DB21T 2472-2015 H1N1亞型不同譜系豬流感病毒核酸RT-PCR鑒別診斷技術(shù)規(guī)范　　

ICS11.220B41DB21DB21/T2472—2015H1N1亞型不同譜系豬流感病毒核酸RT-PCR鑒別診斷技術(shù)規(guī)范DiagnosticTechniquesproceduresofRT-PCRassayfordifferentingsubtypesofH1N1SwineInfluenzaVirusnucleicacid遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2472—2015本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省畜牧獸醫(yī)局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心、遼寧省動物醫(yī)學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蘭德松、顧貴波、趙鳳菊、魏澍、李曉楠、孫世宇、楊作豐、李清竹、李紅魁、申貫?zāi)?、王海豐DB21/T2472—2015豬流感（SI）是由A型豬流感病毒（SIV）感染豬引起的一種嚴(yán)重的呼吸道及免疫抑制傳染病，已在世界大部分國家廣泛存在并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，是目前危害養(yǎng)豬業(yè)的重大疾病之一。同時(shí)豬被認(rèn)為是流感病毒重組的“混合器”，SIV對流感病毒的流行、遺傳衍化、跨物種傳播以及在公共衛(wèi)生學(xué)上都具有重要意義。從國內(nèi)和我省近年來豬群中的檢測結(jié)果來看，豬群主要以H1N1亞型SIV流行為主并危害嚴(yán)重。H1N1亞型SIV主要以經(jīng)典型、類禽型和甲型H1N1三個(gè)譜系感染最為普遍，危害最大。針對H1N1三個(gè)不同譜系的SIV，國內(nèi)尚無RT-PCR檢測方法方面的技術(shù)規(guī)范，應(yīng)用本技術(shù)規(guī)范可在實(shí)驗(yàn)室對經(jīng)典型、類禽型和甲型H1N1三個(gè)不同譜系的SIV做出快速、準(zhǔn)確診斷，進(jìn)而有針對性地采取綜合防控措施。因此，本規(guī)范對于豬流感的檢測和控制具有重要的意義，同時(shí)也為人、豬、禽流感防控提供預(yù)警信息奠定重要基礎(chǔ)。1DB21/T2472—2015本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了H1N1亞型不同譜系（甲型H1virus，SIV）RT-PCR檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于甲型H1N1、經(jīng)典H1N1及類禽型H1N1亞型豬流感的鑒別診斷和監(jiān)測，適用于豬鼻咽拭子、臟器、雞胚尿囊液及細(xì)胞培養(yǎng)物中H1N1亞型SIV核酸的檢測。本標(biāo)準(zhǔn)中的試驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全Ⅱ級（BSL-2）以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范3縮略語下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。SIV：豬流感病毒（Swineinfluenzavirus）DEPC：焦炭酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid）DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）bp:堿基對（Basepair）RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）MLV:莫洛尼鼠白血病病毒（Murineleukemiavirus）DTT：二硫蘇糖醇（DL-Dithiothreitol）PBS:磷酸緩沖液（Phosphatebuffersoulution）TAE：Tris-乙酸電泳緩沖液（Trisacetate-EDTAbuffer）4原理SIV是一種RNA病毒。RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA可作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)PEDV保守基因序列設(shè)計(jì)一對引物，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火和延伸，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA。5儀器和器材2DB21/T2472—2015高速臺式冷凍離心機(jī)（最大離心力12000g以上）。冰箱（2～8℃,-20℃和-70℃)。PCR擴(kuò)增儀。凝膠成像系統(tǒng)。微波爐。微量移液器。6試劑和材料6.1Trizol：RNA提取抽提試劑，外觀為粉紅色，分裝至棕色瓶中，于4～8℃保存。6.2氯仿：4℃預(yù)冷。6.3異丙醇：4℃預(yù)冷。6.475%乙醇：用新開啟的無水乙醇和DEPC水配制，-20℃預(yù)冷。6.5DEPC水：去離子水中加入0.1%DEPC，37℃作用1h121士2）℃,高壓滅菌15min。6.6RNA酶抑制劑（40U/μL）。6.7DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶（5U/μL）。6.8dNTP(2.5mmol/L)。6.9用于RT-PCR反應(yīng)的引物濃度為20μmol/L，其序列如下：經(jīng)典型上游引物F:GGACATGTTACCCAGGAGA經(jīng)典型下游引物R:ACTGGTAGGTGGATGGTGAA類禽型上游引物F:TGGAGCATGCTACCCCGGAGA類禽型下游引物R:CCATACATCCAAAAACCCATC甲型上游引物F:TATTCCCCAAGACAAGTTCA甲型下游引物R:ATCGTGGACTGGTGTATCTG6.10反轉(zhuǎn)錄酶：M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（5U/μL）。6.11DTT(0.1mmol/L)。6.12反轉(zhuǎn)錄引物Uni12：AGCAAAAGCAGG（20μmol/L）。6.13陰性對照：DEPC水。6.14陽性對照：不同譜系SIV陽性質(zhì)粒。6.15PBS：磷酸鹽緩沖液（0.02mol/LpH7.2）。6.16TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液。6.17溴化乙錠。6.18DL2000DNAMarker。注：除另有說明，所用試劑均為分析純；所有試劑均用無RNA酶的容器分裝。7操作步驟7.1樣品的采集、前處理、存放和運(yùn)送7.1.1采樣注意事項(xiàng)采樣及樣品前處理過程中應(yīng)戴一次性手套，防止樣本交叉污染。3DB21/T2472—20157.1.2采樣工具病毒采集管；經(jīng)121（士2）℃高壓滅菌15min的15mL離心管和1.5mL離心管；經(jīng)160℃干熱滅菌2h的剪刀、鑷子。7.1.3豬鼻腔、咽喉拭子的采集與前處理用病毒采集管采取臨床疑似活體豬的鼻腔、咽喉拭子，編號備用，待檢。