方向產(chǎn)生作用。一個(gè)增強(qiáng)子并不限于促進(jìn)某一特殊啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，它能刺激在它附近的任一啟動(dòng)子。3.2.6真核生物啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響習(xí)慣上，將TATA區(qū)上游的保守序列稱為上游啟動(dòng)子元件(upstreampromoterelement，UPE)或稱上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)。在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中發(fā)現(xiàn)了類似Pribnow區(qū)的Hogness區(qū)（Hognessbox），這是位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游–25～–30bp處的共同序列TATAAA，也稱為TATA區(qū)。另外，在起始位點(diǎn)上游–70～–78bp處還有另一段共同序列CCAAT，這是與原核生物中–35bp區(qū)相對(duì)應(yīng)的序列，稱為CAAT區(qū)（CAATbox）。在–70～–80區(qū)含有CCAAT序列（CAATbox），在–80～–110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GCbox）。TATA區(qū)的主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地起始；CAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率，基本不參與起始位點(diǎn)的確定。轉(zhuǎn)錄實(shí)際上是RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動(dòng)子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄的終止RNA聚合酶起始基因轉(zhuǎn)錄后，它就會(huì)沿著范本5’→3’方向不停地移動(dòng)，合成RNA鏈，直到碰上終止信號(hào)時(shí)才與模板DNA相脫離并釋放新生RNA鏈。終止發(fā)生時(shí)，所有參與形成RNA-DNA雜合體的氫鍵都必須被破壞，范本DNA鏈才能與有意義鏈重新組合成DNA雙鏈。3.4終止和抗終止不依賴于ρ因子的終止終止位點(diǎn)上游一般存在一個(gè)富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)。在終止位點(diǎn)前面有一段由4-8個(gè)A組成的序列，所以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端為寡聚U，這種結(jié)構(gòu)特征的存在決定了轉(zhuǎn)錄的終止。終止效率與二重對(duì)稱序列和寡聚U的長(zhǎng)短有關(guān)，隨著發(fā)卡式結(jié)構(gòu)（至少6bp）和寡聚U序列（至少4個(gè)U）長(zhǎng)度的增加，終止效率逐步提高。依賴于ρ因子的終止ρ因子是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為2.0×105的六聚體蛋白，它能水解各種核苷酸三磷酸，實(shí)際上是一種NTP酶，它通過催化NTP的水解促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。3.4.3抗終止抗轉(zhuǎn)錄終止主要有兩種方式：1.破壞終止位點(diǎn)RNA的莖—環(huán)結(jié)構(gòu)2.依賴于蛋白質(zhì)因子的轉(zhuǎn)錄抗終止3.3原核生物與真核生物mRNA的特征比較原核生物mRNA的特征mRNA在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)占總RNA的2%左右（tRNA占16%，而rRNA則占80%以上）。原核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯不僅發(fā)生在同一個(gè)細(xì)胞空間里，而且這兩個(gè)過程幾乎是同步進(jìn)行的，蛋白質(zhì)合成往往在mRNA剛開始轉(zhuǎn)錄時(shí)就被引發(fā)了。一個(gè)原核細(xì)胞的mRNA（包括病毒）有時(shí)可以編碼幾個(gè)多肽。3.3.1原核生物mRNA的特征1.原核生物mRNA的半衰期短2.許多原核生物mRNA以多順反子的形式存在3.原核生物mRNA的5’端無帽子結(jié)構(gòu)，3’端沒有或只有較短的poly(A)結(jié)構(gòu)4.原核生物起始密碼子AUG上游7-12個(gè)核苷酸處有一被稱為SD序列（Shine–Dalgarnosequence）的保守區(qū)，因?yàn)樵撔蛄信c16S-rRNA3’端反向互補(bǔ)，所以被認(rèn)為在核糖體-mRNA的結(jié)合過程中起作用。只編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA稱為單順反子mRNA（monocistronicmRNA），把編碼多個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA稱為多順反子mRNA（polycistronicmRNA）。多順反子mRNA是一組相鄰或相互重迭基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，這樣的一組基因可被稱為一個(gè)操縱子（operon），是生物體內(nèi)的重要遺傳單位。如大腸桿菌乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄成編碼3條多肽的多順反子mRNA，經(jīng)過翻譯生成β半乳糖苷酶、透過酶及乙?；D(zhuǎn)移酶。真核生物mRNA的特征前體RNA成熟mRNA“基因”的分子生物學(xué)定義是：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列！