免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 課件匯 馬春玲 13 免疫組織化學(xué)技術(shù)-23 免疫學(xué)檢驗(yàn)的質(zhì)量控制

第十三章免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)又稱(chēng)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，是利用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）與組織細(xì)胞內(nèi)抗原（或抗體）進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)組織和細(xì)胞抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的免疫檢測(cè)方法。免疫組織化學(xué)技術(shù)概念免疫組織化學(xué)技術(shù)根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫組織化學(xué)技術(shù)可分為：酶免疫組織化學(xué)技術(shù)熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫金（銀）組織化學(xué)技術(shù)親和組織化學(xué)技術(shù)免疫標(biāo)記電鏡組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)的分類(lèi)免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本過(guò)程1、抗原的提取與純化2、免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體以及抗體的純化3、將標(biāo)記物與抗體結(jié)合形成標(biāo)記抗體4、標(biāo)本的處理與制備5、抗原抗體免疫學(xué)反應(yīng)以及標(biāo)記物呈色反應(yīng)6、觀察結(jié)果免疫組織化學(xué)技術(shù)第一節(jié)免疫組化技術(shù)基本知識(shí)免疫組織化學(xué)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)一、標(biāo)本制作（一）標(biāo)本的主要來(lái)源主要有：①活體組織②各種體液及穿刺液③培養(yǎng)細(xì)胞等

標(biāo)本制作是獲得良好的免疫細(xì)胞組織化學(xué)分析的保障，良好的細(xì)胞和組織學(xué)結(jié)構(gòu)將有助于抗原的準(zhǔn)確顯示和定位。第一節(jié)免疫組化技術(shù)基本知識(shí)（二）標(biāo)本的固定與保存

2．固定劑的選擇3．固定方法1．組織材料的固定目的

①浸泡法②灌注法適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究主要適用于活檢和手術(shù)標(biāo)本以及其它不能進(jìn)行灌注的組織固定。第一節(jié)免疫組化技術(shù)基本知識(shí)（三）玻片的處理玻片的處理是做好免疫組化染色的重要步驟之一一般用免疫組織化學(xué)的載玻片均需涂一定的黏合劑，常用的切片黏合劑有樹(shù)脂膠、多聚賴(lài)氨酸和防脫片劑第一節(jié)免疫組化技術(shù)基本知識(shí)（四）切片方法的選擇二、抗原處理片的處理（一）進(jìn)行抗原的暴露和修復(fù)的原因1.固定液的影響2.抗體制備的影響

（二）抗原的暴露

主要采用酶消化的方法在選擇酶消化時(shí)，應(yīng)針對(duì)要顯示的不同的抗原成分而選用不同的酶

在日常工作中用胰蛋白酶消化即可

第一節(jié)免疫組化技術(shù)基本知識(shí)二、抗原處理片的處理（三）熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)抗原修復(fù)是以高溫、高壓對(duì)常規(guī)固定石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)以提高抗原抗體的陽(yáng)性檢出率。壓力鍋法微波處理法水浴鍋法第一節(jié)免疫組化技術(shù)基本知識(shí)三、抗體處理抗體是免疫組織化學(xué)技術(shù)的首要試劑

（一）抗體的選擇（二）抗體的稀釋?zhuān)ㄈ┛贵w的合理保存高度特異性和穩(wěn)定性適當(dāng)?shù)谋壤３挚贵w的生物活性

第一節(jié)免疫組化技術(shù)基本知識(shí)四、常用標(biāo)記物（一）熒光素FITC、RB200（二）酶HRP（三）生物素-親和素系統(tǒng)（四）免疫金標(biāo)記技術(shù)（五）免疫鐵蛋白技術(shù)第一節(jié)免疫組化技術(shù)基本知識(shí)五、免疫組織化學(xué)技術(shù)的結(jié)果判斷（一）對(duì)照染色設(shè)計(jì)通常需針對(duì)第一抗體設(shè)立對(duì)照1.陽(yáng)性對(duì)照已知抗原陽(yáng)性的切片，免疫組化染色流程的有效性，排除假陰性2.陰性對(duì)照確證不含已知抗原的標(biāo)本，目的是排除假陽(yáng)性3.陰性試劑對(duì)照4.自身對(duì)照指用于證實(shí)在免疫組化染色中所用試劑（尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性）而設(shè)立的同步免疫染色對(duì)照，包括有：空白對(duì)照、替代對(duì)照、吸收試驗(yàn)和抑制試驗(yàn)等指在同一標(biāo)記切片上的自身組織成分的陰性背景對(duì)照。第一節(jié)免疫組化技術(shù)基本知識(shí)五、免疫組織化學(xué)技術(shù)的結(jié)果判斷陽(yáng)性細(xì)胞的顯色可位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核免疫顯色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞密度是定性、定量指標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞的著色形態(tài)（如胞膜型、胞核型、胞質(zhì)(漿)型等）及組織分布特點(diǎn)（如局灶型、彌漫型、片塊型等）主要是定位指標(biāo)哪怕只有少數(shù)細(xì)胞陽(yáng)性（只要是抗原所在部位）也應(yīng)視為陽(yáng)性表達(dá)（二）陽(yáng)性結(jié)果第一節(jié)免疫組化技術(shù)基本知識(shí)五、免疫組織化學(xué)技術(shù)的結(jié)果判斷（三）陰性結(jié)果

陰性結(jié)果不能簡(jiǎn)單視為抗原不表達(dá)，由于染色方法靈敏度有高低之分，有時(shí)可因靈敏度不夠，而導(dǎo)致陰性反應(yīng)。（四）特異性顯色和非特異性顯色的鑒別

1.分布位置

特異性反應(yīng)必須分布于特定抗原部位非特異性反應(yīng)無(wú)一定的分布規(guī)律

第一節(jié)免疫組化技術(shù)基本知識(shí)五、免疫組織化學(xué)技術(shù)的結(jié)果判斷2.顯色強(qiáng)度

特異性反應(yīng)由于細(xì)胞內(nèi)抗原含量不同，顯色強(qiáng)度不一。陽(yáng)性細(xì)胞的染色常定位于細(xì)胞，并與陰性細(xì)胞間有明顯間隔而非特異性染色常不限于單個(gè)細(xì)胞，常為成片的細(xì)胞3.其他

在過(guò)大的組織塊，中心固定不良也會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色

第一節(jié)免疫組化技術(shù)基本知識(shí)六、質(zhì)量控制質(zhì)量控制是免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)取得滿(mǎn)意結(jié)果的必要條件。（一）試劑質(zhì)量控制抗體的質(zhì)量是免疫組織化學(xué)染色成功的關(guān)鍵

（二）操作過(guò)程質(zhì)量控制

實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)本的質(zhì)量控制（三）儀器設(shè)備和器具的質(zhì)量控制第一節(jié)免疫組化技術(shù)基本知識(shí)第二節(jié)

熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)第二節(jié)熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)概述利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先用熒光素標(biāo)記已知抗體并以此作為探針，檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后，即會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，進(jìn)而對(duì)組織中的某種抗原進(jìn)行定性、定位和定量分析。第二節(jié)熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)一、標(biāo)本制作常見(jiàn)的臨床標(biāo)本材料主要有組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類(lèi)，按不同標(biāo)本性質(zhì)可制作涂片、印片或組織切片等。（一）載玻片和蓋玻片的處理載玻片和蓋玻片要厚薄均勻、潔凈及透光性好

一、標(biāo)本制作（二）制片1．組織切片組織材料可制備成冰凍切片或石蠟切片。

2．印片組織材料也可制成印片。3．涂片細(xì)胞或細(xì)菌要制成涂片，涂片應(yīng)薄且均勻。第二節(jié)熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)一、標(biāo)本制作（三）標(biāo)本的固定主要目的是：

1.防止細(xì)胞或切片從玻片上脫落

2.去除妨礙抗原抗體結(jié)合的類(lèi)脂

3.便于保存。除活細(xì)胞外，其他標(biāo)本應(yīng)在染色前以適當(dāng)?shù)姆绞焦潭ā?/p>

（四）標(biāo)本片的保存固定好的標(biāo)本片應(yīng)盡快熒光染色檢查，如需保存，置-20℃下低溫干燥保存。第二節(jié)熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)二、熒光抗體標(biāo)記及染色熒光抗體是熒光免疫技術(shù)的關(guān)鍵試劑，是將熒光素與特異性抗體通過(guò)共價(jià)鍵的方式結(jié)合而成。其制備過(guò)程通常包括抗體的標(biāo)記、純化和鑒定三步。在已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體，置于帶蓋的濕盒內(nèi)，37℃溫育30min。檢測(cè)不耐熱抗原以4℃過(guò)夜為宜。溫育后充分洗滌、干燥、鏡檢。第二節(jié)熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)第三節(jié)

酶免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)酶免疫組織化學(xué)概述

酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)是在一定條件下，應(yīng)用酶標(biāo)抗體（抗原）與組織或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原（抗體）發(fā)生反應(yīng)，然后加入酶的底物，催化底物顯色，借助光鏡或電鏡，就可識(shí)別出標(biāo)本中抗原（抗體）的分布和性質(zhì)；也可通過(guò)圖像分析技術(shù)達(dá)到定量的目的。第三節(jié)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)一、標(biāo)本制作常用的標(biāo)本有組織切片、組織印片和細(xì)胞涂片酶免組織化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)可分為酶標(biāo)記抗體免疫組織化學(xué)染色法非標(biāo)記抗體酶免疫組織化學(xué)染色法第三節(jié)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)二、酶標(biāo)記抗體的免疫組化染色法

（一）原理酶標(biāo)記抗體的免疫組織化學(xué)染色法是借助交聯(lián)劑的共價(jià)鍵作用將酶直接連接在抗體（或抗抗體）上，酶標(biāo)抗體（或抗抗體）與組織內(nèi)特異抗原或抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)后，通過(guò)酶對(duì)底物的催化作用，生成不溶性有色產(chǎn)物并沉淀在特定位置，達(dá)到對(duì)抗原定性、定位、定量檢測(cè)的目的。第三節(jié)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)二、酶標(biāo)記抗體的免疫組化染色法（二）技術(shù)類(lèi)型

