第八章 遺傳重組-課件

第八章遺傳重組Recombination遺傳物質發(fā)生變異主要有兩方面原因：突變和重組重組———染色體序列發(fā)生重排和新的組合，是遺傳的靈魂！第八章遺傳重組-2遺傳重組遺傳重組：造成基因型變化的基因交流過程。發(fā)生：減數分裂性細胞內，體細胞地點：核基因間，葉綠體基因間，線粒體基因間，重組子間；前提條件：不同基因型的遺傳物質彼此能夠轉移。作用：保證了遺傳多樣性,為選擇奠定了物質基礎,是生物得以進化發(fā)展，與突變一起是變異的來源第八章遺傳重組-2遺傳重組主要類型：(依據對DNA序列和所需蛋白質因子的要求)

同源重組位點專一性重組異常重組其共同點是雙股DNA間的物質交換，但發(fā)生的情況不同。第八章遺傳重組-2第一節(jié)遺傳重組的類型

遺傳重組或稱基因重組是遺傳的基本現(xiàn)象。無論高等真核生物，還是細菌、病毒都存在遺傳重組現(xiàn)象；遺傳重組不僅發(fā)生于代與代之間，即在減數分裂中發(fā)生基因重組，一個個體的基因組也可以發(fā)生重排，即在體細胞中也會發(fā)生重組，這能產生基因表達的改變，在一個個體的細胞之間產生遺傳基因的多樣性；另外，重組不只是在核基因之間發(fā)生，在葉綠體基因間、線粒體基因間也可發(fā)生重組；重組也見于噬菌體的整合過程和轉座子的轉座等的過程中。由此可見，只要有DNA就會發(fā)生重組，這表明重組對物種的生存是十分重要的。第八章遺傳重組-2一、同源重組/普遍性重組

1.同源重組：依賴大范圍的DNA同源序列的聯(lián)會，重組過程中，兩個染色體或DNA分子交換對等的部分。例：同源染色體非姐妹單體交換；細菌的轉化、轉導、結合；噬菌體的重組…需要重組的蛋白質參與；（例如.大腸桿菌：RecA蛋白、RecBC蛋白）蛋白質因子對DNA堿基序列的特異性要求不高；（存在重組熱點和序列長度的影響）真核生物染色質的狀態(tài)影響重組的頻率。第八章遺傳重組-21.進行同源重組的條件（1）在交換區(qū)有相同或相似的序列同源染色體相同的區(qū)域的DNA序列一般相似。同源區(qū)越長越有利于重組，大腸桿菌活體重組要求20－40bp相同；大腸桿菌與噬菌體或質粒重組同源區(qū)要求≥13bp;等p197第八章遺傳重組-2（3）重組酶使參與重組的DNA發(fā)生斷裂、重接、修復、重組體釋放。（2）堿基配對參與重組的DNA互相配對，形成異源雙鏈。第八章遺傳重組-23.功能：

A：維持種群的遺傳多樣性；

B：有助于DNA的損傷修復；

C：使真核生物產生第一次減數分裂中染色體正確分離到子細胞至關重要的瞬間物理連接。第八章遺傳重組-2

二、位點專一性重組/保守性重組

原核生物中最為典型

特點：供體與受體的特定位點的短同源序列之間。

DNA精確切割連接

DNA不失去、不合成、不交換對等部分（有時是一個DNA分子整合到另一個DNA分子中，又稱整合式重組），需要位點專一性的蛋白質因子參與。第八章遺傳重組-2例如：λ噬菌體DNA通過其attP位點和大腸桿菌DNA的attB位點之間專一性重組而實現(xiàn)整合過程。條件：一段15bp的同源序列和位點專一性的蛋白質因子（不能催化其他任何兩條不論是同源的還是非同源序列間的重組，從而保證了λ噬菌體整合方式的專一性和高度保守性，因此又稱保守性重組。）而且這一重組不需要RecA蛋白質的參與。第八章遺傳重組-2三、異常重組

完全不依賴于序列間的同源性而使一段DNA序列插入另一段中，但在形成重組分子時往往依賴DNA復制而完成重組過程，因此又稱復制性重組。P198

特殊例子：轉座第八章遺傳重組-2第二節(jié)同源重組的分子機制一、斷裂重接模型（breakagejoiningmodel）C．D．Darlington1936年提出。在同源染色體聯(lián)會時，由于染色體的纏繞而產生張力，兩個相對染色單體在同一位置斷裂，然后彼此和另一染色單體重新連接起來從而形成重組并消除這種張力。第八章遺傳重組-2一異源DNA分子的斷裂與重接在細胞水平下，同源染色體配對、兩條非同源染色體之間發(fā)生斷裂、重組、交換。同源重組是參與重組DNA分子的斷裂與鏈接第八章遺傳重組-2二、異源DNA分子的斷裂與重接