7.1.4豬臟器的采集與前處理7.1.5稱取1克病死豬的肺臟，進(jìn)行研磨，然后加入1mL滅菌PBS，混勻，3000r/min離心20min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號備用。7.1.6雞胚尿囊液將無菌收集盲傳三代的雞胚尿囊液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號備用。7.1.7細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號備用。7.1.8存放與運(yùn)送采集或處理的樣品在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；若需長期保存，應(yīng)放置溫度低于-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在6~8h之內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。按照《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進(jìn)行樣品的生物安全標(biāo)識。7.2RT-PCR檢測7.2.1RNA提取7.2.1.1取n個(gè)滅菌的1.5mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽性管數(shù)+陰性管數(shù)，對每個(gè)離心管進(jìn)行編號。7.2.1.2每管加人750μLTrizol，分別加入被檢樣品、陽性對照和陰性對照各250μL，顛倒10次混勻，室溫靜置5min；再加入250μL氯仿，混勻器上振蕩混勻15s(也可以用手反復(fù)顛倒混勻)。4℃12000g離心15min。7.2.1.3取與7.2.1.1中相同數(shù)量滅菌的1.5mL離心管，加入500μL異丙醇(4℃預(yù)冷)。取7.2.1.2中離心后的上清液約500μL轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻，室溫靜置15min。7.2.1.44℃12000g離心15min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體，加入1mL75%DEPC乙醇，洗滌。7.2.1.54℃12000g離心10min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體。如此洗滌2次。7.2.1.64000g離心10s，用微量加樣器小心將殘余液體吸干，室溫干燥3~10min。7.2.1.7加入20μL經(jīng)DEPC處理的水，輕柔混勻，溶解管壁上的RNA，冰上保存?zhèn)溆?。提取的RNA應(yīng)在2h內(nèi)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；若需長期保存應(yīng)放置-70℃冰箱。7.2.2反轉(zhuǎn)錄7.2.2.1反轉(zhuǎn)錄體系建立25μL的反應(yīng)體系，按下列組分加入離心管中：4DB21/T2472—2015DEPC水8.5μLdNTP（2.5mmol/L）2μLUni12引物(20μmol/L)1μLDTT(0.1mmol/L)2.5μL5×ReverseTranscriptaseXLBuffer(5倍緩沖液)5μLM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μLRNA酶抑制劑0.5μL實(shí)驗(yàn)樣品RNA5μL7.2.2.2反轉(zhuǎn)錄條件混勻后在37℃水浴鍋中反應(yīng)1h；在70℃水浴鍋中反應(yīng)15min；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接用于PCR或-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.3PCR7.2.3.1PCR反應(yīng)體系建立25μL的反應(yīng)體系，按下列組分加入PCR專用離心管中：PremixEXTaq12.5μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）1μL上游特異性PCR引物(20μmol/L)0.5μL下游特異性PCR引物(20μmol/L)0.5μL滅菌蒸餾水10.5μL7.2.3.2PCR反應(yīng)反應(yīng)條件7.2.3.3電泳取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6μL點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠（見附錄A）板加樣孔中，瓊脂糖凝膠板一側(cè)點(diǎn)樣孔加入DNA2000Marker（分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）6μL，緩沖液為1×TAE，以5V/cm電壓電泳20min，將電泳好的凝膠放到凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。8試驗(yàn)成立的條件當(dāng)甲型H1N1SIV陽性對照出現(xiàn)在476bp擴(kuò)增條帶、陰性對照未出現(xiàn)目的條帶；經(jīng)典H1N1SIV陽性對照出現(xiàn)在293bp擴(kuò)增條帶、陰性對照未出現(xiàn)目的條帶；類禽型H1N1SIV陽性對照出現(xiàn)在997bp擴(kuò)增條帶、陰性對照未出現(xiàn)目的條帶時(shí)，表明試驗(yàn)有效，否則試驗(yàn)無效。9結(jié)果判定9.1陽性判定應(yīng)用甲型H1N、經(jīng)典H1N1和類禽型H1N1三種譜系H1N1SIV的檢測引物，按照各基因檢測體系對樣品進(jìn)行檢測，被檢樣品出現(xiàn)476bp擴(kuò)增條帶則判定為甲型H1N1SIV核酸陽性；出現(xiàn)293bp擴(kuò)增條帶則判定為經(jīng)典H1N1SIV核酸陽性；出現(xiàn)997bp擴(kuò)增條帶則判定為類禽型H1N1SIV核酸陽性。5DB21/T2472—20159.2陰性判定如果在所用不同譜系檢測引物預(yù)期擴(kuò)增片段的位置未出現(xiàn)目的條帶，則判定為相應(yīng)譜系H1N1SIV核酸陰性。6DB21/T2472—2015（規(guī)范性附錄）試劑配制A.10.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制A.1.10.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4?12H20)71.64g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.1.20.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4?2H20)31.21g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.1.3量取0.2moL/L磷酸氫二鈉溶液360mL，0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液140mL，稱取氯化鈉38g，用無離子水溶解稀釋至5000mL，4℃保存。A.2電泳緩沖液(50倍)A.2.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉(EDTA)溶液(pH8.0)二水乙二銨四乙酸二鈉(分析純)18.61g滅菌雙蒸水8