1.直接法形成抗原一抗體一酶復(fù)合物2.間接法形成Ag-Ab1-Ab2﹡E復(fù)合物3.酶標(biāo)抗體三步染色法為間接法的改良法形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E復(fù)合物第三節(jié)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)二、酶標(biāo)記抗體的免疫組化染色法直接法間接法優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)便特異性強(qiáng)檢測(cè)敏感性高制備一種酶標(biāo)二抗可用于檢測(cè)多種抗原或抗體缺點(diǎn)敏感性低制備的抗體種類(lèi)有限特異性不如直接法操作較為繁瑣第三節(jié)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)三、非標(biāo)記抗體酶免疫組化染色法（一）原理該技術(shù)首先用酶免疫動(dòng)物，制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體（Ab3），將酶與Ab3結(jié)合形成復(fù)合物，然后利用第二抗體（Ab2）作橋，Ab2既可與Ab3的Fc段結(jié)合，又可與結(jié)合在組織抗原上的第一抗體（Ab1）的Fc段結(jié)合，經(jīng)酶催化底物的顯色反應(yīng)，達(dá)到對(duì)抗原的檢測(cè)。第三節(jié)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)三、非標(biāo)記抗體酶免疫組化染色法（二）技術(shù)類(lèi)型1.酶橋法用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）免疫動(dòng)物（如兔）制備抗HRP的抗體（Ab3），經(jīng)Ab2（如羊抗兔）作橋，將結(jié)合在組織抗原上的Ab1(兔抗相應(yīng)組織抗原的抗體)與Ab3連接起來(lái)，最后將HRP與Ab3結(jié)合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP復(fù)合物，加底物顯色第三節(jié)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)三、非標(biāo)記抗體酶免疫組化染色法第三節(jié)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)三、非標(biāo)記抗體酶免疫組化染色法2.PAP法即過(guò)氧化物酶（P）-抗過(guò)氧化物酶（AP）法，為酶橋法的改良，技術(shù)要點(diǎn)基本上與酶橋法相同，但該法將抗酶抗體（抗過(guò)氧化物酶（AP））與酶（過(guò)氧化物酶（P））制成了可溶性復(fù)合物（PAP）,該復(fù)合物由2個(gè)抗酶抗體和3個(gè)過(guò)氧化物酶分子組成，呈五角形，非常穩(wěn)定。通過(guò)橋抗體（Ab2）將特異性識(shí)別組織抗原的抗體（Ab1）與PAP復(fù)合物的抗酶抗體連接起來(lái)第三節(jié)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)三、非標(biāo)記抗體酶免疫組化染色法三、非標(biāo)記抗體酶免疫組化染色法3.雙橋PAP法

該法是PAP法的改良，通過(guò)兩次連接橋抗體和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP復(fù)合物，在抗原抗體復(fù)合物上結(jié)合了比PAP法更多的酶分子，大大增強(qiáng)了方法的敏感性。4.APAAP法

APAAP法就是以堿性磷酸酶代替HRP建立的堿性磷酸酶（AP）-抗堿性磷酸酶（AAP）法，簡(jiǎn)稱(chēng)APAAP法。技術(shù)要點(diǎn)與PAP法相似。第三節(jié)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)四、酶免疫組化染色中的常用酶及顯色底物酶底物顏色辣根過(guò)氧化物酶（HRP）二氨基聯(lián)苯胺（DAB）棕色氨基乙基卡巴唑（AEC）橘紅色4-氯-1-萘酚灰藍(lán)色堿性磷酸酶（ALP）α-萘酚磷酸鹽+快藍(lán)深藍(lán)色α-萘酚磷酸鹽+快紅紅色溴氯羥吲哚磷酸鹽（BCIP）+氮藍(lán)四唑（NBT）紫藍(lán)色第三節(jié)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)第四節(jié)

親和組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)親和組織化學(xué)技術(shù)概述親和組織化學(xué)是利用兩種物質(zhì)之間的高度親和力而建立的一種方法。一些具有雙價(jià)或多價(jià)結(jié)合力的物質(zhì)如生物素、葡萄球菌A蛋白、植物血凝素等，對(duì)某種組織成分具有高度親和力，可與蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、熒光素和酶等多種類(lèi)型的大小分子結(jié)合形成相應(yīng)復(fù)合物，采用熒光顯微鏡、酶加底物的顯色反應(yīng)等技術(shù)，在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平進(jìn)行對(duì)應(yīng)親和物質(zhì)的定位、定性或定量分析。用于親和組織化學(xué)的物質(zhì)有生物素與親和素、植物凝集素與糖類(lèi)、SPA與IgG、鏈霉親和素與生物素等。第四節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)一、生物素-親和素法生物素可與蛋白質(zhì)、糖類(lèi)和酶等多種類(lèi)型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素也稱(chēng)抗生物素，每個(gè)親和素分子有生物素結(jié)合的4個(gè)位點(diǎn)，二者可牢固結(jié)合成不可逆的復(fù)合物。第四節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)一、生物素-親和素法常用的技術(shù)類(lèi)型有：1.標(biāo)記親和素-生物素法（LAB法）將親和素與標(biāo)記物（HRP）結(jié)合，一個(gè)親合素可結(jié)合多個(gè)HRP；將生物素與抗體（一抗與二抗）結(jié)合，一個(gè)抗體分子可連接多個(gè)生物素分子，抗體的活性不受影響。細(xì)胞的抗原（或通過(guò)一抗）先與生物素化的抗體結(jié)合，繼而將標(biāo)記親和素結(jié)合在抗體的生物素上，如此多層放大，提高了檢測(cè)抗原的敏感性。第四節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)第四節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)一、生物素-親和素法一、生物素-親和素法2.橋聯(lián)親和素-生物素法（BAB法）先使抗原與生物素化的抗體結(jié)合，再以游離親和素將生物素化的抗體與酶標(biāo)生物素搭橋連接，也達(dá)到多層放大效果。第四節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)一、生物素-親和素法第四節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)一、生物素-親和素法3.ABC法此法是前兩種方法的改進(jìn)，即先按一定比例將親和素與酶標(biāo)生物素結(jié)合在一起，形成親和素-生物素-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC復(fù)合物），當(dāng)其與檢測(cè)反應(yīng)體系中的生物素化抗體或生物素化第二抗體相遇時(shí)，ABC中未飽和的親和素結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合，最終形成晶格樣結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，其中網(wǎng)絡(luò)了大量酶分子，加底物顯色，可大大提高檢測(cè)抗原的靈敏度。

第四節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)一、生物素-親和素法第四節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)二、SPA法SPA具有和人及許多動(dòng)物如豚鼠、豬、小鼠、猴等的IgGFc結(jié)合的能力，這種結(jié)合不會(huì)影響抗體的活性。每個(gè)SPA分子可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)IgG分子，也可一方面同IgG相結(jié)合，一方面與標(biāo)記物如熒光素、過(guò)氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等相結(jié)合。第四節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)二、SPA法第四節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)三、鏈霉親和素—生物素技術(shù)鏈霉親和素與生物素的結(jié)合是已知自然界中最強(qiáng)的非共價(jià)相互作用之一，其功能類(lèi)似親和素。利用生物素結(jié)合的二抗與酶標(biāo)記的鏈霉親和素蛋白就組成酶標(biāo)鏈霉親和素-生物素方法（LSAB）。

LSAB法的特點(diǎn):①特異性強(qiáng)；②分子量小，穿透力強(qiáng)，放大效應(yīng)遠(yuǎn)超ABC法，故其敏感性更強(qiáng)；③等電點(diǎn)中性更適合組織，可明顯減少非特異性染色，低背景著色使特異性著色更清晰；④操作時(shí)間縮短，更簡(jiǎn)便。第四節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)三、鏈霉親和素—生物素技術(shù)第四節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)第四節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)四、凝集素法一種凝集素具有專(zhuān)一性結(jié)合某種特異性糖基的能力，同時(shí)所有生物膜都含有一定量的糖類(lèi)，后者主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。因此，凝集素可作為一種探針來(lái)研究細(xì)胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結(jié)合，從而在光鏡或電鏡水平顯示其結(jié)合部位。第四節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)四、凝集素法一般認(rèn)為細(xì)胞膜上特定的糖基可用以區(qū)別細(xì)胞的類(lèi)型并反映細(xì)胞在分化、成熟和細(xì)胞病變中的變化。標(biāo)記了相應(yīng)示蹤物的凝集素可用來(lái)：①作為細(xì)胞分化和成熟的標(biāo)記②作為細(xì)胞特殊類(lèi)型的標(biāo)記③腫瘤細(xì)胞伴有細(xì)胞膜的改變，細(xì)胞膜上的糖基也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化，也可用凝集素檢測(cè)出腫瘤細(xì)胞。四、凝集素法常用下列染色法：①直接法—標(biāo)記物直接標(biāo)記凝集素，使之直接與切片中的相應(yīng)糖蛋白或糖脂相結(jié)合②間接法—將凝集素直接與切片中的相應(yīng)糖基結(jié)合，而將標(biāo)記物結(jié)合在抗凝集素抗體上③糖—凝集素—糖法—利用過(guò)量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結(jié)合，經(jīng)沖洗后，凝集素上還存在未被占用的結(jié)合部位，未結(jié)合部位與有過(guò)氧化物酶標(biāo)記的特異性糖基相結(jié)合，形成一個(gè)“三明治樣”的糖—凝集素—糖結(jié)合物。第四節(jié)親和組織化學(xué)技術(shù)第五節(jié)

免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)一、金免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性沒(méi)有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如SPA)等作為探針，能對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位或定量研究。一、金免疫組織化學(xué)技術(shù)（一）免疫金（銀）光鏡染色技術(shù)基本原理是通過(guò)免疫反應(yīng)沉積在抗原位置的膠體金顆粒起著一種催化劑作用，用對(duì)苯二酚還原劑將銀離子(Ag＋)還原成銀原子(Ag)，被還原的銀原子圍繞金顆粒形成一個(gè)“銀殼”，“銀殼”一旦形成，本身亦具有催化作用，從而使更多銀離子還原并促使“銀殼”不斷變大，最終使抗原位置得到更清楚的放大，在光鏡下就可觀察到被放大的抗原位置呈現(xiàn)黑色或黑褐色。