1.證據：

1961，M.MeselsonandJ.J.Wergle兩個雙標記λ噬菌體感染大腸桿菌。(c.mi)λ噬菌體1

13C和14N“重”鏈

(+.+)λ噬菌體2

12C和14N“輕”鏈同時感染大腸桿菌子代噬菌體CsCl密度梯度離心重鏈重鏈和輕鏈輕鏈第八章遺傳重組-2第八章遺傳重組-22、幾個概念：

重組核心：兩個DNA分子的連接

連接分子/接合分子：

重組接點/重組結合點：

雜種DNA/異源雙鏈DNA：

分支遷移：重組接點沿雙鏈移動

交互重組：一條親本雙螺旋分子和另外一條親本雙螺旋分子共價連接，中間有一端異源雙鏈區(qū)，這種重組稱為交互重組。

第八章遺傳重組-2三、同源重組的Hollidaymodel1964年美國學者RobinHolliday提出了著名的Holliday重組模型。前提：參與重組的DNA靠近（同源染色體聯(lián)會）1、同源重組的Hollidaymodel第八章遺傳重組-2①參與重組的兩條DNA單鏈被切斷②切開的3’端與另一條鏈的5’端交叉相連接第八章遺傳重組-2③交叉點移動，形成異源雙鏈區(qū)④斷裂在交叉點處四條單鏈DNA都斷裂。第八章遺傳重組-2⑤重接以兩種不同的連接方式重接。原地重接交換重接第八章遺傳重組-2⑥結果參與交換的單鏈DNA中部都有異源區(qū)段（heteroduplex）（B’/b’）。兩側的標記基因C/c有一半交換（c/c’；C/C’）第八章遺傳重組-22該模型對重組過程的解釋如下：A、同源的非姐妹染色單體聯(lián)會；B：同源非姐妹染色單體DNA中兩個方向相同的單鏈，在DNA內切酶的作用下，在相同位置同時切開；C：切開的單鏈交換重接;D：形成交聯(lián)橋結構；第八章遺傳重組-2E：交聯(lián)橋沿配對DNA分子“移動”。兩個親本DNA分子間造成一大段異源雙鏈DNA（Holliday結構）F：E和F相同；G：繞交聯(lián)橋旋轉1800；J：形成Holliday異構體；I、通過兩種方式之一切斷DNA單鏈，若左右切，則形成非重組體，若上下切則形成重組體。由上可知：無論Holliday結構斷裂是否導致旁側遺傳標記的重組，他們都含有一個異源雙鏈DNA區(qū)。第八章遺傳重組-2HOLLIDAY模型第八章遺傳重組-2

第八章遺傳重組-23環(huán)狀DNA分子的重組兩個環(huán)狀DNA分子配對、斷裂、重接形成“8”字型結構中間物，根據切割的位置不同，可分別形成兩個親本環(huán)、大的單體環(huán)或者是滾環(huán)結構。也可以形成“χ”結構。第八章遺傳重組-22第八章遺傳重組-2第八章遺傳重組-23、修改的Hollidaymodel①前三步相同，②第四步的時候先形成一個十字架結構（isomericHollidaystructure）第八章遺傳重組-2③十字架的分離（斷裂-重接）有兩種方式④結果仍然產生一半的重組第八章遺傳重組-2十字架的剪切只需兩條鏈斷開第八章遺傳重組-2Holliday十字架連接體的電鏡照片第八章遺傳重組-24、雙鏈斷裂起始重組模型Double-StrandBreaksinDNAInitiateRecombinationSzostak等1983年提出，重組是由一系列的內切酶和外切酶發(fā)動的。內切酶與外切酶共同在一對DNA單鏈上制造一個缺口。利用另一條同源染色體DNA鏈為模板進行復制修復。第八章遺傳重組-2第八章遺傳重組-2第八章遺傳重組-2三、基因轉變及其分子機理

重組是一個非常正確的交互過程，在減數分裂的產物中大多數是交互的正常分離，但從大量的分析知道，有時也會出現(xiàn)不規(guī)則情況，從而產生少量的異常分離（abnormalsegregations）。對于任何重組模型不僅必須說明正常的重組過程，還必須考慮到這些不規(guī)則現(xiàn)象，因此我們在討論重組的分子基礎以前，先說明一下重組模型應當兼顧到的基因轉變現(xiàn)象。第八章遺傳重組-2（一）異常分離與基因轉變