3.3.2真核生物mRNA的特征1.真核生物mRNA的5’端存在“帽子”結(jié)構(gòu)：pppApNpNp。2.絕大多數(shù)真核生物mRNA具有多聚(A)尾巴。帽子結(jié)構(gòu)帽子被扣在了mRNA的5’端，并可能在幾個(gè)位置發(fā)生甲基化。mRNA5′端加“G”的反應(yīng)是由鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶完成的。帽子甲基化作用帽子0：出現(xiàn)在所有真核生物中。尿苷酸一7一甲基轉(zhuǎn)移酶在G的7N位甲基化帽子1：除單細(xì)胞生物以外所有其他真核生物中都有的最主要的帽子。2’一甲基一轉(zhuǎn)移酶第2個(gè)堿基的2’－OH位置上（實(shí)際上在任何修飾反應(yīng)進(jìn)行前，它是轉(zhuǎn)錄物中原來的第1個(gè)堿基）帽子2：甲基基團(tuán)可以添加到戴帽mRNA的第3堿基上。這個(gè)反應(yīng)的底物是已經(jīng)具有兩個(gè)甲基基團(tuán)的帽子mRNA。2’一甲基一轉(zhuǎn)移酶催化2’－OH位置上甲基化這種帽子通常低于戴帽群體總量的10－15％。二、mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾－帽子1、帽子的種類帽子0（Cap-0）m7GpppXpYp（共有）帽子1（Cap-1）m7GpppXmpYp第一個(gè)核苷酸的2’-O位上產(chǎn)生甲基化（AN6位甲基化）帽子2（Cap-2）m7GpppXmpYm第二個(gè)核苷酸的2’-O位上產(chǎn)生甲基化（A、G、C、U）其中:☆單細(xì)胞真核生物只有Cap—0☆Cap—1是其余真核生物的主要帽子形式☆Cap—2存在于某些真核生物中2、帽子結(jié)構(gòu)的生成☆甲基供體都為S—腺苷甲硫氨酸（SAM）☆RNA鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶戴帽酶（cappingenzyme）3、帽子結(jié)構(gòu)的功能（1）對(duì)翻譯起識(shí)別作用為核糖體識(shí)別RNA提供信號(hào)Cap—0的全部都是識(shí)別的重要信號(hào)Cap—1,2的甲基化能增進(jìn)識(shí)別（2）增加mRNA的穩(wěn)定性，使5’端免遭外切核酸酶的攻擊（3）與某些RNA病毒的正鏈合成有關(guān)（Cap—1、Cap—2）除帽子結(jié)構(gòu)外的Euk.mRNA內(nèi)部甲基化－－－m6A形式PolyA尾巴3、poly(A)的功能（1）可能與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)（2）與mRNA的壽命有關(guān)（3）與翻譯有關(guān)a、缺失可抑制體外翻譯的起始b、胚胎發(fā)育中，poly(A)對(duì)其mRNA的翻譯有影響（非poly(A)化的為儲(chǔ)藏形式）c、對(duì)含poly(A)的mRNA失去poly(A)可減弱其翻譯（4）poly(A)在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中有很大應(yīng)用價(jià)值a、也可將oligo(dT)與載體相連，從總體RNA中分離純化mRNAb、用寡聚dT（oligo(dT)）為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA若干基本概念基因表達(dá)的第一步以D.S.DNA中的一條單鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板在依賴DNA的RNA聚合酶的作用下按A＝U，C＝G配對(duì)的原則，合成RNA分子模板單鏈DNA的極性方向?yàn)?’→5’,而非模板單鏈DNA的極性方向與RNA鏈相同，均為5’→3’.模板單鏈DNA的極性方向?yàn)?’→5’,而非模板單鏈DNA的極性方向與RNA鏈相同，均為5’→3’.3.5內(nèi)含子的剪接、編輯及化學(xué)修飾一、概述割裂基因（splitgene）：指編碼某一RNA的基因中有些序列并不出現(xiàn)在成熟的RNA序列中，成熟RNA的序列在基因中被其他的序列隔開內(nèi)含子（intron）：原初轉(zhuǎn)錄物中通過RNA拼接反應(yīng)而被去除的RNA序列或基因中與這些RNA序列相應(yīng)的DNA序列外顯子（excon）：RNA拼接（RNAsplicing）：一個(gè)基因的外顯子和內(nèi)含子共同轉(zhuǎn)錄在一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，將內(nèi)含子去除而把外顯子連接起來形成成熟RNA分子的過程拼接點(diǎn)：5’拼接點(diǎn)或左拼接點(diǎn)（內(nèi)含子上游）3’拼接點(diǎn)或右拼接點(diǎn)（……下游）3.5.1RNA中的內(nèi)含子真核生物mRNA前體的加工：1.5’端形成特殊的帽子結(jié)構(gòu)2.在3’端切斷并加上一個(gè)poly(A)的尾巴3.通過剪接除去轉(zhuǎn)錄來的IVS(非翻譯區(qū))4.鏈內(nèi)部核酸的甲基化內(nèi)含子的分類中部核心結(jié)構(gòu)（centralcorestructure）:在有些內(nèi)含子中，含有4個(gè)重復(fù)的保守序列，長(zhǎng)度為10~20bp，4個(gè)保守序列構(gòu)成一種二級(jí)結(jié)構(gòu)，在拼接中起重要作用由于并非所有的內(nèi)含子都有中部核心結(jié)構(gòu)，所以有了內(nèi)含子的分類Ⅰ類（groupⅠ）:含有中部核心結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器基因核基因Ⅱ類（groupⅡ）:不含有中部核心結(jié)構(gòu)細(xì)胞器線粒體基因內(nèi)核基因Ⅲ類（groupⅢ）:具有GU－AG特征的邊界序列核基因mRNA前體RNA基因的內(nèi)元均位于tRNA的反密碼環(huán)上3、拼接方式方式一：由拼接裝置完成（核mRNA內(nèi)含子）可供識(shí)別的特異序列拼接裝置由多種蛋白質(zhì)和核蛋白組成方式二：自我拼接（兩類內(nèi)含子Ⅰ、Ⅱ）形成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)RNA具有催化拼接的能力方式三：需要蛋白質(zhì)酶參與的拼接（酵母tRNA）前兩種拼接都屬于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)3.5.2RNA的剪接RNA的剪接實(shí)質(zhì)：就是要把斷裂基因的內(nèi)含子除去，連接外顯子。