第五節(jié)免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)一、金免疫組織化學(xué)技術(shù)第五節(jié)免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)一、金免疫組織化學(xué)技術(shù)（二）免疫金電鏡染色技術(shù)

膠體金與鎳網(wǎng)上待檢標(biāo)本的相應(yīng)蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合，由于膠體金具有高電子密度，故金標(biāo)蛋白結(jié)合處，電鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，從而可對(duì)細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性與定位分析。第五節(jié)免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)二、金酶標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)

酶標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)是用酶標(biāo)抗體與組織或細(xì)胞抗原發(fā)生特異性結(jié)合后，加酶底物顯色，在電鏡下觀察顯色反應(yīng)的強(qiáng)度。它是將電鏡的高分辨力與酶免疫技術(shù)的特異性結(jié)合，在亞細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對(duì)抗原物質(zhì)進(jìn)行定性分析的一種高度精確、靈敏的方法。

第五節(jié)免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)三、免疫膠體鐵細(xì)胞組織化學(xué)技術(shù)

膠體鐵是一種陽(yáng)離子膠體，將抗體分子標(biāo)記上膠體鐵，通過(guò)普魯藍(lán)反應(yīng)呈色，膠體鐵顆粒有一定大小和電子密度，可用在電鏡和光鏡水平的抗原（抗體）的定位研究。第五節(jié)免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)第六節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)一、免疫組織化學(xué)技術(shù)的臨床應(yīng)用（一）熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用：1.在自身免疫性疾病中的應(yīng)用2.細(xì)菌和病毒的快速鑒定3.寄生蟲(chóng)的檢測(cè)與研究（二）酶免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用：1.提高病理診斷準(zhǔn)確性2.癌基因蛋白的臨床應(yīng)用3.對(duì)腫瘤細(xì)胞增生程度的評(píng)價(jià)4.發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶5.在腫瘤分期上的意義6.指導(dǎo)腫瘤的治療第六節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用二、免疫組織化學(xué)技術(shù)的拓展（一）熒光激活細(xì)胞分類(lèi)儀（FACS）（二）共聚焦顯微鏡技術(shù)（三）免疫組織化學(xué)—顯微切割技術(shù)第六節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用第十四章

免疫細(xì)胞及其功能檢驗(yàn)技術(shù)免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)免疫細(xì)胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等。通過(guò)分離、純化免疫細(xì)胞及其亞群，并對(duì)其數(shù)量和功能測(cè)定，可以判斷機(jī)體免疫功能狀態(tài)，對(duì)指導(dǎo)臨床實(shí)踐和科學(xué)研究具有重要意義。前言第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離與純化免疫細(xì)胞的分離方法很多，主要根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志、理化性狀和細(xì)胞功能等特征。應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⑺蛛x的目的細(xì)胞群種類(lèi)、數(shù)量和純度等要求選擇分離方法。所用的方法應(yīng)力求操作簡(jiǎn)便、盡量保持細(xì)胞活性兼顧細(xì)胞純度和獲得率。一、白細(xì)胞的分離加抗凝血于試管中室溫或37℃中靜置（30-60min）分層結(jié)果示意圖（一）自然沉降法（二）高分子聚合物沉降法抗凝血與等量3%明膠或6%右旋糖酐溶液混勻室溫或37℃中靜置（30～60min）分層結(jié)果與自然沉降法類(lèi)似優(yōu)點(diǎn)：速度快、得率高不足：白細(xì)胞黏性增加二、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離外周血單個(gè)核細(xì)胞主要是指淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。PBMC是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的細(xì)胞群PBMC也是T、B細(xì)胞分離純化的細(xì)胞來(lái)源。細(xì)胞種類(lèi)密度紅細(xì)胞1.093白細(xì)胞1.092淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞1.075~1.090血小板1.030~1.035人外周血中各類(lèi)血細(xì)胞密度常用的分離液：Ficoll液和Percoll液尤以密度為1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分層液（Ficoll液）最常用。（一）Ficoll分離法注意：溫度以20℃最適宜，超過(guò)25℃影響細(xì)胞得率（二）Percoll分層液法連續(xù)密度梯度分離液（Percoll液+PBS，離心）加入PBMC懸液或抗凝全血1000×g離心20min結(jié)果示意圖三、淋巴細(xì)胞的純化及亞群的分離采用Ficoll和Percoll分離法獲得的細(xì)胞懸液成分仍然較為復(fù)雜、均一性不佳。通常需要進(jìn)一步分離純化淋巴細(xì)胞及其亞群。分離原理主要基于細(xì)胞的表面標(biāo)志和功能等性質(zhì)。淋巴細(xì)胞及其亞類(lèi)的分離純化是免疫學(xué)檢驗(yàn)與研究的重要基礎(chǔ)技術(shù)。（一）淋巴細(xì)胞的純化去除紅細(xì)胞：低滲裂解法、氯化銨裂解法。去除血小板：多次洗滌離心法、胎牛血清梯度離心法。去除單核細(xì)胞：黏附法、羧基鐵吞噬法、苯丙氨酸甲酯去除法（二）淋巴細(xì)胞的分離E花環(huán)沉降法該法簡(jiǎn)便易行，主要用于T細(xì)胞的分離PBMC懸液與SRBC混合Ficoll法密度梯度離心收集管底細(xì)胞并低滲裂解（二）淋巴細(xì)胞的分離尼龍棉分離法該法簡(jiǎn)單快速，可分離T細(xì)胞和B細(xì)胞PBMC懸液加入尼龍棉柱37℃中靜置1～2小時(shí)預(yù)熱的含小牛血清培養(yǎng)液洗脫獲得T細(xì)胞冷培養(yǎng)液邊沖洗邊擠壓獲得B細(xì)胞（二）淋巴細(xì)胞的分離免疫磁珠分離法（二）淋巴細(xì)胞的分離流式細(xì)胞術(shù)分離法該法快速、細(xì)胞純度和獲得率高，可分離各種淋巴細(xì)胞及其亞群。四、吞噬細(xì)胞的分離吞噬細(xì)胞包括兩類(lèi)：一類(lèi)是大吞噬細(xì)胞即單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（包括血液中的單核細(xì)胞以及組織器官中的巨噬細(xì)胞）；另一類(lèi)是小吞噬細(xì)胞，即中性粒細(xì)胞。分離原理：主要根據(jù)其表面標(biāo)志和生物學(xué)特性。（一）單核細(xì)胞的分離Percoll密度梯度分離法流式細(xì)胞術(shù)分離法（常用方法）免疫磁珠分離法：分選CD14+細(xì)胞（常用方法）黏附法黏附法會(huì)影響單核細(xì)胞的功能，僅適用于去除單核細(xì)胞。（二）巨噬細(xì)胞的分離斑蝥敷貼法：（用于分離人巨噬細(xì)胞）

操作要點(diǎn)：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的濾紙?zhí)笤谇氨蹆?nèi)側(cè)皮膚，4~5小時(shí)后見(jiàn)皮膚局部充血，48小時(shí)后出現(xiàn)水泡，吸取滲出液（主要為巨噬細(xì)胞）、離心洗滌。腹腔滲出液分離法：（用于分離動(dòng)物巨噬細(xì)胞）

操作要點(diǎn)：少量液體石蠟注入動(dòng)物腹腔內(nèi)，3~4天后沖洗出腹腔滲出液（70%~80%為巨噬細(xì)胞）。（三）中性粒細(xì)胞的分離右旋糖酐沉降法：

操作要點(diǎn)：抗凝靜脈血與6%右旋糖酐溶液按比例混合，室溫條件垂直靜置一定時(shí)間后，紅細(xì)胞在右旋糖酐作用下凝集成串而快速沉降，白細(xì)胞沉降速度慢位于上層，獲取上層細(xì)胞。第二節(jié)淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能檢測(cè)許多疾病或生物及其他理化因素均可引起淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能變化。數(shù)量檢測(cè)：根據(jù)淋巴細(xì)胞及其亞群的表面標(biāo)志。功能測(cè)定：包括體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)。一、T細(xì)胞數(shù)量及功能檢測(cè)（一）T細(xì)胞的數(shù)量檢測(cè)根據(jù)T細(xì)胞表面CD分子檢測(cè)：（1）間接熒光免疫法（2）免疫組織化學(xué)法：①酶標(biāo)（ABC法、APAAP法）②金標(biāo)法（即IGSS法）（二）T細(xì)胞功能檢測(cè)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)：形態(tài)學(xué)法、3H-TdR摻入法、MTT法CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)：51Cr釋放法抗原特異性T細(xì)胞定量檢測(cè)：MHC-抗原肽四聚體技術(shù)淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)：流式細(xì)胞術(shù)體內(nèi)試驗(yàn)：結(jié)核菌素試驗(yàn)、PHA皮膚試驗(yàn)PBMCPHA5％CO2、

37℃培養(yǎng)72h細(xì)胞涂片染色顯微鏡檢查該法簡(jiǎn)便易行、容易在基層推廣，但主觀因素影響大。形態(tài)學(xué)法T細(xì)胞增殖試驗(yàn)未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（％）＝轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)的淋巴細(xì)胞總數(shù)X100％培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞抗凝全血分離液離心過(guò)濾測(cè)量放射性3H-TdR摻入法靈敏度高客觀性好原理：外周血T細(xì)胞

PHA發(fā)生增殖

MTT含藍(lán)色甲顆粒的T細(xì)胞

MTT

PHA有機(jī)溶劑測(cè)吸光度（A）值

計(jì)算SI判定細(xì)胞增殖結(jié)果(SI≧2具有意義)MTT法操作簡(jiǎn)便無(wú)放射污染51Cr釋放法淋巴細(xì)胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞破壞51Cr釋放測(cè)定γ射線CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理:用刺激劑體外激活淋巴細(xì)胞，用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑如莫能霉素阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方式被打亂，引起細(xì)胞因子向高爾基體積聚，用流式細(xì)胞儀測(cè)定淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子種類(lèi)，確定Th1/Th2細(xì)胞的百分率。分泌的細(xì)胞因子ThlTh2

IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++Thl和Th2分泌的細(xì)胞因子二、B細(xì)胞數(shù)量及功能檢測(cè)（一）B細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)根據(jù)B細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)：（1）mIg的檢測(cè)：免疫熒光、免疫組化（2）

CD分子的檢測(cè)：檢測(cè)CD19、CD20、CD21、CD22、

CD29以及CD5等（3）小鼠紅細(xì)胞受體的檢測(cè)：花環(huán)試驗(yàn)（二）B細(xì)胞功能檢測(cè)B細(xì)胞增殖試驗(yàn)：3H-TdR摻入法、MTT法（刺激物：小鼠用LPS；人用SPA的金黃色葡萄球菌菌體或抗IgM抗體）B細(xì)胞抗體產(chǎn)生能力檢測(cè)：溶血空斑試驗(yàn)、ELISPOT經(jīng)典溶血空斑試驗(yàn)1.SRBC致敏的B細(xì)胞與SRBC在凝膠介質(zhì)中混勻；2.抗體形成細(xì)胞(Antibodyformingcell,AFC)周?chē)腟RBC與AFC產(chǎn)生的抗體結(jié)合而被致敏；3.加入豚鼠新鮮補(bǔ)體，致敏SRBC激活補(bǔ)體而溶解，在AFC周?chē)霈F(xiàn)肉眼可見(jiàn)的溶血空斑；4.計(jì)算溶血空斑的數(shù)目。溶血空斑試驗(yàn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)抗體產(chǎn)生B細(xì)胞抗原包被酶聯(lián)抗抗體凝膠底物顯色可在單細(xì)胞水平上檢測(cè)B產(chǎn)生抗體和T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子三、NK細(xì)胞數(shù)量及功能檢測(cè)（一）NK細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)根據(jù)NK細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)：

CD分子的檢測(cè)：檢測(cè)CD3、CD56、CD16等（CD3-CD56+CD16+）

（二）NK細(xì)胞功能檢測(cè)形態(tài)學(xué)法酶釋法：LDH釋放法熒光法：時(shí)間分辨熒光免疫分析法放射性核素釋放法：51Cr釋放法、125I-UdR釋放法流式細(xì)胞術(shù)：PI染色NK靶細(xì)胞檢測(cè)熒光強(qiáng)度、cpm等K562細(xì)胞為人NK細(xì)胞殺傷功能檢測(cè)的常用靶細(xì)胞第三節(jié)吞噬細(xì)胞功能檢測(cè)一、中性粒細(xì)胞功能檢測(cè)趨化功能檢測(cè)：體內(nèi)法（也稱(chēng)皮膚窗口法）體外法（濾膜滲透法/

Boyden小室法、瓊脂糖平板法）吞噬功能檢測(cè)：（吞噬金黃色葡萄球菌或白色念珠菌）殺傷功能檢測(cè)：

溶菌法、硝基藍(lán)四氮唑（NBT）還原試驗(yàn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)法--皮膚窗口法在受檢者前臂屈側(cè)中央3㎜范圍內(nèi)，搔刮皮膚后，用蓋玻片壓緊固定，在第2，5，8，12，24，36小時(shí)各取樣一次，染色觀察中性粒細(xì)胞聚集開(kāi)始時(shí)間、聚集程度等。健康正常人一般2～3小時(shí)后開(kāi)始聚集，達(dá)50～100個(gè)，6小時(shí)可達(dá)1000個(gè)以上。（一）中性粒細(xì)胞趨化功能檢測(cè)體外法--Boyden小室法Boyden小室體外法--瓊脂糖平板法原理及技術(shù)要點(diǎn)

在瓊脂糖凝膠平板的中孔加白細(xì)胞懸液，左孔加趨化因子，右孔加對(duì)照液，溫育4～8小時(shí)后，用顯微鏡測(cè)微器測(cè)定中性粒細(xì)胞向左孔的移動(dòng)距離A和向右孔的移動(dòng)距離B，計(jì)算趨化指數(shù)。趨化指數(shù)越大運(yùn)動(dòng)能力越強(qiáng)將細(xì)胞懸液與金黃色葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合，溫育后涂片、固定和染色。在油鏡下觀察中性粒細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬情況，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中吞噬和未吞噬細(xì)菌的中性粒細(xì)胞數(shù)，并記錄吞噬的細(xì)菌數(shù)。（二）中性粒細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)（三）中性粒細(xì)胞殺傷功能檢測(cè)硝基藍(lán)四氮唑（NBT）還原試驗(yàn)

方法：1.抗凝血+硝基藍(lán)四氮唑（NBT），溫育25min；2.推片染色、鏡檢（含甲臜顆粒的中性粒細(xì)胞）。正常值：NBT陽(yáng)性細(xì)胞率應(yīng)7%~15%二、巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)炭粒廓清試驗(yàn)：主要用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)吞噬功能檢測(cè)：（吞噬雞紅細(xì)胞或白假絲酵母等）促凝血活性測(cè)定：正常小鼠肝中庫(kù)普弗細(xì)胞可吞噬清除90％炭粒，脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除10％炭粒。據(jù)此給小鼠靜脈注射定量印度墨汁（炭粒懸液），間隔一定時(shí)間反復(fù)取靜脈血，測(cè)定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。主要用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（一）炭粒廓清試驗(yàn)（二）巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)巨噬細(xì)胞雞紅細(xì)胞或白假絲酵母＋孵育涂片染色鏡檢計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)謝謝！第十五章流式細(xì)胞術(shù)免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)概念以流式細(xì)胞儀作為檢測(cè)工具的高科學(xué)技術(shù)，借助單克隆抗體技術(shù)和熒光染料標(biāo)記技術(shù)，對(duì)懸液中的單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行高速、逐一的細(xì)胞定量分析和分選。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)原理免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)原理流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀有四個(gè)主要構(gòu)成系統(tǒng)：液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、電子系統(tǒng)、分選系統(tǒng)。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)原理流式細(xì)胞儀的基本機(jī)構(gòu)流式細(xì)胞儀有四個(gè)主要構(gòu)成系統(tǒng)：液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、電子系統(tǒng)、分選系統(tǒng)。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)原理液流系統(tǒng)由流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)構(gòu)成，是流式細(xì)胞儀的核心元件。流動(dòng)室由樣品管、鞘液和噴嘴等組成，分析時(shí)，鞘液包裹著細(xì)胞樣品在氣體正壓的驅(qū)動(dòng)下一同進(jìn)入細(xì)胞流動(dòng)室。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)原理光學(xué)系統(tǒng)流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)由激光光源、分色反光鏡、光速形成器、透鏡組和光電倍增管組成。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)原理數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)由計(jì)算機(jī)及相應(yīng)的軟件組成，是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析、存儲(chǔ)、顯示的重要組件。流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)參數(shù)主要包括前向散射光、側(cè)向散射光和熒光。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)原理前向散射光（forwardscatter，F(xiàn)S）激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小的角度（0.5°-10°）向前方散射的訊號(hào)。FS由位于激光束正前方的檢測(cè)器收集，其強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)。對(duì)于同一細(xì)胞群體，F(xiàn)S信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小呈正比。因此，F(xiàn)S主要用于檢測(cè)細(xì)胞或其他顆粒的表面屬性。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)原理側(cè)向散射光（sidescatter，SS）激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以90°散射的信號(hào)。由位于激光束90o方向的檢測(cè)器所收集，其信號(hào)主要由細(xì)胞內(nèi)部的顆粒性成分對(duì)光發(fā)生折射而產(chǎn)生，反映細(xì)胞或顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度、表面的光滑程度。SS信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)呈正比。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)原理細(xì)胞分析的原理將待測(cè)樣本制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染色后，在氣體壓力推動(dòng)下進(jìn)入流動(dòng)室。在流動(dòng)室內(nèi)被鞘液包繞形成單列細(xì)胞液柱，與水平方向的激光光束垂直相交。待測(cè)細(xì)胞在鞘液的包裹下單行排列，依次經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)區(qū)，被熒光染料染色的細(xì)胞受到激光照射后發(fā)出熒光，同時(shí)，混合細(xì)胞群根據(jù)細(xì)胞大小和細(xì)胞內(nèi)顆粒的多少會(huì)被激發(fā)而產(chǎn)生不同的散射光。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)原理細(xì)胞分選的原理當(dāng)單細(xì)胞懸液形成液柱通過(guò)流動(dòng)室時(shí)，液柱被分隔成一連串均勻的液滴，當(dāng)含有滿(mǎn)足設(shè)定分選條件細(xì)胞的液滴通過(guò)檢測(cè)區(qū)時(shí)，脈沖發(fā)生器產(chǎn)生充電脈沖，使被選定的細(xì)胞液滴帶有特定的電荷，而未被選定細(xì)胞形成的液滴及不含細(xì)胞的空白液滴不被充電而不帶有電荷。帶電細(xì)胞液滴通過(guò)靜電場(chǎng)而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中，其他液體則被當(dāng)作廢液抽吸掉，完成細(xì)胞分選的目的。流式細(xì)胞術(shù)的技術(shù)特點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)的技術(shù)特點(diǎn)①測(cè)量速度快。②多參數(shù)分析。③靈敏度高。④精度高，分辨率高。⑤分選細(xì)胞的純度可達(dá)到99%以上。⑥保持細(xì)胞、細(xì)胞器和微粒結(jié)構(gòu)及功能不被破壞。流式細(xì)胞術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)FCM單細(xì)胞樣本的制備樣品類(lèi)型外周血和骨髓標(biāo)本培養(yǎng)細(xì)胞新鮮實(shí)體組織石蠟包埋組織脫落細(xì)胞FCM樣本的熒光染色最常用的染料異硫氰基熒光素和藻紅蛋白碘化丙啶藻紅蛋白-得克薩斯紅羅丹明FCM樣本的熒光染色免疫熒光染色直接免疫熒光染色間接免疫熒光染色FCM的檢測(cè)分析方法免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)FCM的檢測(cè)分析方法單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖是一維數(shù)據(jù)中常用的圖形，可用于定性、定量資料的分析，反映相同熒光或散射光強(qiáng)度的顆粒的相對(duì)數(shù)量。單參數(shù)直方圖僅表示一個(gè)測(cè)量參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量之間的分布關(guān)系，不能顯示兩個(gè)獨(dú)立的參數(shù)與細(xì)胞之間的關(guān)系。FCM的檢測(cè)分析方法雙參數(shù)散點(diǎn)圖雙參數(shù)散點(diǎn)圖是一種細(xì)胞數(shù)與雙測(cè)量參數(shù)的圖形，X軸和Y軸分別代表與細(xì)胞有關(guān)的兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)，根據(jù)這兩種參數(shù)就可以確定細(xì)胞在雙參數(shù)圖上的表達(dá)位置。FCM的檢測(cè)分析方法三參數(shù)直方圖三參數(shù)直方圖的三維坐標(biāo)均為參數(shù)（散射光或熒光）而非細(xì)胞數(shù)。任意在如FSC、SSC、FL1、FL2、FL3或FL4等參數(shù)中選擇3個(gè)參數(shù)為X、Y、Z軸，構(gòu)成一個(gè)三維圖。在三維空間中每一群細(xì)胞各處于獨(dú)立的空間位置，因此對(duì)復(fù)雜的細(xì)胞亞群觀察更為直觀、準(zhǔn)確，但對(duì)其數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析較難。FCM的檢測(cè)分析方法多參數(shù)綜合分析多參數(shù)數(shù)據(jù)可每?jī)蓚€(gè)數(shù)據(jù)組成一對(duì)，用直方圖、散點(diǎn)圖、等高圖或假三維圖等進(jìn)行分析。門(mén)（gate）和區(qū)域（region）的設(shè)置是多參數(shù)分析的基礎(chǔ)。通過(guò)多參數(shù)分析能夠同時(shí)比較各種細(xì)胞的不同抗原表達(dá)水平，可以統(tǒng)計(jì)各種細(xì)胞群體的數(shù)量或百分比以及平均熒光強(qiáng)度等，分析細(xì)胞的多種生物學(xué)特性。FCM的臨床應(yīng)用免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)FCM的臨床應(yīng)用淋巴細(xì)胞及其亞群的分離淋巴細(xì)胞亞群分析淋巴細(xì)胞功能分析FCM的臨床應(yīng)用白血病免疫表型分析是研究白血病分化抗原和白血病分類(lèi)診斷的重要手段，即利用單克隆抗體（McAb）檢測(cè)白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿抗原，分析其表現(xiàn)型，以了解白血病細(xì)胞的分類(lèi)和分期。FCM的臨床應(yīng)用艾滋病的診斷與治療流式細(xì)胞術(shù)是AIDS免疫功能檢測(cè)的重要手段，它可以實(shí)現(xiàn)CD4+T淋巴細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)，對(duì)于HIV感染的人群定期監(jiān)測(cè)CD4+T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)可以了解他們的免疫狀態(tài)，已成為臨床上診斷AIDS和進(jìn)行療效評(píng)估不可或缺的重要指標(biāo)。FCM的臨床應(yīng)用免疫性血液病診斷陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥免疫性血小板疾病和中性粒細(xì)胞減少癥FCM的臨床應(yīng)用自身免疫性疾病與HLA表型分析自身免疫性疾病與某些類(lèi)型的人類(lèi)白細(xì)胞抗原（Humanleukocyteantigen,HLA）異常表達(dá)有關(guān)。如強(qiáng)直性脊柱炎，其外周的HLA-B27的表達(dá)程度與疾病的發(fā)生有很高的相關(guān)性。用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定淋巴細(xì)胞表面HLA-B27的表達(dá)，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。FCM的臨床應(yīng)用臨床腫瘤學(xué)與移植免疫中的應(yīng)用FCM可進(jìn)行細(xì)胞周期分析、定量分析檢測(cè)細(xì)胞增殖標(biāo)志物、細(xì)胞表面標(biāo)志、癌基因蛋白產(chǎn)物、耐藥蛋白、細(xì)胞凋亡，從而獲得組織形態(tài)學(xué)方法難以得到的信息，可為腫瘤的臨床診斷、治療和預(yù)防提供幫助。HLA組織配型，流式細(xì)胞交叉配型技術(shù)較傳統(tǒng)應(yīng)用的補(bǔ)體依賴(lài)淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)更加敏感、特異，且操作簡(jiǎn)便。謝謝！第十六章感染性疾病的免疫學(xué)檢驗(yàn)免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)感染性疾病感染性疾病概念感染性疾病（Infectiousdiseases）指致病微生物引起炎癥或器官功能障礙的癥狀。當(dāng)病原微生物作為抗原入侵機(jī)體，在導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生感染的同時(shí)，亦可誘導(dǎo)機(jī)體建立對(duì)微生物感染的免疫，以維持機(jī)體生理功能的平衡與穩(wěn)定。固有免疫免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答分類(lèi)根據(jù)免疫應(yīng)答識(shí)別的特點(diǎn)、獲得形式以及效應(yīng)機(jī)制，可分為適應(yīng)性免疫（adaptiveimmunity）和固有免疫（innateimmunity）。固有免疫固有免疫概念固有免疫亦稱(chēng)天然免疫或非特異性免疫，是人類(lèi)在長(zhǎng)期的種系發(fā)育和進(jìn)化過(guò)程中，逐漸建立起來(lái)的一系列防御病原體等抗原的功能，構(gòu)成了機(jī)體抵御病原生物入侵的第一道防線。微課：固有免疫應(yīng)答的概念、組成、特點(diǎn)和機(jī)制固有免疫固有免疫的組成固有免疫的屏障結(jié)構(gòu)屏障結(jié)構(gòu)組成（1）物理屏障作用（2）化學(xué)屏障作用（3）生物學(xué)屏障作用