在一個雜合體中，如果一染色體把基因A交給它的同源染色體，則它的同源染色體必定把基因a交回給它，所以在真菌中，一個座位上的兩等位基因分離時，應該呈現(xiàn)2：2或1：1：1：1或1：2：1的分離(表8-1)，這就說明重組通常總是交互的?？墒荓indegren在面包酵母（Saccharomycescerevisiae）中發(fā)現(xiàn)，有的子囊含有（3A+1a）或（1A＋3a）的子囊孢子。以后在脈孢霉、釀酒酵母、子囊菌Ascobolusimmersus及果蠅中也發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。8第八章遺傳重組-2Mitchell對子囊菌中出現(xiàn)的異常分離的現(xiàn)象進行了詳細的分析。在Mitchell的雜交試驗中，所用的基因是關于吡哆醇（pyridoxine,維生素B6）的合成。帶有這個基因的突變株需要在培養(yǎng)基上添加吡哆醇后才能生長，且對酸度（pH）敏感，改變酸度后，就無需添加了，這突變基因稱作pdxp。在其非常鄰近的位點上的另一突變基因pdx，也是吡哆醇需要型突變，但對酸度不敏感。第八章遺傳重組-2Mitchell把兩個脈孢霉(N.crassa)的吡哆醇突變株雜交，＋pdxp′pdx＋，取得子一代子囊后，對585個子囊中的孢子依次解剖出來進行培養(yǎng)和鑒定。他發(fā)現(xiàn)4個子囊中，有野生型的孢子對(++)，好象這兩個位點間有了重組；可是跟預期相反，重組后應該同時出現(xiàn)的雙突變型(pdxpdxp)孢子對卻沒有發(fā)現(xiàn)(表9-2)。分析方法是靈敏的，如果有雙突變型的話，是能夠檢出的，并且也不可能是突變，因為它們出現(xiàn)的頻率比這些位點的正常突變率高很多。55第八章遺傳重組-2在正常情況下，由于重組，在出現(xiàn)完全野生型孢子對(++)的同時，也應出現(xiàn)對應的重組產物-雙突變型孢子對(pdxpdxp)。然而如圖9-1B發(fā)生的情況，好象pdxp轉變成了pdxp＋(或+)，這些不尋常的情況，好象是由于一個基因轉變?yōu)樗牡任换颍詫⑦@種情況稱為基因轉變（geneconversion）。圖9-1中以表示pdxp基因發(fā)生了基因轉變。第八章遺傳重組-2在糞生糞殼菌（Sordariafimicola）中也發(fā)現(xiàn)有基因轉變現(xiàn)象。Olive等對g座位進行了廣泛的研究，g-的子囊孢子為灰色，而g+的子囊孢子為黑色。g+′g-雜交，在所分析的200,000個子囊中，絕大部分屬于正常的4g+:4g-類型，但也發(fā)現(xiàn)有0.06%是5:3分離，0.05%是6：2分離，還有0.008%是3：1：1：3或異常的4：4分離。第八章遺傳重組-2AAAAaaaa糞生糞殼菌(Olive):GA×gaGA非重組孢子對GagaGAgAga非重組孢子對重組孢子對，一個孢子基因轉變重組孢子對，一個孢子基因轉變第八章遺傳重組-2

在異常的4：4子囊中，雖然也是有4個g+和4個g-，但排列方式特殊，一個孢子對中的兩個孢子有著不同的基因型，而在正常情況下，它們應有相同的基因型，因為每一孢子對都是一次有絲分裂的產物。此外，在糞生糞殼菌中，雖然g/+這對等位基因表現(xiàn)不尋常的分離，但是鄰近的基因A/a都呈現(xiàn)正常的分離(圖9-3)。從糞生糞殼菌的基因轉變資料可以看出，它有個重要的特點：即在有基因轉變的子囊中，基因轉變和遺傳重組都發(fā)生在同樣兩個單體的子囊比例竟高達90%（圖9-3），換句話說，基因轉變跟遺傳重組是有關的，這也是基因轉變與基因突變的差異。第八章遺傳重組-2雖然g/+這對等位基因表現(xiàn)不尋常的分離，但是鄰近的基因A/a都呈現(xiàn)正常的分離

在發(fā)生基因轉變產生異常4:4分離(3:1:1:3)和5:3分離的糞生糞殼菌中，與g+/g-基因鄰近的A/a基因(用灰底表示A，白底表示a)呈2:2正常分離第八章遺傳重組-2第八章遺傳重組-2（二）基因轉變的類型染色單體轉變：2：6或6：2分離比