剪切方式：mRNA前體的剪接；自我剪接；蛋白質(zhì)剪接(tRNA)。剪接體(spliceosome)：各種參與剪接的成分形成的一個(gè)體系。Ribozyme：有酶活性的RNA。拼接機(jī)制（Splicingmehanism)SnRNA(orScRNA)與拼接點(diǎn)序列間存在互補(bǔ)區(qū)域并參與剪接,形成拼接體(spliceosome)。Spliceosome逐級(jí)組裝，SnRNA（U1、U2、U5和U4／U6）分步替代U1通過5，拼接點(diǎn)互補(bǔ)而結(jié)合U2識(shí)別并結(jié)合分支點(diǎn)AU1和U2作用使內(nèi)元的5’端和3’端帶到一起（U1與3’拼接點(diǎn)配對(duì)）U1、U2、mRNA與U4－U5－U6復(fù)合物形成一個(gè)完整的拼接體3.5.3RNA的編輯和化學(xué)修飾RNA的編輯：是在mRNA水平上改變遺傳信息的過程。種類：?jiǎn)螇A基突變；尿苷酸的缺失和添加化學(xué)修飾：甲基化；硫代；二價(jià)鍵的飽和化；去氨基化；堿基的同分異構(gòu)化；核苷酸的替代。習(xí)題1.真核生物的TATA盒是:A.轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)B.翻譯的起始點(diǎn)C.RNA聚合酶與DNA模板穩(wěn)定結(jié)合處D.DNA聚合酶的活性中心E.DNA合成起始位點(diǎn)2.關(guān)于RNA的敘述,錯(cuò)誤的是:A.主要有mRNA、tRNA、rRNA三大類B.胞質(zhì)中只有一種RNA，即mRNAC.最小的一種RNA是tRNAD.原核生物沒有hnRNAE.原核生物沒有snRNA3.真核細(xì)胞中mRNA的加工修飾不包括:A.在mRNA3’末端加polyA尾B.mRNA的前體是核內(nèi)hnRNAC.在mRNA5’端形成7甲基鳥苷酸帽子結(jié)構(gòu)D.除去非結(jié)構(gòu)信息部分E.不同RNA片段之間的拼接4.絕大多數(shù)真核生物mRNA5’端有:A.帽式結(jié)構(gòu)B.polyAC.起始密碼子D.啟動(dòng)子E.SD序列5.snRNA的功能是:BA.參與DNA復(fù)制B.參與RNA剪接C.激活RNA聚合酶D.形成核糖體E.是rRNA的前體6.核酶(ribozyme)的底物是:A.DNAB.RNAC.核糖體D.細(xì)胞核膜E.核蛋白7.反義核酸作用主要是:A.封閉DNAB.封閉RNAC.降解DNAD.降解RNAE.封閉核糖體8.轉(zhuǎn)錄與DNA復(fù)制過程的共同點(diǎn)是:A.需要DNA聚合酶B.所用模板相同C.所用原料相同D.所得產(chǎn)物相同E.需要RNA聚合酶1.真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后的成熟步驟主要包括①5’端形成特殊的帽子結(jié)構(gòu)②在3’端切斷并加上一個(gè)poly(A)的尾巴③通過剪接除去轉(zhuǎn)錄來的IVS(非翻譯區(qū))④鏈內(nèi)部核酸的甲基化生物信息的傳遞(下)—從mRNA到蛋白質(zhì)4.1遺傳密碼—三聯(lián)子1、mRNA與蛋白質(zhì)之間的聯(lián)絡(luò)是經(jīng)過遺傳密碼的破譯來完成的4.1.1三聯(lián)子密碼及其破譯遺傳密碼(code)：mRNA中蘊(yùn)藏遺傳信息的堿基順序稱為遺傳密碼,密碼是密碼子的總和。密碼子(codon)：mRNA中每個(gè)相鄰的三個(gè)核苷酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個(gè)氨基酸，這三個(gè)核苷酸就稱為一個(gè)密碼子。閱讀框(readingframe)：遺傳密碼是三個(gè)一讀，稱為閱讀框。AUG：蛋氨酸(Met)或起始密碼UAA、UAG、UGA：終止密碼UAG—琥珀型(amber)密碼子UGA—蛋白石(opal)密碼子UAA—赭石型(ochre)密碼子三聯(lián)體密碼的破譯：以均聚物、隨機(jī)共聚物和特定序列的共聚物為模板指點(diǎn)多肽的分解核糖體結(jié)合技術(shù)4.1.2遺傳密碼的性質(zhì)1.密碼的簡(jiǎn)并性：簡(jiǎn)并(Degenracy)：由一種以上密碼子編碼同一種氨基酸的景象稱為簡(jiǎn)并。同義密碼子(Synonymouscodons)：對(duì)應(yīng)于同一種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子。2.密碼的普遍性與特殊性：普遍性：無論在體外還是體內(nèi)，也無論是病毒、細(xì)菌、植物還是植物，遺傳密碼均適用。特殊性：線粒體密碼子，其它例外(支原體、四膜蟲)線粒體mRNA中的密碼子：與胞漿中mRNA的密碼子有三點(diǎn)不同(哺乳植物)：1.線粒體中UGA不代表終止密碼子，而是編碼Trp；2.由AUG和AUA二個(gè)密碼子編碼；3.AGA和AGG不是Arg的密碼子，而是終止密碼子，即UAA、UAG、AGA和AGG均為終止密碼子。密碼子與反密碼子的互相作用：反密碼子(anticodon)：指tRNA上能辨認(rèn)一個(gè)mRNA密碼子的地位，這個(gè)地位上的堿基與密碼子的堿基是互補(bǔ)的。所謂“擺動(dòng)假說”(Wobblehypothesis)：即密碼的第一、第二堿基是必需嚴(yán)厲依照規(guī)范配對(duì)(A-U、G-C)，而第三堿基則可以有一定水平的擺動(dòng)靈敏性。Wobblehypothesis：1.恣意一個(gè)密碼子的前兩位堿基都與tRNAanticodon中的相應(yīng)堿基構(gòu)成Watson-Crick堿基配對(duì)。2.反密碼子第一位是A或C時(shí)，只能辨認(rèn)一個(gè)密碼子。