1、皮膚黏膜屏障固有免疫的屏障結(jié)構(gòu)屏障結(jié)構(gòu)組成功能：對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)作用

2、血腦屏障固有免疫的屏障結(jié)構(gòu)屏障結(jié)構(gòu)組成功能：保護(hù)胎兒免遭感染、使之正常發(fā)育

3、血胎屏障固有免疫的效應(yīng)細(xì)胞吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞主要包括中性粒細(xì)胞（neutrophil）和單核-巨噬細(xì)胞（mononuclearphagocyte）兩類(lèi)。

固有免疫的效應(yīng)細(xì)胞NK細(xì)胞NK細(xì)胞表面表達(dá)IgGFc受體，也可借助ADCC作用殺傷靶細(xì)胞。

固有免疫的效應(yīng)細(xì)胞γδT細(xì)胞可直接識(shí)別某些完整的多肽抗原，是皮膚黏膜局部參與早期抗感染免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，也具有非特異性殺瘤作用

固有免疫的效應(yīng)細(xì)胞B1細(xì)胞B1細(xì)胞主要分布于胸腔、腹腔和腸壁固有層中。在機(jī)體早期抗感染免疫和維持自穩(wěn)中具有重要作用。

固有免疫的效應(yīng)細(xì)胞肥大細(xì)胞可直接識(shí)別某些完整的多肽抗原，是皮膚黏膜局部參與早期抗感染免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，也具有非特異性殺瘤作用固有免疫的效應(yīng)分子1、補(bǔ)體（1）細(xì)胞溶解作用（2）趨化和促炎癥發(fā)生作用。在機(jī)體早期抗感染免疫中具有十分重要的意義固有免疫的效應(yīng)分子2、細(xì)胞因子病原體感染機(jī)體后，可刺激免疫細(xì)胞和感染的組織細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，引起炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用。固有免疫的效應(yīng)分子3、溶菌酶溶菌酶能夠裂解G+菌細(xì)胞壁中N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵，使細(xì)胞壁的重要組分肽聚糖破壞，從而導(dǎo)致細(xì)菌溶解、破壞。固有免疫的效應(yīng)分子4、乙型溶素乙型溶素可作用于G+菌細(xì)胞膜，產(chǎn)生非酶性破壞效應(yīng)，但對(duì)G-菌無(wú)效。固有免疫的效應(yīng)分子5、C-反應(yīng)蛋白CRP可以激活補(bǔ)體和加強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬而起調(diào)理作用，從而清除入侵機(jī)體的冰原微生物和損傷、壞死、凋亡的組織細(xì)胞，在機(jī)體的天然免疫過(guò)程中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。固有免疫的效應(yīng)分子固有免疫的應(yīng)答機(jī)制以吞噬細(xì)胞為例（1）接觸病原菌（2）吞入病原菌（3）殺死和破壞病原菌視頻：吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的過(guò)程固有免疫的應(yīng)答機(jī)制接觸病原菌巨噬細(xì)胞能表達(dá)多種模式識(shí)別受體（PAMP），參與對(duì)病原體的吞噬和殺傷作用。固有免疫的應(yīng)答機(jī)制吞入病原菌吞噬細(xì)胞與細(xì)菌接觸部位的細(xì)胞膜內(nèi)陷，伸出偽足將細(xì)菌攝入，形成由部分細(xì)胞膜包繞的吞噬體。固有免疫的應(yīng)答機(jī)制殺死和破壞病原菌1.氧依賴(lài)性途徑：該途徑主要效應(yīng)分子是反應(yīng)性氧中間物和反應(yīng)性氮中間物。固有免疫的應(yīng)答機(jī)制殺死和破壞病原菌2.氧非依賴(lài)途徑：指無(wú)需氧分子參與的殺菌作用。主要通過(guò)：酸性環(huán)境、溶菌酶、防御素。固有免疫的生物學(xué)意義生物學(xué)意義