減數分裂4個產物中，一個出現(xiàn)基因轉變半染色單體轉變：5：3；3：1：1：3

減數分裂四個產物中，一個或2個的一半出現(xiàn)基因轉變

減數分裂后分離：等位基因的分離發(fā)生在減數分裂后的有絲分裂中第八章遺傳重組-2（三）基因轉變的分子機制

基因轉變的實質：重組過程中留下的局部異源雙鏈區(qū)，在細胞內的修復系統(tǒng)識別下不同的酶切/不酶切產生的結果。不同的切除會產生不同的結果。一對同源染色體有4個染色單體，每一染色單體是一條DNA雙鏈，所以一對同源染色體有4條DNA雙鏈。在晚偶線期和早粗線期染色體配對時，同源非姊妹染色單體的DNA分子配合在一起；核酸內切酶識別DNA分子上的相應斷裂點（breakagepoint），在斷裂點的地方把磷酸二酯鍵切斷，使兩個非姊妹DNA分子各有一條鏈斷裂；兩斷鏈從斷裂點脫開，螺旋局部放松，單鏈交換準備重接；在連接酶的作用下，斷裂以交替方式跟另一斷裂點相互聯(lián)結，形成一個交聯(lián)橋（cross-bridge），這結構又稱Holliday中間體（Hollidayintermediate）;第八章遺傳重組-2這交聯(lián)橋不是靜態(tài)的，可以靠拉鏈式活動沿著配對DNA分子向左右移動，其中互補堿基間形成的氫鍵從一條親本鏈改為另一條親本鏈，于是移動后在兩個親本DNA分子間留下較大片段的異源雙鏈DNA，這種結構又稱為Holliday結構；隨后這交聯(lián)橋的兩臂環(huán)繞另外兩臂旋轉成為十字形，并在交聯(lián)部分斷開，消除交聯(lián)體，恢復為兩個線性DNA分子，即形成Holliday結構的異構體(圖9-4H)；斷開方向或沿東西軸進行，或沿南北方向進行(圖9-4I)；如沿東西方向切斷，即上連、下連，則產生的兩個異源雙鏈的兩側基因為AB和ab，仍保持親代類型，如沿南北方向切割，即左連、右連，則兩側基因為Ab和aB，產生兩個重組類型，但不論是那種情況，即Holliday結構斷裂是否導致旁側遺傳標記的重組，它們都含有一個異源雙鏈DNA區(qū)，有關的兩核苷酸區(qū)段分別來自不同的親本，從而由原來的G-C、A-T配對變?yōu)镚-A、C-T非配對。第八章遺傳重組-2從Holliday模型已清楚地表明在對稱的異源雙鏈區(qū)存在著不配對堿基(如G-A、C-T)，這種異源DNA是不穩(wěn)定的，細胞內的修復系統(tǒng)能夠識別不配對堿基，并以其中一條鏈為模板進行切除修復。在上面的糞生糞殼菌雜交中，假設用于g+′g-雜交的兩親本僅有一對堿基之差，如：不相稱堿基對第八章遺傳重組-2不配對的核苷酸在DNA分子中造成歪斜，不配對的一小段首先由核酸外切酶(exonuc1ease)切除，留下單鏈的缺口；然后在DNA聚合酶的作用下，以一條鏈為模板合成具有互補堿基的區(qū)段，填補缺口，再由連接酶的作用，把新合成的短鏈以共價鍵聯(lián)接上去，成為連續(xù)的核苷酸鏈，完成修復過程，從而完成修復過程。在修復時，由于切除的不配對堿基區(qū)段的不同，可以有下列兩種方式圖(9-5)：如對不相稱的堿基對G-A的修復，由于切去的區(qū)段的不同，或者在染色單體中形成一個野生型基因（+），或者在染色單體中形成一個突變型基因（g）。第八章遺傳重組-2第八章遺傳重組-2根據切除修復原理，基因轉變的幾種類型產生的分子機制可以歸納如下（圖8-8）。1．兩個雜種分子均未校正（圖8-8A）復制后出現(xiàn)異常的4＋∶4g（或3∶1∶1∶3）的分離。2．一個雜種分子校正為+，或校正為g時，則發(fā)生另一種類型的半染色單體轉變，前者修復后出現(xiàn)5∶3的分離，后者子囊孢子的異常分離比為3∶5（圖8-8B）。第八章遺傳重組-23．兩個雜種分子都被校正到+（或g）時（圖8-8C），修復后出現(xiàn)6＋∶2g（或2＋∶6g）的異常分離。這便是出現(xiàn)染色單體轉變的起因。4．當兩個雜種分子都按原來兩個親本的遺傳結構進行修復時，則減數分裂4個產物恢復成G-C、G-C、A-T、A-T的正常配對狀態(tài)，子囊孢子分離正常，呈現(xiàn)4＋∶4g的結果，如圖8-8D所示。第八章遺傳重組-2第八章遺傳重組-2四、Meselson-Radding模型Holliday模型中為對稱的雜合雙鏈，而實際情況有不均等分離現(xiàn)象，1975年Meselson-Radding

提出模型解釋這種不對稱重組現(xiàn)象：

1.單鏈切斷

2.鏈置換

3.單鏈入侵

4.泡切除

5.鏈同化（碎鏈吸收）

6.異構化——Holliday7.分支遷移第八章遺傳重組-2第八章遺傳重組-2五、負干涉負干涉：兩個鄰近基因，尤其一個基因不同突變點間，雙交換的頻率比預期高，并發(fā)系數C>1，即一個區(qū)域的交換引起鄰近區(qū)域交換的增加。局部負干涉：負干涉的形成原因是存在并不伴隨兩側遺傳標記重組的基因轉變。第八章遺傳重組-2第三節(jié)細菌的同源重組一、細菌同源重組的特點細菌的接合、轉化以及轉導重組都是同源重組，而且這種重組是發(fā)生在一個完整的環(huán)狀雙螺旋DNA分子與一個雙鏈或單鏈DNA分子片段之間的。且重組需要3種基因所編碼的RecA和RecBC蛋白質。