當(dāng)反密碼子第一位是U或G時(shí)，能辨認(rèn)兩個(gè)密碼子。當(dāng)Inosine(I)作為反密碼子第一位時(shí)，能辨認(rèn)三個(gè)密碼子。3.假如數(shù)個(gè)密碼子同時(shí)編碼一個(gè)氨基酸，但凡第一、二位堿基不相反的密碼子都對(duì)應(yīng)于各自的tRNA。4.依據(jù)上述規(guī)則，至多需求32種不同的tRNA才干翻譯61個(gè)codons(密碼子)。密碼子—反密碼子配對(duì)擺動(dòng)的準(zhǔn)繩：反密碼子5’端密碼子3’端GUorCCGonlyAUonlyUAorGIU，CorA遺傳密碼子的根本特點(diǎn)：1.每個(gè)密碼子三聯(lián)體(triplet)決議一種氨基酸；2.兩種密碼子之間無任何核苷酸或其它成分加以別離，即密碼子無逗號(hào)；3.密碼子具無方向性，從N端到C端；4.密碼子有簡(jiǎn)并性；5.共有64個(gè)密碼子，其中有1個(gè)起始密碼子和3個(gè)終止密碼子；6.密碼子有通用性，即不管是病毒、原核生物還是真核生物密碼子的含義都是相反的。二、tRNAtRNA的二級(jí)構(gòu)造(三葉草構(gòu)造)1.3’端含CCA-OH序列2.TψC環(huán)(TψCloop)：7個(gè)堿基3.額定環(huán)(extrovariableloop)：3-18個(gè)堿基4.反密碼環(huán)(anticodonloop)：7個(gè)堿基5.二氫尿嘧啶環(huán)(dihydr-Uloop或D-loop)：8-12個(gè)堿基6.螺旋區(qū)：4-5個(gè)堿基4.2tRNA4.2.1tRNA的L形三級(jí)構(gòu)造tRNA的三級(jí)構(gòu)造次要由在二級(jí)構(gòu)造中未配對(duì)堿基間構(gòu)成氫鍵而引發(fā)的。在三葉草構(gòu)造中的氫鍵被稱為次級(jí)氫鍵，在三級(jí)構(gòu)造中的就稱為三級(jí)氫鍵。大局部恒定或半恒定核苷酸都參與三級(jí)氫鍵的構(gòu)成。4.2.2tRNA的功用在蛋白質(zhì)生物分解進(jìn)程中，tRNA次要起轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的作用。tRNA上與多肽鏈分解有關(guān)的位點(diǎn)：1.3’端—CCA上的氨基酸承受位點(diǎn)2.辨認(rèn)氨酰tRNA分解酶的位點(diǎn)3.核糖體辨認(rèn)位點(diǎn)4.反密碼子位點(diǎn)4.2.3tRNA的品種起始tRNA；延伸tRNA；同工tRNA；校正tRNA。校正tRNA：分為無義漸變及錯(cuò)義漸變校正在蛋白質(zhì)的構(gòu)造基因中，一個(gè)核苷酸的改動(dòng)能夠使代表某個(gè)氨基酸的密碼子變成終止密碼子(UAG、UGA、UAA)，使蛋白質(zhì)分解提早終止，分解無功用的或有意義的多肽，這種漸變就稱為無義漸變。錯(cuò)義漸變：由于構(gòu)造基因中某個(gè)核苷酸的變化使一種氨基酸的密碼變成另一種氨基酸的密碼。4.2.4氨酰–tRNA分解酶是一類催化氨基酸與tRNA結(jié)合的特異性酶，其反響式如下：AA+tRNA+ATP→AA-tRNA+AMP+PPi它實(shí)踐上包括兩步反響：第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸復(fù)合物。AA+ATP+酶（E）→E-AA-AMP+PPi第二步是氨?；D(zhuǎn)移到tRNA3末端腺苷殘基的2或3-羥基上。E-AA-AMP+tRNA→AA-tRNA+E+AMP4.3核糖體4.3.3核糖體的功用4.3.1核糖體的構(gòu)造由幾十種蛋白質(zhì)和幾種rRNA組成。包括兩個(gè)亞基，大亞基約為小亞基絕對(duì)分子質(zhì)量的一倍。每個(gè)亞基包括一個(gè)次要的rRNA成分和許多不同功用的蛋白質(zhì)分子。核糖體上有不止一個(gè)的活性中心，每一個(gè)這樣的中心都由一組特殊的蛋白質(zhì)構(gòu)成。核糖體的根本功用依賴于其中的rRNA，核糖體蛋白質(zhì)起著增強(qiáng)rRNA功用的作用。多聚核糖體(polyribosome)：在執(zhí)行蛋白質(zhì)分解功用時(shí)，單個(gè)核糖核蛋白體常常5-6個(gè)或更多個(gè)串聯(lián)在一同，構(gòu)成一個(gè)聚合體，稱為多核蛋白體或多核糖體(polyribosome或polysome)。4.3.2rRNArRNA的根本特點(diǎn)1.rRNA是單鏈RNA。2.G-C堿基對(duì)與A-U堿基對(duì)的總量不等。3.單股rRNA鏈可自行折疊，構(gòu)成螺旋區(qū)和環(huán)區(qū)，一切螺旋區(qū)的堿基都是保守的。4.一切來源rRNA均能構(gòu)成4個(gè)構(gòu)造域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，每個(gè)構(gòu)造域均含許多莖(螺旋段)和環(huán)，它們經(jīng)過無間隔堿基對(duì)的互相反響彼此接近。5.絕大少數(shù)的rRNA堿基的特異功用尚不清楚。rRNA1、5SrRNA:含與tRNA和23SrRNA辨認(rèn)序列2、16SrRNA：含與mRNA5’端和23SrRNA互補(bǔ)序列。3、23SrRNA：存在一段能與tRNAMet序列互補(bǔ)的片段，5SrRNA互補(bǔ)序列。4、5.8SrRNA：與tRNA作用的辨認(rèn)序列，同5SrRNA。5、18SrRNA：與16SrRNA同源。6、28SrRNA4.3.3核糖體的功用核糖體必需包括至多5個(gè)活性中心，即mRNA結(jié)合部位、結(jié)合或承受AA-tRNA部位（A位）、結(jié)合或承受肽基tRNA的部位、肽基轉(zhuǎn)移部位（P位）及構(gòu)成肽鍵的部位（轉(zhuǎn)肽酶中心）。核糖體小亞基擔(dān)任對(duì)模板mRNA停止序列特異性辨認(rèn)，如起始局部的辨認(rèn)、密碼子與反密碼子的互相作用等，mRNA的結(jié)合位點(diǎn)也在此亞基上大亞基擔(dān)任攜帶氨基酸及tRNA的功用，肽鍵的構(gòu)成、AA-tRNA、肽基-tRNA的結(jié)合等，A位、P位、轉(zhuǎn)肽酶中心等次要在大亞基上。4.4