（1）抗感染作用（2）抗腫瘤作用和移植排斥反應(yīng)（3）參與和促進(jìn)炎癥反應(yīng)作用（4）參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答人工抗感染免疫免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)抗感染免疫抗感染免疫概念抗感染免疫（anti-infectionimmunity）是機(jī)體對(duì)入侵病原體的防御性免疫，是機(jī)體抵御和清除病原微生物及其有害物質(zhì)的一種生理功能。人工主動(dòng)免疫人工主動(dòng)免疫概念人工主動(dòng)免疫（artificialactiveimmunization）是用人工方法給機(jī)體輸入抗原，如疫苗、類(lèi)毒素等，刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)免疫效應(yīng)的方法。人工主動(dòng)免疫人工主動(dòng)免疫制劑1、死疫苗（killedvaccine）又稱(chēng)滅活疫苗，是用理化方法將致病微生物殺死而制成的疫苗。只激發(fā)體液免疫；全身和局部不良反應(yīng)明顯；穩(wěn)定性好，易于保存。人工主動(dòng)免疫人工主動(dòng)免疫制劑2、活疫苗（livingvaccine）又稱(chēng)減毒疫苗，是通過(guò)自然篩選或人工誘變?yōu)槿醵净驘o(wú)毒的活微生物而制成的疫苗。產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫；一般只需接種一次，用量小，不良反應(yīng)輕，免疫效果持久；穩(wěn)定性差，不易保存。人工主動(dòng)免疫人工主動(dòng)免疫制劑3、類(lèi)毒素（toxoid）細(xì)菌的外毒素經(jīng)0.3%~0.4%甲醛處理后失去毒性，仍保留免疫原性的制劑成為類(lèi)毒素；接種后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗外毒素抗體，稱(chēng)為抗毒素。人工主動(dòng)免疫人工主動(dòng)免疫制劑4、新型疫苗（1）亞單位疫苗（subunitvaccine）（2）合成疫苗（conjugatevaccine）（3）基因工程疫苗（geneticallyengineeringvaccine）人工被動(dòng)免疫人工被動(dòng)免疫概念人工被動(dòng)免疫（artificialpassiveimmunization）是用人工方法給機(jī)體直接輸入抗體，使機(jī)體獲得相應(yīng)免疫力的方法。人工被動(dòng)免疫人工被動(dòng)免疫制劑1、抗毒素是用類(lèi)毒素多次注射給馬而產(chǎn)生的抗外毒素抗體，采集馬血清濃縮純化而制成?？苟舅刂饕糜谕舛舅厮录膊〉闹委熀途o急預(yù)防。人工被動(dòng)免疫人工被動(dòng)免疫制劑2、丙種球蛋白按制劑來(lái)源分為胎盤(pán)丙種球蛋白（取自健康產(chǎn)婦的胎盤(pán)血，主要含IgG類(lèi)抗體）和血漿丙種球蛋白（取自正常人血漿，主要含IgG、IgM等抗體）。人工被動(dòng)免疫人工被動(dòng)免疫制劑3、特異性免疫球蛋白如抗乙肝免疫球蛋白、抗狂犬免疫血清、抗蛇毒免疫血清等特異性免疫球蛋白，用于緊急預(yù)防和治療相應(yīng)的傳染病。計(jì)劃免疫計(jì)劃免疫概念計(jì)劃免疫（planedimmunization）是根據(jù)某些傳染病疫情監(jiān)測(cè)和人群免疫狀況分析，按照國(guó)家規(guī)定的免疫程序，將有關(guān)疫苗有計(jì)劃地對(duì)人群進(jìn)行接種，使人體獲得對(duì)這些傳染病的免疫力，從而達(dá)到控制、消滅相應(yīng)傳染病的目的。計(jì)劃免疫疫苗接種效果監(jiān)測(cè)檢測(cè)疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答評(píng)價(jià)主要是評(píng)價(jià)疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體反應(yīng)。檢測(cè)方法包括體內(nèi)檢測(cè)和體外檢測(cè)。體液免疫應(yīng)答監(jiān)測(cè)疫苗接種效果監(jiān)測(cè)細(xì)胞免疫應(yīng)答監(jiān)測(cè)疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答評(píng)價(jià)包括體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)，主要檢測(cè)T細(xì)胞活化情況。有關(guān)檢測(cè)抗體的感染診斷試驗(yàn)免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)不同病原體感染抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)鏈球菌感染的免疫檢測(cè)（ASO）鏈球菌溶血素“O”是A群鏈球菌的代謝產(chǎn)物之一，它是一種具有酶活性的蛋白質(zhì)。通過(guò)測(cè)定血清中ASO水平，有利于A群鏈球菌感染的診斷。過(guò)膠乳凝集試驗(yàn)測(cè)定血清中的ASO抗體效價(jià)。不同病原體感染抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)傷寒沙門(mén)菌感染的免疫檢測(cè)（肥達(dá)反應(yīng)）肥達(dá)反應(yīng)是檢查患者是否被傷寒或副傷寒桿菌感染的一種檢測(cè)方法，常用于傷寒、副傷寒的輔助診斷。肥達(dá)反應(yīng)是試管凝集反應(yīng)。不同病原體感染抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌感染的免疫檢測(cè)結(jié)核菌素試驗(yàn)是應(yīng)用結(jié)核菌素進(jìn)行皮膚試驗(yàn)來(lái)測(cè)定人體對(duì)結(jié)核桿菌是否有變態(tài)反應(yīng)的一種試驗(yàn)。結(jié)核菌素試驗(yàn)常采用芒圖（Mantoux）法。不同病原體感染抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)甲型肝炎病毒抗體的檢測(cè)甲型肝炎的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴(lài)對(duì)血清中特異性抗體的檢測(cè)。通常采用ELISA和化學(xué)發(fā)光技術(shù)對(duì)HAVIgG及IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)。不同病原體感染抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)乙型肝炎病毒抗體的檢測(cè)1.乙型肝炎病毒表面抗體（抗-HBs）是一種保護(hù)性抗體，是機(jī)體感染或接種乙肝疫苗的標(biāo)志。不同病原體感染抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)乙型肝炎病毒抗體的檢測(cè)2.乙型肝炎病毒e抗體（抗-HBe）多出現(xiàn)于急性肝炎恢復(fù)期的患者中，比抗-HBs轉(zhuǎn)陽(yáng)要早，常在HBsAg即將消失或已經(jīng)消失時(shí)檢出。不同病原體感染抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)乙型肝炎病毒抗體的檢測(cè)3.乙型肝炎病毒核心抗體（抗-HBcIgM和抗-HBcIgG）抗-HBcIgM是早期HBV感染的特異性血清學(xué)標(biāo)志，這對(duì)于急性乙肝診斷很有意義?？?HBcIgG出現(xiàn)較晚，不是保護(hù)性抗體，檢測(cè)抗-HBcIgG有流行病學(xué)調(diào)查意義。不同病原體感染抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)丙型肝炎病毒抗體的檢測(cè)丙型肝炎病毒感染的實(shí)驗(yàn)室檢查主要包括免疫學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)，針對(duì)特異性抗體HCVIgG和HCVIgM的免疫學(xué)檢測(cè)是臨床常用的診斷方法，常用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。不同病原體感染抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)梅毒螺旋體感染的免疫學(xué)檢測(cè)1.非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)：是用正常牛心肌的心磷脂（cardiolipin）作為抗原，檢測(cè)病人血清中的反應(yīng)素。不同病原體感染抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)梅毒螺旋體感染的免疫學(xué)檢測(cè)2.梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)：抗原為梅毒螺旋體，以檢測(cè)血清中的特異性抗體，該試驗(yàn)特異性高，目前常用的方法有梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）、梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。不同病原體感染抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)人獲得性免疫缺陷病毒感染的免疫檢測(cè)血清中HIV抗體是判斷HIV感染的間接指標(biāo)。根據(jù)其主要的適用范圍，可將現(xiàn)有HIV抗體檢測(cè)方法分為篩檢試驗(yàn)和確證試驗(yàn)。篩檢試驗(yàn)主要用ELISA方法、化學(xué)發(fā)光法和免疫層析方法；確證試驗(yàn)包括免疫印跡檢測(cè)法（WesternBlot，簡(jiǎn)稱(chēng)WB法）；放射免疫沉淀法（RIP）。不同病原體感染抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)TORCH檢測(cè)優(yōu)生四項(xiàng)（TORCH）指可導(dǎo)致先天性宮內(nèi)感染及圍生期感染的病原體，它是一組病原生物的英文名稱(chēng)縮寫(xiě)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗體IgG、IgM（TOX-IgG、TOX-IgM）和循環(huán)抗原。檢測(cè)抗體診斷感染的應(yīng)用評(píng)價(jià)ASO評(píng)價(jià)A群鏈球菌感染后1周，ASO即開(kāi)始升高，4~6周可達(dá)高峰，并能持續(xù)數(shù)月，當(dāng)感染減退時(shí)，ASO值下降并在6個(gè)月內(nèi)回到正常值，如果ASO值不下降，提示可能存在復(fù)發(fā)性感染或慢性感染。檢測(cè)抗體診斷感染的應(yīng)用評(píng)價(jià)肥達(dá)反應(yīng)評(píng)價(jià)機(jī)體感染傷寒、副傷寒桿菌后會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)抗體，即O抗體，H抗體，傷寒抗體常在病后一周左右出現(xiàn)，第3~4周陽(yáng)性率最高，并可持續(xù)數(shù)月。檢測(cè)抗體診斷感染的應(yīng)用評(píng)價(jià)結(jié)核菌素試驗(yàn)評(píng)價(jià)陽(yáng)性反應(yīng)表明機(jī)體對(duì)結(jié)核桿菌有變態(tài)反應(yīng)，過(guò)去曾感染過(guò)結(jié)核，但不表示患病，因接種過(guò)卡介苗的人也呈陽(yáng)性反應(yīng)。強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)則表明可能有活動(dòng)性感染，應(yīng)進(jìn)一步檢查是否有結(jié)核病。結(jié)核菌素試驗(yàn)可為接種卡介苗及測(cè)定免疫效果提供依據(jù)。檢測(cè)抗體診斷感染的應(yīng)用評(píng)價(jià)梅毒螺旋體的血清學(xué)試驗(yàn)評(píng)價(jià)采用密螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)，如ELISA和TPPA作為篩查試驗(yàn)。如懷疑一期梅毒，可進(jìn)行特異性梅毒螺旋體IgM血清學(xué)試驗(yàn)，如有必要，可在1~2周后重復(fù)檢測(cè)。檢測(cè)抗體診斷感染的應(yīng)用評(píng)價(jià)艾滋病病毒抗體檢測(cè)評(píng)價(jià)篩選試驗(yàn)敏感性高，但特異性不高，故有假陽(yáng)性；所以篩選試驗(yàn)陽(yáng)性時(shí)需用確診試驗(yàn)證實(shí)。確診試驗(yàn)陽(yáng)性，特別是RT-PCR法檢測(cè)HIV-RNA陽(yáng)性，對(duì)肯定診斷和早期診斷頗有價(jià)值。有關(guān)檢測(cè)抗原的感染診斷試驗(yàn)免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)檢測(cè)抗原的感染診斷試驗(yàn)輪狀病毒感染的免疫檢測(cè)輪狀病毒（rotavirus，RV）是嬰幼兒秋冬腹瀉的主要病原菌，常導(dǎo)致水電解質(zhì)酸堿平衡紊亂。輪狀病毒抗原的檢測(cè)是人類(lèi)輪狀病毒感染的特異診斷。檢測(cè)抗原的感染診斷試驗(yàn) 乙型肝炎表面抗原（HBsAg）血清HBsAg的檢測(cè)可采用ELISA、固相放射免疫法等方法，用于乙型肝炎病毒感染的篩選和普查。檢測(cè)抗原的感染診斷試驗(yàn) 乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）多存在于HBsAg陽(yáng)性的標(biāo)本中，很少有HBeAg單獨(dú)陽(yáng)性者。HBeAg陽(yáng)性是乙肝傳染性的標(biāo)志，在急性乙型肝炎早期常有HBeAg的檢出。HBeAg陽(yáng)性尚和HBVDNA復(fù)制、肝臟損害程度相關(guān)。檢測(cè)抗原的感染診斷試驗(yàn) 乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）能反映血清中Dane顆粒的存在及肝內(nèi)HBV的復(fù)制，并可與其他的HBV血清標(biāo)志物起互相配合和補(bǔ)充的作用，但在血清中難以檢測(cè)。檢測(cè)抗原的感染診斷試驗(yàn)謝謝！第十七章超敏反應(yīng)性疾病免疫學(xué)檢驗(yàn)免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)超敏反應(yīng)性疾病免疫學(xué)檢驗(yàn)?zāi)夸?Contents01020304過(guò)敏原皮膚實(shí)驗(yàn)血清IgE檢測(cè)抗血細(xì)胞抗體的檢測(cè)第四節(jié)循環(huán)免疫復(fù)合物檢測(cè)05第五節(jié)藥物過(guò)敏篩選試驗(yàn)超敏反應(yīng)性疾病免疫學(xué)檢驗(yàn)超敏反應(yīng)（hypersensitivityreaction）：