第八章遺傳重組-2RecA蛋白：多功能蛋白

1.NTP酶活性：存在單鏈DNA時，RecA具水解ATP/dATP活性，促進聯(lián)會。

2.單鏈DNA結合活性：RecA蛋白與單鏈DNA形成絲狀復合物，使其免受核酸酶攻擊。

3.DNA解旋活性：DNA為單鏈或寡聚核苷酸。RecA蛋白在雙鏈DNA的單鏈切口處解開雙螺旋

4.部分單鏈DNA區(qū)，RecA蛋白促進DNA分子間聯(lián)會。RecA蛋白異源雙鏈區(qū)第八章遺傳重組-2RecBC：溶解酶(Resolvase)活性,斷裂Holliday結構的交聯(lián)橋完成重組。第八章遺傳重組-2二、細菌轉化重組機制實質：單鏈DNA片段與完整DNA之間的重組，如下情況：①切除外源DNA——無重組②切除受體DNA——發(fā)生重組③無修復作用——子代細胞出現(xiàn)兩種基因型（受體基因型和重組體基因型）*通常采用有利于重組體基因型生長的選擇條件第八章遺傳重組-2第八章遺傳重組-2高效率標記（high-efficiencymaker)：在轉化中，有些遺傳標記或是很少發(fā)生校正作用，或是校正切除幾乎總是在受體DNA上，因此轉化頻率較高，這類遺傳標記稱為~。低效率標記（low-efficiencymaker）：轉化中一些標記的校正切除總是傾向于發(fā)生在供體單鏈上，因而出現(xiàn)很低的轉化頻率，這類標記稱為~。第八章遺傳重組-2三、細菌的接合與轉導中的重組機制接合重組（Hfr與F-之間進行）部分DNA進入細胞，且只有其中的部分參與重組，需要RecA和RecBC參與，機制與轉化重組相似轉導重組（phage-DNA與細菌之間）雙鏈DNA與完整雙鏈DNA之間的重組，供體DNA以雙鏈進入受體細胞，并且以雙鏈形式整合進入染色體，需要RecA和RceBC參與。第八章遺傳重組-2四、原核生物重組的酶學基礎（1）RecBCD酶系統(tǒng)與重組起始RecBCD復合體是recB、C、D基因編碼的。具有螺旋酶（helicase）和外切酶（exonuclease）的活性（5′→3′及3′→5′），特異性識別雙鏈斷裂部位（double-strandbreak）。①RecBCD復合物第八章遺傳重組-2③RecBCD引起的雙鏈降解CHI位點在E.coliDNA中大約每5-10kb中就有一個。②CHI位點在λ噬菌體

DNA上發(fā)現(xiàn)的引起高頻重組的位點。5’-GCTGGTGG-3’3’-CGTCCACC-5’i）識別雙鏈斷裂ii）移動到CHI位點，并解旋DNA雙鏈。iii）利用外切酶活性降解DNA雙鏈。第八章遺傳重組-2iii）到達CHI位點時3’5’外切酶活性被抑制，但5’3’外切酶活性加強。iv）結果形成了一個3’突出端，提供RecA識別重組。第八章遺傳重組-2（2）RecA與單鏈入侵、同源配對、Holliday結構形成①RecAi）能與任何單鏈DNA（single-strandDNA，ssDNA）結合。iii）能啟動單鏈DNA與之同源的雙鏈DNA鏈配對。引發(fā)單鏈取代（singlestranduptake），形成一個Holliday結構。ii）有ATP酶活性。第八章遺傳重組-2Hollidaystructure第八章遺傳重組-2（3）Ruv與交叉點的移動、Holliday結構的分離①Ruv蛋白特異性地識別Hollidaystructure。ii）RuvB有helicase和ATPase活性，發(fā)動交叉點遷移。iii）RuvC內切酶活性，切割Holliday結構的分枝點i）RuvA第八章遺傳重組-2RuvAB結合Holliday結構的電鏡模型兩個RuvB六聚體（hexamer）以相反的方向纏繞在DNA外邊，“擰”動DNA雙螺旋。第八章遺傳重組-2②Ruv作用過程i）RuvA和RuvB結合到Holliday結構上。ii）導致分枝點以10-20bp/s遷移。第八章遺傳重組-2iii）兩個分子的RuvC分別結合到RuvA的相反方向上第八章遺傳重組-2v）重新連接上，形成重組分子（或非重組分子）iv）RuvC切斷DNA，（有兩種切割方式。）重組分子第八章遺傳重組-2第四節(jié)位點專一性重組一、λ噬菌體的整合和切除

λ噬菌體：attPPOP、

大腸桿菌：attB/attλBOB、

1.整和：BOB、+POP、BOP、+POB、

2.切除：BOP、+POB、BOB+POPIntIHFInt,XisIHF第八章遺傳重組-2

通過attP和attB間的相互重組，環(huán)狀的噬菌體DNA轉換為整合的原噬菌體，原噬菌體通過attL和attR間的相互重組而切除第八章遺傳重組-2由重組酶（recombinase）催化，發(fā)生在特殊序列對之間。一、