蛋白質(zhì)合成的生物學(xué)機(jī)制4.4.1

氨基酸的活化氨基酸必須在氨基酰-tRNA合成酶的作用下生成活化氨基酸——AA-tRNA。tRNA與相應(yīng)氨基酸的結(jié)合是蛋白質(zhì)合成中的關(guān)鍵步驟，因?yàn)橹灰猼RNA攜帶了正確的氨基酸，多肽合成的準(zhǔn)確性就相對(duì)有了保障。4.4.2

翻譯的起始起始密碼子和起始信號(hào)：1.mRNA上的起始密碼子常為AUG，少數(shù)為GUG2.在mRNA起始密碼子上游8-13個(gè)核苷酸的地方往往有一段富含嘌呤的序列，稱為Shine-Dalgarno序列，簡(jiǎn)稱SD序列。它和16SrRNA3’端有一個(gè)互補(bǔ)的序列，它們互相識(shí)別，以保證起始的正確性。Eukaryoticribosomesmigratefromthe5endofmRNAtotheribosomebindingsite,whichincludesanAUGinitiationcodon.翻譯的起始：第一步，30S小亞基首先與翻譯起始因子IF-1，IF-3結(jié)合，再在SD序列的幫助下與mRNA模板結(jié)合。第二步，在IF-2和GTP的幫助下，fMet-tRNAfMet進(jìn)入小亞基的P位，tRNA上的反密碼子與mRNA上的起始密碼子配對(duì)。第三步，帶有tRNA，mRNA，三個(gè)翻譯起始因子的小亞基復(fù)合物與50S大亞基結(jié)合，GTP水解，釋放翻譯起始因子。