又稱(chēng)變態(tài)反應(yīng)，是機(jī)體再次受到相同抗原刺激后發(fā)生的一種異?；虿±硇缘拿庖邞?yīng)答，這種免疫應(yīng)答會(huì)使機(jī)體生理功能紊亂或組織細(xì)胞損傷，引起一系列疾病。引起超敏反應(yīng)的抗原稱(chēng)為變應(yīng)原（allergen），此類(lèi)疾病即為超敏反應(yīng)性疾病。課堂復(fù)習(xí)提問(wèn)超敏反應(yīng)分為幾型？它們的特點(diǎn)分別是什么？超敏反應(yīng)I型：速發(fā)型II型：細(xì)胞毒型或細(xì)胞溶解型III型：中等大小免疫復(fù)合物型IV型：遲發(fā)性病案討論

劉某，男，7歲，因“頻繁嘔吐半天伴腹痛”就診。發(fā)病前兩小時(shí)患兒進(jìn)食海蝦3只，而后出現(xiàn)嘔吐，為清水樣，量中等。伴有腹痛，為臍周、中上腹陣發(fā)性疼痛。無(wú)發(fā)熱、無(wú)腹瀉、無(wú)皮疹。

該患兒哮喘性支氣管炎病史，3歲時(shí)喘息發(fā)作過(guò)1次，給予普米克（糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥）、喘康速（β2腎上腺素受體激動(dòng)劑）吸入治療，并服用開(kāi)瑞坦（抗組胺藥），以后未再發(fā)作。以往曾有進(jìn)食海鮮史?；純耗赣H和外祖父有類(lèi)似食物過(guò)敏史。

超敏反應(yīng)病案討論

查體：神清，雙側(cè)腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)處可見(jiàn)濕疹，雙下肢未見(jiàn)異常，心肺正常，腹平軟，臍周、中上腹壓痛（+），反跳痛（-），無(wú)肌緊張。頸軟，神經(jīng)系統(tǒng)（-）。實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)：嗜酸性粒細(xì)胞百分比為12%(正常值0.5～5%)，其他指標(biāo)正常。血清IgE為1350IU/ml(正常值0～100IU/ml)。超敏反應(yīng)1.該病人的主要診斷是什么？2.該病人可以通過(guò)何種檢測(cè)輔助診斷？過(guò)敏原皮膚試驗(yàn)免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)過(guò)敏原皮膚試驗(yàn)皮膚試驗(yàn)的原理

皮膚試驗(yàn)(skin

test)簡(jiǎn)稱(chēng)皮試,是在人體皮膚上進(jìn)行的體內(nèi)免疫學(xué)試驗(yàn)。通過(guò)少量抗原的經(jīng)皮進(jìn)入人體,觀察局部皮膚反應(yīng)判斷。如果試驗(yàn)抗原為變應(yīng)原,則皮膚中結(jié)合有IgE的肥大細(xì)胞或致敏T細(xì)胞就會(huì)與其結(jié)合,引發(fā)即刻型或遲發(fā)型皮膚超敏反應(yīng)。過(guò)敏原皮膚試驗(yàn)皮膚試驗(yàn)的原理

皮膚試驗(yàn)主要用于檢測(cè)I型和IV型超敏反應(yīng)。此外,試驗(yàn)抗原也可從注射部位進(jìn)入微血管,觀察是否與循環(huán)中相,抗體結(jié)合,形成免疫復(fù)合物沉積,激活補(bǔ)體在局部皮膚引起炎癥,檢測(cè)Ⅲ型超敏反應(yīng)。目前臨床常見(jiàn)的檢測(cè)方式主要為點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)和斑貼試驗(yàn)。（一）I型超敏反應(yīng)皮膚試驗(yàn)原理

當(dāng)變應(yīng)原通過(guò)皮膚挑刺、劃痕、皮內(nèi)注射等方法進(jìn)入致敏者皮膚,與吸附在肥大細(xì)胞或(和)嗜堿性粒細(xì)胞上的特異IgE高變區(qū)結(jié)合,導(dǎo)致肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒,釋放生物活性介質(zhì)。在20~30分鐘內(nèi)局部皮膚出現(xiàn)紅暈、紅斑、風(fēng)團(tuán)以及瘙癢感,數(shù)小時(shí)后消失。出現(xiàn)此現(xiàn)象者判斷為皮試陽(yáng)性,即對(duì)該變應(yīng)原過(guò)敏;未出現(xiàn)紅暈紅斑、風(fēng)團(tuán)者為陰性,即對(duì)該變應(yīng)原不過(guò)敏。皮膚試驗(yàn)的原理（二）IV型超敏反應(yīng)皮膚試驗(yàn)原理

用皮內(nèi)注射、皮膚斑貼等方法使變應(yīng)原進(jìn)入已致敏機(jī)體,體內(nèi)致敏的T細(xì)胞再次接觸到變應(yīng)原后,釋放多種細(xì)胞因子,造成局部以單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥反應(yīng)。24-48小時(shí)后局部出現(xiàn)紅腫、硬結(jié)或水泡,以此來(lái)判斷變應(yīng)原是否引起機(jī)體IV型超敏反應(yīng)或機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。皮膚試驗(yàn)的原理皮膚實(shí)驗(yàn)的方法

皮膚實(shí)驗(yàn)最常用的部位是前臂曲側(cè)、上臂伸側(cè)或背部，此處皮膚較多樹(shù)突狀細(xì)胞且光滑細(xì)膩，適合實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果觀察。左右兩臂應(yīng)一側(cè)做試驗(yàn)，一側(cè)做對(duì)照。（一）皮內(nèi)試驗(yàn)（intradermaltest）

將實(shí)驗(yàn)抗原與對(duì)照液各0.01-0.03ml分別用皮試針頭注入皮內(nèi)，使局部形成圓形皮丘，如同時(shí)實(shí)驗(yàn)多種抗原時(shí)，相互間隔至少為4cm，以免強(qiáng)烈反應(yīng)時(shí)互相混淆結(jié)果。

皮膚實(shí)驗(yàn)的方法（一）皮內(nèi)試驗(yàn)（intradermaltest）

皮內(nèi)試驗(yàn)是最常用的皮膚試驗(yàn),測(cè)試劑量控制嚴(yán)格,結(jié)果較可靠,有助于準(zhǔn)確判斷變應(yīng)原，應(yīng)用范圍廣。

幾乎各類(lèi)抗原及各型反應(yīng)都可用皮內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，只是不同類(lèi)型的反應(yīng)觀察結(jié)果的時(shí)間和判定標(biāo)準(zhǔn)有所不同。皮膚實(shí)驗(yàn)的方法（一）皮內(nèi)試驗(yàn)（intradermaltest）

當(dāng)高可疑性抗原出現(xiàn)陰性結(jié)果時(shí)，可逐漸加大抗原濃度進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，須注意皮內(nèi)試驗(yàn)敏感性相對(duì)其他皮膚試驗(yàn)高，所用抗原濃度應(yīng)嚴(yán)格控制，以免出現(xiàn)嚴(yán)重反應(yīng)。皮膚實(shí)驗(yàn)的方法（一）皮內(nèi)試驗(yàn)（intradermaltest）皮膚實(shí)驗(yàn)的方法（二）點(diǎn)刺試驗(yàn)（pricktest）

又稱(chēng)挑刺試驗(yàn)或刺痕試驗(yàn)，將抗原與對(duì)照液分別滴于試驗(yàn)部位皮膚表面，用針尖穿過(guò)液滴在皮膚上以刺破皮膚不出血為度進(jìn)行點(diǎn)刺，1分鐘后拭去抗原液，15分鐘后觀察結(jié)果，如同時(shí)試驗(yàn)多種抗原時(shí)，應(yīng)注意抗原間不能交叉混合。皮膚實(shí)驗(yàn)的方法（二）點(diǎn)刺試驗(yàn)（pricktest）皮膚實(shí)驗(yàn)的方法（三）斑貼試驗(yàn)（patchtest）