DNA在E.coliDNA特殊位點的整合1.附著位點（attachmentsite,att）位于細菌DNA上的att序列稱為attB；（1）attBBOB’第八章遺傳重組-2（2）attP位于λ上的att序列稱為attP。POP’（3）核心序列（coresequence）O是attB與attP共有的15bp相同序列。（4）交錯剪切序列核心區(qū)中的7bp：GCTTTTTTATACTAACGAAAAAATATGATTTTTATACAAATATG是Int（整合酶）的結合位點。第八章遺傳重組-22.整合過程BOB’POP’BOB’P’λOPλDNA細菌DNAInt：integrase（噬菌體基因產物）；IHF：integrationhostfactor（細菌基因產物）Int、IHF第八章遺傳重組-23.核心區(qū)重組細節(jié)GCTTTTTTATACTAACGAAAAAATATGATTBB’GCTTTTTTATACTAACGAAAAAATATGATTP’P切斷后重接細菌DNAλDNA第八章遺傳重組-2CGAAAAAATATGCGAAAAAATATGTTTATACTAAGCTTTGCTTTATTTTTATACTAAATTP’BB’P第八章遺傳重組-2CGAAAAAATATGCGAAAAAATATGTTTATACTAAGCTTTGCTTTATTTTTATACTAAATTP’BB’PλDNA細菌DNA動畫演示:位點特異性重組第八章遺傳重組-2第八章遺傳重組-2第五節(jié)異常重組－原核生物中的轉座子Transposonsaregeneticunitsthatcanmoveorbe“transposed”withinthegenome.Themovementofgeneticunitsfromoneplaceinthegenometoanotheroftendisruptsgeneticfunctionandresultsinphenotypicvariation。Assuch，theimpactofthetranspositionofgeneticunitsoftenfitintoabroaddefinitionofmutation.第八章遺傳重組-2轉座的發(fā)現(xiàn)轉座元件首先是由美國遺傳學家BarbaraMcClintock于1951年在玉米的遺傳學研究中發(fā)現(xiàn)的。獲1983年Nobel生理學和醫(yī)學獎。她稱之為控制元件（controllingelement）。并提出了轉座（transposition）的概念。第八章遺傳重組-2DNAtransposableelement第八章遺傳重組-2Mendel的獨立分配與自由組合遺傳規(guī)律、Morgan的連鎖互換規(guī)律、Watson-CrickDNA雙螺旋、McClintock的轉座，都是遺傳學上的最重大的發(fā)現(xiàn)。但只有McClintock是孤身一人，在沒有任何前人的經驗借鑒和同仁的理解與接受的情況下作出的。用傳統(tǒng)的實驗方法獲得了分子遺傳學的劃時代發(fā)現(xiàn)（比DNA雙螺旋結構的發(fā)現(xiàn)還早兩年?。?。第八章遺傳重組-2一、原核生物轉座子的發(fā)現(xiàn)1.JamesShapiro的觀察1967年，Shapiro在半乳糖操縱子研究中發(fā)現(xiàn)一種奇怪的突變。PgalTgalEgalK半乳糖差向異構酶半乳糖尿苷酰轉移酶半乳糖激酶（1）半乳糖操縱子第八章遺傳重組-2（2）半乳糖代謝UDP-GalUDP-GluGal-1-PGalKTE中間產物Gal-1-P有毒，不能積累！突變株galT-

不能生長，但如果galK突變（galK-），或galT-恢復突變，就能成活。意外發(fā)現(xiàn)：（3）半乳糖突變galE-

galT-

雙突變也能生長！第八章遺傳重組-2（4）分析結果此突變可以恢復，說明不是缺失或移碼突變；誘變劑處理不能提高恢復突變率，說明也不是點突變。E的突變導致了下游位點的K的活性大幅度降低了，細胞中不積累Gal-1-P。其他還有什么樣的突變能引起這種極性突變呢？（5）分析原因極性突變體是指那些影響位于突變位點下游的一個或多個正常基因的表達的突變體第八章遺傳重組-2（6）推測及證實鑒于F因子和λ的整合作用的發(fā)現(xiàn)，Shapiro推測，也許也是部分DNA片段的插入（突變）和撤離（恢復）造成的。Shapiro小組和PeterStarlinger小組分別進行了密度梯度離心和分子雜交實驗，證實突變的DNA中確實有插入片段。突變gal野生型galIS1稱之為IS1（insertionsequence1）在轉導過程中l(wèi)噬菌體可以將宿主菌的DNA整合到它自己的基因組中，將含有gal+和galm(極性突變體)的l噬菌體分別分離出來，同時加入到離心管中進行CsCl密度梯度離心，結果出現(xiàn)了兩條帶，ldgalm的密度大于ldgal+的密度，表明ldgalm有可能具有小片斷DNA的插人。第八章遺傳重組-2（7）IS2Xn：中心區(qū)域兩側的IR序列并非完全相同，配對時會有莖環(huán)。第八章遺傳重組-2含有IS2的半乳糖操縱子與野生型DNA雜交第八章遺傳重組-2IS是最簡單的轉座因子，它僅含有編碼其轉座所需的酶-轉座酶(transposase)的基因，本身沒有任何表型效應。目前已知的IS至少有10余種，如IS1、IS2、IS3等(表9-3)。雖然它們的大小不同，目前已知IS的長度在700-5700bp之間，但有某些共同的結構特征，如每種IS兩端的核苷酸序列完全相同或相近，但方向相反，稱為反向重復序列(invertedrepeatsequence,IR)，這種末端反向重復序列有幾個到幾十個核苷酸對，典型的為15-25bp。由于這種反向重復序列的存在，因此IS(或帶有IS的質粒)經變性和復性后，可以觀察到莖環(huán)結構的存在。第八章遺傳重組-2第八章遺傳重組-2IS的轉座過程是這樣的：首先由轉座酶交錯切開宿主DNA上的靶位點，靶位點一般是隨機的，然后插入IS，即IS與宿主的單鏈末端相連，余下的缺口由DNA聚合酶和連接酶加以填補，結果使插入的IS兩端形成短(2-13bp)的正向重復序列(directrepeatsequence,DR)。第八章遺傳重組-2（2）IS的轉座過程①編碼序列轉錄合成轉座酶（transposase)。②轉座酶結合到轉座子的兩個IR位點，將IS從原有位點以平端（bluntend）的形式精確地切下（不包括DR）。第八章遺傳重組-2③轉座酶同時在要插入的靶序列上制造一個交錯切口，帶有5’單鏈尾。第八章遺傳重組-2④轉座酶又把切下來的平頭轉座子與靶位點的兩個5’單鏈尾連接。⑤細胞內的復制酶把兩側的缺口補上，形成正向重復（DR）ATGCATGCATACGTACGT插入序列第八章遺傳重組-2轉座酶的表達水平一般很低，所以轉座事件的發(fā)生頻率很低（10-3~10-4/代）。ATGCATG