原核生物的翻譯的起始因子：IF-1

9.5kd

加強(qiáng)IF-2，IF-3的酶活I(lǐng)F-2

95kd-117kd

促使fMet-tRNAfMet選擇性的結(jié)合在30S亞基上IF-3

20kd

促使30S亞基結(jié)合于mRNA起始部分，阻礙30S與50S亞基的結(jié)合真核生物蛋白質(zhì)生物合成的起始機(jī)制與原核生物基本相同，其差異主要是核糖體較大，有較多的起始因子參與，其mRNA具有m7GpppNp帽子結(jié)構(gòu)，Met-tRNAMet不甲酰化，mRNA分子5'端的“帽子”參與形成翻譯起始復(fù)合物。真核生物的翻譯的起始因子：

eIF2

3種亞基

形成三元起始復(fù)合體(eIF2,GTP,tRNA)

eIF2-A

65kd

Met-tRNAmet與40S亞基結(jié)合

eIF1

15kd

促使mRNA與40S亞基結(jié)合

eIF3

＞500kd

促使mRNA與40S亞基結(jié)合

eIF4b

80kd

促使mRNA與40S亞基結(jié)合

eIF4a

50kd

促使與mRNA，GTP結(jié)合

eIF4c

19kd

促使兩亞基結(jié)合

eIF5

150kd

釋放eIF2，eIF3

eIF4e(eIF4f的亞基)

與5’端帽子結(jié)合4.4.3

肽鏈的延伸過程：后續(xù)AA-tRNA與核糖體結(jié)合

肽鏈的生成

移位延伸因子：EF-Tu，EF-Ts，EF-G(原核生物)

EF-1,EF-2(真核生物)

2個(gè)GTP后續(xù)AA-tRNA與核糖體結(jié)合細(xì)菌中肽鏈延伸的第一步反應(yīng)：第二個(gè)氨基酰-tRNA的結(jié)合。該氨基酰-tRNA首先與EF-Tu·GTP形成復(fù)合物，進(jìn)入核糖體的A位，水解產(chǎn)生GDP并在EF-Ts的作用下釋放GDP并使EF-Tu結(jié)合另一分子GTP，進(jìn)入新一輪循環(huán)。肽鍵的生成核糖體·mRNA·AA-tRNA復(fù)合物中，AA-tRNA占據(jù)A位，fMet-tRNAfMet占據(jù)P位。在肽基轉(zhuǎn)移酶（peptidyltransferase）的催化下，A位上的AA-tRNA轉(zhuǎn)移到P位，與fMet-tRNAfMet上的氨基酸生成肽鍵。起始tRNA在完成使命后離開核糖體P位點(diǎn)，A位點(diǎn)準(zhǔn)備接受新的AA-tRNA，開始下一輪合成反應(yīng)。移位肽鍵延伸過程中最后一步反應(yīng)是移位，即核糖體向mRNA3'端方向移動(dòng)一個(gè)密碼子。此時(shí)，仍與第二個(gè)密碼子相結(jié)合的二肽基tRNA2從A位進(jìn)入P位，去氨基酰-tRNA被擠入E位，mRNA上的第三位密碼子則對(duì)應(yīng)于A位。EF-G是移位所必須的蛋白質(zhì)因子，移位的能量來自另一分子GTP水解。4.4.4

肽鏈的終止終止因子：原核生物有3種蛋白因子:RF1、RF2、RF3。RF1用于識(shí)別終止密碼子UAA、UAG；RF2幫助識(shí)別UAA、UAG；RF3不識(shí)別終止密碼子，主要是協(xié)助肽的釋放。一旦tRNA從核糖體上脫落，則核糖體立即離開mRNA，并解離成50S和30S亞基，核糖體可以重復(fù)使用。真核生物僅一種：RF4.4.5

蛋白質(zhì)前體的加工1.N端fMet或Met的切除2.二硫鍵的形成：蛋白質(zhì)合成后通過兩個(gè)半胱氨酸的氧化形成3.特定氨基酸的修飾：磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羥基化、羧基化4.切除新生肽鏈中的非功能片段糖蛋白中常見的糖—肽連接鍵：N—糖苷鍵：β-N-乙酰氨基葡萄糖基-天冬酰胺(GlcNAc-Asn)O—糖苷鍵：α-N-乙酰氨基半乳糖基-絲氨酸/蘇氨酸(GalNAc-Ser/Thr)4.4.6

蛋白質(zhì)合成的抑制劑1.抗生素類阻斷劑：鏈霉素、卡那霉素、新霉素等：競(jìng)爭(zhēng)性抑制蛋白質(zhì)合成四環(huán)素和土霉素：四環(huán)素阻止氨酰-tRNA轉(zhuǎn)移到A位置氯霉素：阻斷50S亞基的活性嘌呤霉素(Puromycin)白喉霉素(diphtheriatoxin)：與延長(zhǎng)因子發(fā)生作用2.干擾素對(duì)病毒蛋白合成的抑制：從白細(xì)胞中得到α-干擾素，從成纖維細(xì)胞中得到β-干擾素，在免疫細(xì)胞中得到γ-干擾素。

抗生素抑制蛋白質(zhì)生物合成的原理抗生素

作用點(diǎn)