取1cm2大小四層紗布，浸沾致敏物溶液，貼敷于受檢者前臂內(nèi)側(cè)或背部正常皮膚上。上面蓋以玻璃紙或蠟紙，再用紗布固定。24~72h觀察結(jié)果。皮膚實(shí)驗(yàn)的方法（三）斑貼試驗(yàn)（patchtest）皮膚實(shí)驗(yàn)的方法（一）結(jié)果判讀

I型超敏反應(yīng)（速發(fā)型）的結(jié)果判定應(yīng)在皮試后的15-30分鐘進(jìn)行，可參照本表，皮內(nèi)試驗(yàn)的陽(yáng)性反應(yīng)以風(fēng)團(tuán)為主，點(diǎn)刺試驗(yàn)的陽(yáng)性反應(yīng)以紅暈為主。臨床意義（一）結(jié)果判讀

IV型超敏反應(yīng)（遲發(fā)型）結(jié)果判定在48-72小時(shí)進(jìn)行，皮內(nèi)試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果以紅腫和硬結(jié)為主。

斑貼試驗(yàn)一般于48小時(shí)后打開(kāi)斑試器，并等待30分鐘后第一次讀取結(jié)果，并在第三天或第四天再次讀取結(jié)果。試驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果以紅腫和水皰為主。臨床意義（一）結(jié)果判讀臨床意義（二）結(jié)果分析及注意事項(xiàng)

因皮膚試驗(yàn)影響因素較多，結(jié)果判定無(wú)法量化，可能會(huì)出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性情況，一般常出現(xiàn)的假陰性可能由以下情況引起：1.皮試液的濃度過(guò)低或失效。2.老年患者或過(guò)敏性休克或哮喘大發(fā)作之后。3.皮試前用過(guò)抗組胺藥或免疫抑制劑。4.操作不當(dāng)將皮試液注入皮下或注入量過(guò)少等。臨床意義（二）結(jié)果分析及注意事項(xiàng)

而假陽(yáng)性則常見(jiàn)于以下情況：1.皮試液含有非特異性刺激物。2.患者患有皮膚劃痕征。3.操作手法過(guò)重。4.注入量較大或濃度過(guò)高。5.少量空氣混入等。臨床意義（三）臨床意義

皮膚試驗(yàn)屬于體內(nèi)免疫學(xué)試驗(yàn),直接在人體上測(cè)試，雖然較易受到各種因素的干擾，但是能反映機(jī)體目前實(shí)際免疫狀態(tài)，加上其操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可信性高，目前被臨床廣泛應(yīng)用，常用于以下方面：1.尋找過(guò)敏原2.預(yù)防藥物或疫苗過(guò)敏3.評(píng)估機(jī)體免疫細(xì)胞功能臨床意義課堂提問(wèn)青霉素皮試屬于什么試驗(yàn)？為什么我們接種疫苗后需要在接種室等待30分鐘左右點(diǎn)刺試驗(yàn)1.點(diǎn)刺試驗(yàn)2.I型超敏反應(yīng)（速發(fā)型）的結(jié)果判定應(yīng)在皮試后的15-30分鐘進(jìn)行血清IgE檢測(cè)免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)血清IgE檢測(cè)一、血清總IgE檢測(cè)血清總IgE是血清中各類(lèi)IgE含量的總和，正常情況下血清總IgE的含量極低，僅在ng/ml水平，因此臨床上一般選用敏感度較高的方法放射免疫測(cè)定法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法及化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。血清總IgE檢測(cè)（一）放射免疫吸附試驗(yàn)（RIST）

將待測(cè)血清與標(biāo)準(zhǔn)量放射標(biāo)記的IgE混合，再與結(jié)合于不溶性載體上的抗IgE抗體反應(yīng)，經(jīng)適度的孵育和洗滌后，測(cè)定吸附于載體上的放射標(biāo)記的IgE量，故又稱(chēng)固相放射免疫測(cè)定（SPRIA）。臨床常用雙抗體夾心法，多以濾紙為載體，將抗IgE抗體偶聯(lián)到經(jīng)溴化氟活化的濾紙上，使其與待檢血清及IgE標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行反應(yīng)；洗滌后加入125I標(biāo)記的抗人IgE，再經(jīng)洗滌后測(cè)定濾紙片的放射活性，其測(cè)定值與標(biāo)本中的IgE含量呈正相關(guān)。血清總IgE檢測(cè)（二）酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELISA）

測(cè)定血清IgE也可用雙抗體夾心ELISA法(見(jiàn)第八章),該法方便、實(shí)用，敏感性、特異性均較好，而且無(wú)放射性核素污染，也不需要特殊儀器。血清總IgE檢測(cè)（三）化學(xué)發(fā)光法

用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記抗IgE抗體,其與血清中IgE結(jié)合后,通過(guò)化學(xué)發(fā)光分析,計(jì)算出血清中IgE含量。此法敏感性、特異性均較好,并且自動(dòng)化程度較高，為臨床上常用方法。特異性IgE檢測(cè)

特異性IgE是指能與某種過(guò)敏原特異性結(jié)合的IgE，因該抗體只能和相應(yīng)的變應(yīng)原結(jié)合，因此需要用純化的變應(yīng)原進(jìn)行檢測(cè)，常用的檢測(cè)方法包括以下幾種（一）放射變應(yīng)原吸附試驗(yàn)（radioallergosorbenttest，RAST）（二）酶聯(lián)免疫測(cè)定法（三）免疫印跡法(immunoblottingtest,IBT)（四）固相熒光免疫測(cè)定法此法操作簡(jiǎn)單，一次可檢測(cè)多種特異性IgE，但反應(yīng)體系單一，易互相影響。特異性IgE檢測(cè)（一）放射變應(yīng)原吸附試驗(yàn)（二）酶聯(lián)免疫測(cè)定法（三）免疫印跡法（四）固相熒光免疫測(cè)定法此法因沒(méi)有同位素污染，酶標(biāo)抗體可長(zhǎng)期保存。該法特異性強(qiáng)，敏感性高，影響因素少，但費(fèi)用較高、花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，易受血清IgG影響。本法敏感度高，特異性強(qiáng)，具備良好的溯源性，越來(lái)越廣泛的被臨床使用。臨床意義（一）血清總IgE血清總IgE水平一般用國(guó)際單位（IU）或ng表示（1IU=2.4ng）。正常人群IgE水平受環(huán)境、種族、遺傳、年齡、檢測(cè)方法及取樣標(biāo)準(zhǔn)等因素的影響，以至各家報(bào)道的正常值相差甚遠(yuǎn)。嬰兒臍帶血IgE水平小于0.5IU/ml，出生后隨年齡增長(zhǎng)而逐漸升高，12歲時(shí)達(dá)成人水平。臨床意義（一）血清總IgE

成人血清IgE水平約在20～200IU/ml之間，一般認(rèn)為大于333IU/ml（800ng/ml）時(shí)為異常升高。I型超敏反應(yīng)性疾病，如哮喘、變應(yīng)性鼻炎、特發(fā)性皮炎、濕疹、藥物性間質(zhì)性肺炎、支氣管肺曲菌病、寄生蟲(chóng)感染、急慢性肝炎和IgE型多發(fā)性骨髓瘤均可使血清總IgE水平升高。因此在分析血清總IgE水平診斷I型超敏反應(yīng)時(shí)，需要參考當(dāng)?shù)厝巳嚎侷gE水平并排除相關(guān)疾病。（二）特異性IgE特異性IgE測(cè)定是體外檢測(cè)變應(yīng)原的重要手段。主要用于1型超敏反應(yīng)的診斷。其試驗(yàn)的靈敏度及特異性都很高。根據(jù)sIgE含量可確定患者變應(yīng)原種類(lèi),評(píng)價(jià)患者過(guò)敏狀態(tài)、脫敏治療的療效,對(duì)哮喘的診斷和鑒別診斷有重要幫助。臨床意義（二）特異性IgE

但單純特異性IgE升高并不能診斷I型超敏反應(yīng)性疾病，主要因?yàn)橐韵氯c(diǎn)：1.sIgE陽(yáng)性只說(shuō)明對(duì)該過(guò)敏原已經(jīng)致敏,而致敏與否還與機(jī)體免疫功能狀態(tài)有關(guān)。2.sIgE陽(yáng)性與現(xiàn)有疾病沒(méi)有直接關(guān)系,而是過(guò)去致敏的過(guò)敏原。3.交叉反應(yīng)。臨床意義抗血細(xì)胞抗體檢測(cè)免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

機(jī)體產(chǎn)生的抗血細(xì)胞抗體是II型超敏反應(yīng)的主要介質(zhì)，其與血細(xì)胞結(jié)合后，可導(dǎo)致血細(xì)胞破壞，臨床上引起貧血、粒細(xì)胞減少、血小板減少等。其大多屬于不完全抗體，與相應(yīng)抗原結(jié)合后不產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。對(duì)不同的血細(xì)胞抗體，檢測(cè)方法基本相同，現(xiàn)將抗球蛋白檢測(cè)做簡(jiǎn)要介紹。抗血細(xì)胞抗體的檢測(cè)

抗球蛋白的檢測(cè)通常用抗球蛋白實(shí)驗(yàn)，即Coombs試驗(yàn)或稱(chēng)antiglobulinstest（AGT），其作為檢測(cè)不完全抗體的經(jīng)典方法，基本原理是利用抗球蛋白抗體作為第二抗體，連接與紅細(xì)胞表面抗原結(jié)合的特異性抗體，使紅細(xì)胞凝集。Coombs試驗(yàn)分為了直接法和間接法。抗球蛋白檢測(cè)抗球蛋白檢測(cè)（一）直接Coombs試驗(yàn)

用于直接檢測(cè)紅細(xì)胞表面的不完全抗體?；颊唧w內(nèi)若有抗紅細(xì)胞抗原的不完全抗體存在，可與紅細(xì)胞發(fā)生