GCATGCATACGTACCGTACGT插入序列第八章遺傳重組-22.Tn轉座子（transposonelements）（1）Tn的結構又稱為Bacterialtransposons、復合轉座子。兩側各一個IS，中間一個抗生素抗性基因（antibiotic-resistancegene）。①主體結構②正向重復（DR），來源與IS的DR相同。第八章遺傳重組-2（2）Tn的轉座過程IRIRIRIR抗生素抗性轉座酶轉座酶ISISIS抗生素抗性基因兩側的IR一般突變，致使轉座酶不能識別。轉座酶只能識別最末端的IR，并切下整個Tn。插入靶序列和連接的過程與IS元件一樣。第八章遺傳重組-2（3）Tn的類型IS50KanrBlerStrrIS50Tn5：5700bpTn9：2638bp1500bpIS1CamrIS1768bpIS10TetrIS101400bpTn10：9300bpTnAIR轉座酶抗生素抗性IR38bp第八章遺傳重組-2第六節(jié)異常重組－真核生物轉座子一、真核生物轉座子的發(fā)現(xiàn)1.MarcusRhoades的觀察1938年，Rhoades分析一種自花授粉的墨西哥玉米的色斑遺傳，發(fā)現(xiàn)了意外的花斑點突變。有色、白色、花斑色第八章遺傳重組-2（1）雜交表明，有色和白色是兩對基因的自由組合。有色：A1___白色：a1a1dtdt花斑色：a1a1Dt_如何解釋花斑色表型與其基因型的關系？花斑色：a1a1Dt_白色：a1a1dtdt（2）測交：有色：A1___花斑色白色？第八章遺傳重組-2測交出現(xiàn)完全有色的后代，說明發(fā)生了恢復突變（a1

A1）。說明花斑色玉米粒中的的每一個色斑實際上是恢復突變的表型效應。（高頻率恢復突變！）但這種突變似乎與Dt的存在密切相關。因為a1a1Dt_是花斑色，而a1a1dtdt只能是白色。即：Dt存在時，a1不穩(wěn)定（很容易突變）；Dt