作用原理四環(huán)素族

原核核蛋白體小亞基

抑制氨酰-tRNA與小亞基結(jié)合氯霉素

原核核蛋白體大亞基

抑制轉(zhuǎn)肽酶，阻斷延長(zhǎng)鏈霉素/卡那霉素

原核核蛋白體小亞基

改變構(gòu)象引起讀碼錯(cuò)誤，

抑制起始

嘌呤霉素

原、真核核蛋白體大亞基

抑制轉(zhuǎn)肽酶，妨礙移位放線菌酮

真核核蛋白體大亞基

抑制轉(zhuǎn)肽酶，阻斷延長(zhǎng)紅霉素

原核核糖體大亞基

阻斷移位，阻斷Pro合成延長(zhǎng)4.4.7RNA分子在生物進(jìn)化中的地位RNA在生命起源中的地位及其演化過程生命是自我復(fù)制的體系：三種生物大分子，只有RNA既具有信息載體功能又具有酶的催化功能。因此，推測(cè)RNA可能是生命起源中最早的生物大分子。核酶(ribosome)：具有催化作用的RNA。由RNA催化產(chǎn)生了蛋白質(zhì)DNA代替了RNA的遺傳信息功能DNA雙鏈比RNA單鏈穩(wěn)定；DNA鏈中胸腺嘧啶代替了RNA鏈中的尿嘧啶，使之易于修復(fù)。蛋白質(zhì)取代了絕大部分RNA酶的功能蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性與構(gòu)象的多變性；與RNA相比，蛋白質(zhì)能更為有效地催化多種生化反應(yīng)，并提供更為復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分，逐漸演化成今天的細(xì)胞。4.5

蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)類別若某個(gè)蛋白質(zhì)的合成和運(yùn)轉(zhuǎn)是同時(shí)發(fā)生的，則屬于翻譯運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制；若蛋白質(zhì)從核糖體上釋放后才發(fā)生運(yùn)轉(zhuǎn)，則屬于翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制。這兩種運(yùn)轉(zhuǎn)方式都涉及到蛋白質(zhì)分子內(nèi)特定區(qū)域與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系。4.5.1

翻譯—運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制信號(hào)序列(signalsequence)：在起始密碼子后，有一段編碼疏水性氨基酸序列的RNA區(qū)域，這個(gè)氨基酸序列就被稱為信號(hào)序列。信號(hào)肽(signalpeptide)：絕大多數(shù)越膜蛋白的N端都具有長(zhǎng)度大約在13-36個(gè)殘基之間的以疏水氨基酸為主的N端信號(hào)序列或稱信號(hào)肽。信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.一般帶有10-15個(gè)疏水氨基酸2.常常在靠近該序列N-端疏水氨基酸區(qū)上游帶有1個(gè)或數(shù)個(gè)帶正電荷的氨基酸3.在其C-末端靠近蛋白酶切割位點(diǎn)處常常帶有數(shù)個(gè)極性氨基酸，離切割位點(diǎn)最近的那個(gè)氨基酸往往帶有很短的側(cè)鏈(Ala或Gly)信號(hào)序列的基本作用：1.通過與SRP的識(shí)別和結(jié)合，引導(dǎo)核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合2.通過信號(hào)序列的疏水性，引導(dǎo)新生肽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)SRP&DP信號(hào)識(shí)別顆粒(signalrecognitionpartical，SRP)：是一種核糖核酸蛋白復(fù)合體，它的作用是識(shí)別信號(hào)序列，并將核糖體引導(dǎo)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。停靠蛋白(dockingprotein，DP，又稱SRP受體蛋白)：即SRP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的受體蛋白，它能夠與結(jié)合有信號(hào)序列的SRP牢牢地結(jié)合，使它在合成蛋白質(zhì)的核糖體?？康絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)上來。信號(hào)肽假說(signalhypothesis)：提出：G.Blobel&B.Dobborstein(1975)證明：基因重組實(shí)驗(yàn)核心內(nèi)容：核糖體同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)合受制于mRNA中特定的密碼序列(可以翻譯成信號(hào)肽)，具有這種密碼序列的新生肽才能連同核糖體一起附著到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的特定部位。已知野生型細(xì)胞中，β-半乳糖酶定位于胞質(zhì)內(nèi)，麥芽糖結(jié)合蛋白定位于胞外，麥芽糖運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白位于外膜內(nèi)腔。如果把β-半乳糖酶羧基端基因片段與麥芽糖運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白和麥芽糖結(jié)合蛋白的氨基端基因片段相連，并以此為模板指導(dǎo)合成雜種蛋白質(zhì)，就可以通過測(cè)定β-半乳糖酶的活性確定雜種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的位置。4.5.2

翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制1.線粒體蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸2.葉綠體蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制線粒體蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)

通過線粒體膜的蛋白質(zhì)是在合成以后再運(yùn)轉(zhuǎn)的。這個(gè)過程有如下特征：①通過線粒體膜的蛋白質(zhì)在運(yùn)轉(zhuǎn)之前大多數(shù)以前體形式存在，它由成熟蛋白質(zhì)和N端延伸出的一段前導(dǎo)肽（leaderpeptide）共同組成。②蛋白質(zhì)通過線粒體內(nèi)膜的運(yùn)轉(zhuǎn)是一種需能過程；③蛋白質(zhì)通過線粒體膜運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，首先由外膜上的Tom受體復(fù)合蛋白識(shí)別與Hsp70或MSF等分子伴侶相結(jié)合的待運(yùn)轉(zhuǎn)多肽，通過Tom和Tim組成的膜通道進(jìn)入線粒體內(nèi)腔。前導(dǎo)肽的作用與性質(zhì)擁有前導(dǎo)肽的線粒體蛋白質(zhì)前體能夠跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)進(jìn)入線粒體，在這一過程中前導(dǎo)肽被水解，前體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓鞍祝ダ^續(xù)跨膜能力。前導(dǎo)肽一般具有如下特性：帶正電荷的堿性氨基酸（特別是精氨酸）含量較為豐富，它們分散于不帶電荷的氨基酸序列之間；缺少帶負(fù)電荷的酸性氨基酸；羥基氨基酸（特別是絲氨酸）含量較高；有形成兩親（既有親水又有疏水部分）α-螺旋結(jié)構(gòu)的能力。葉綠體蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)葉綠體定位信號(hào)肽一般有兩個(gè)部分，第一部分決定該蛋白質(zhì)能否進(jìn)入葉綠體基質(zhì)，第二部分決定該蛋白能否進(jìn)入類囊體。在這一模型中，蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)是在翻譯后進(jìn)行的，在運(yùn)轉(zhuǎn)過程中沒有蛋白質(zhì)的合成。葉綠體蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)過程有如下特點(diǎn)：①活性蛋白水解酶位于葉綠體基質(zhì)內(nèi)，這是鑒別翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)的指標(biāo)之一。②葉綠體膜能夠特異地與葉綠體蛋白的前體結(jié)合。③葉綠體蛋白質(zhì)前體內(nèi)可降解序列因植物和蛋白質(zhì)種類不同而表現(xiàn)出明顯的差異。4.5.3核定位蛋白的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制核定位序列（NLS—NuclearLocalizationSequence）NLS可以位于核蛋白的任何部位。蛋白質(zhì)向核內(nèi)運(yùn)輸過程需要一系列循環(huán)于核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)的蛋白因子包括核運(yùn)轉(zhuǎn)因子（Importin）α、β和一個(gè)低分子量GTP酶（Ran）參與。由上述三個(gè)蛋白組成的復(fù)合物?？吭诤丝滋?，依靠RanGTP酶水解GTP提供的能量進(jìn)入細(xì)胞核，α和β亞基解離，核蛋白與α亞基解離，α和β分別通過核孔復(fù)合體回到細(xì)胞質(zhì)中，起始新一輪蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)。細(xì)菌同樣能通過定位于蛋白質(zhì)N-端的信號(hào)肽將新合成的多肽運(yùn)轉(zhuǎn)到其內(nèi)膜、外膜、雙層膜之間或細(xì)胞外等不同部位。4.5.4蛋白質(zhì)的降解在大腸桿菌中，蛋白質(zhì)的降解是通過一個(gè)依賴于ATP的蛋白酶（稱為L(zhǎng)on）來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)細(xì)胞中出現(xiàn)錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)或半衰期很短的蛋白質(zhì)時(shí)，該酶就被激活。Lon蛋白酶每切除一個(gè)肽鍵要消耗兩個(gè)分子的ATP。成熟蛋白N-端的第一個(gè)氨基酸（除已被切除的N端甲硫氨酸之外，但包括翻譯后修飾產(chǎn)物）在蛋白的降解中有著舉足輕重的影響（表4-16）。當(dāng)某個(gè)蛋白質(zhì)的N端是甲硫氨酸、甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸時(shí)，表現(xiàn)穩(wěn)定。其N端為賴氨酸、精氨酸時(shí)，表現(xiàn)最不穩(wěn)定，平均2-3分鐘就被降解了。在真核生物中，蛋白質(zhì)的降解依賴于泛蛋白（Ubiquitin），該蛋白只有76個(gè)氨基酸殘基，序列高度保守（從酵母和人細(xì)胞中提取的泛蛋白幾乎完全相同?。?，生物細(xì)胞內(nèi)即將被降解的蛋白首先在ATP的作用下與泛蛋白相連。這個(gè)過程需有E1、E2、E3三個(gè)降解因子參與。一旦被降解蛋白與泛蛋白相連接，這個(gè)復(fù)合體就能被運(yùn)送到分子量高達(dá)1×106的蛋白降解體系中直到完全降解。習(xí)題1.遺傳密碼的擺動(dòng)性是指:A.遺傳密碼可以互換

B.密碼的第3位堿基與反密碼的第1位堿基可以不嚴(yán)格互補(bǔ)

C.一種密碼可以代表不同的氨基酸D.密碼與反密碼可任意配對(duì)

E.不同的氨基酸具有相同密碼2.反密碼子IGC可以識(shí)別的密碼子是:A.GCG

B.GCA

C.ACG

D.ICG3.關(guān)于tRNA的敘述,下列哪項(xiàng)是錯(cuò)誤的:A.有反密碼子,能識(shí)別mRNA分子的密碼

B.由氨基酸臂攜帶氨基酸C.一種tRNA能攜帶多種氨基酸

D.一種氨基酸