缺乏時（dt），a1

就穩(wěn)定。第八章遺傳重組-22.McClintock的偉大發(fā)現(xiàn)BarbaraMcClintock在1940-1950年分析了玉米胚乳（endosperm）的色素遺傳。紫色、花斑色、白色第八章遺傳重組-2花斑色是由于突變造成的，而且這種突變不是常規(guī)突變，是與一種“控制因子”（controllingelement)的存在引起的。（2）解釋如果有C基因，胚乳合成色素，呈紫色；如果C突變（c），胚乳無色素，呈白色。在c胚乳的發(fā)育過程中，部分細胞發(fā)生恢復突變（C），形成色斑。突變發(fā)生的越早，色斑就越大。（1）雜交結論第八章遺傳重組-2玉米色斑，大小不一第八章遺傳重組-2（3）對突變的解釋：Ac-Ds系統(tǒng)為什么總是恢復突變、而且高頻率？McClintock認為C突變?yōu)閏是由于一個“可移動的控制因子”（transposablecontrollingelement）的插入引起的，她稱之為Ds（dissociator）。①解離因子Ds第八章遺傳重組-2另外還有一個控制因子Ac（activator），它能激活：②激活因子AcDs插入C基因（引起突變），或從C基因中轉出（恢復突變）。W:white（C基因）第八章遺傳重組-2在插入位點上造成8bp的正向重復（DR），并導致染色體斷裂。Ac引起Ds插入色素基因第八章遺傳重組-2Ac也可以引起Ds解離色素基因突變恢復突變第八章遺傳重組-2動畫演示Ac-Ds引起的玉米色素突變第八章遺傳重組-2（4）Ac-Ds的基因結構第一個Ac因子長4563bp，與細菌的轉座子非常相似。①Ac——可自主轉座的元件i）兩端各11bp的IR（invertedrepeat）。5’-CAGGGATGAAA-3’3’-GTCCCTACTTT-5’ii）中間有5個外顯子（exion）第八章遺傳重組-2兩個開放閱讀框（openreadingframe，ORF），和3個非編碼區(qū)（noncodingregion，Nc）。編碼轉座酶。轉座酶識別兩頭的IR序列。第八章遺傳重組-2②Ds家族——各種各樣的Ac缺失突變第一個Ds因子（Ds-a）幾乎就是Ac的大ORF缺失一段194bp后的結果。這就是Ds依賴Ac的原因。位于玉米第9號染色體的短臂，在色素基因（C）的附近。喪失了轉座能力第八章遺傳重組-2各種Ds與Ac的關系第八章遺傳重組-2第八章遺傳重組-2二、果蠅中的轉座子1.Copia1975年，DavidHogness和同事們在果蠅（Drosophilamelanogaster）中發(fā)現(xiàn)一類基因，能轉錄出大量的（copious）RNA。在基因組中達到30份拷貝。他們因此稱之為copia。有30個果蠅轉座子家族，占果蠅基因組的5%。（占中度重復序列的一半以上）。第八章遺傳重組-2果蠅染色體中的copia分布分散在基因組中第八章遺傳重組-2（1）copia的結構5000-8000bp長；①DTR兩端各有276bp的正向末端重復（directterminalrepeat,DTR)第八章遺傳重組-2②ITR在每個DTR內部各有一個17bp的反向末端重復（invertedterminalrepeat，ITR）DTR序列在其他生物的轉座子中也發(fā)現(xiàn)過，但并不普遍。ITR短序列是普遍存在的。③與逆轉錄病毒的同源性序列分析表明它與retroviralDNA同源?？赡苁莻€逆轉座子。第八章遺傳重組-217.6和Ty912是酵母的轉座子第八章遺傳重組-22.P因子（Pelement）果蠅雜交不育（hybriddysgenesis）：P型果蠅（paternalcontributing）與M型（maternalcontributing）雜交：P♂×M♀F1不育P♀×M♂F1可育F2（1）雜交實驗第八章遺傳重組-2第八章遺傳重組-2第八章遺傳重組-2（2）細胞學檢查P型雄果蠅的染色體上具有大量插入，插入序列稱為Pelement。M型雌果蠅的染色體上沒有Pelement。（3）Pelement的結構（所有的實驗室果蠅幾乎都是M型的）ORF0ORF1ORF2I1I2I3ORF3IRIR①4個開放閱讀框（ORF）②3個內含子（I）③兩端各一個反向重復（IR）第八章遺傳重組-2（4）Pelement的作用過程只在生殖細胞中實現(xiàn)轉座。在體細胞中雖然也轉錄，但轉錄出的產物沒有轉座酶活性?、俳M織特異性原因：轉錄后的剪切不同。i）體細胞中只有前兩個內含子被剪切。有一種蛋白結合在第三個內含子（內有終止密碼）上，抑制第三個內含子剪切。第八章遺傳重組-2翻譯產物是ORF0-ORF1-ORF2=66kDa蛋白質。這個66kDa蛋白的功能恰好是個抑制轉座的抑制物。（在P型雌果蠅的卵細胞質中大量存在，而且穩(wěn)定；M型雌果蠅中沒有）。ORF0ORF1ORF2I1I2I3ORF3IRIRORF0ORF1ORF2I3ORF3ORF0ORF1ORF2轉錄、剪切翻譯mRNA66kDa蛋白第八章遺傳重組-2ii）在生殖細胞中ORF0ORF1ORF2I1I2I3ORF3IRIRORF0ORF1ORF2ORF3ORF0ORF1ORF2轉錄、剪切翻譯mRNAORF3轉座酶沒有蛋白質抑制第三個內含子的剪切。87kDa轉座酶：使P因子轉座。導致不育。第八章遺傳重組-2②轉座離開原位，直接插入到其他位點。P♂×M♀F1不育P♀×M♂（P♂）F1可育F2卵細胞質有P，有66kD有P卵細胞質無P，無66kD轉座不轉座（66kD抑制P）無P、有P30多年前在野外捕到的黑腹果蠅都是M型，最近10年捕到的都是P型。第八章遺傳重組-2第八章遺傳重組-2三、反轉座子（retrotransposons）以RNA為中介，反轉錄成DNA后進行轉座的可移動元件。1.反轉座子的類型可分為兩類：（1）病毒型反轉座子（viralretrotransposons）（2）非病毒型轉座子（nonviralretrotransposons）所有的真核生物都有反轉座子。第八章遺傳重組-22.病