DB21T 2251-2014 豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測方法　

ICS11.220B41DB21DB21/T2251—2014豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測方法MethodofRT-PCRforthedetectionofporcineepidemicdiarrheavirus遼寧省質量技術監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2251—2014本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由遼寧省動物疫病預防控制中心提出。本標準由遼寧省畜牧獸醫(yī)局歸口。本標準起草單位：遼寧省動物疫病預防控制中心、遼寧省動物醫(yī)學研究院。本標準主要起草人：于學武顧貴波陳瑤趙曉彤趙鳳菊劉坤洋關乃鵬王珊珊刁賀軍王冰鄧文超1DB21/T2251—2014本標準規(guī)定了豬流行性腹瀉病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）RT-PCR檢測方法的儀器和器材、試劑和材料、操作步驟和結果判定，并介紹了其原理。本標準適用于豬流行性腹瀉的診斷和監(jiān)測，適用于豬腸內容物、糞便以及細胞培養(yǎng)物中PEDV核酸2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。中華人民共和國農業(yè)部公告第302號獸醫(yī)實驗室生物安全技術管理規(guī)范3縮略語下列縮略語適用于本標準。PEDV：豬流行性腹瀉病毒（porcineepidemicdiarrheavirus）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）BP：堿基對（basepair）RT-PCR：反轉錄聚合酶鏈式反應（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）4原理PEDV是一種RNA病毒。RNA反轉錄產生的cDNA可作為PCR模板進行擴增。根據PEDV保守基因序列設計一對引物，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以引物為延伸起點，通過變性、退火和延伸，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA。5儀器和器材本技術規(guī)范中需使用的主要儀器和器材有高速臺式冷凍離心機（最大離心力12000g以上）、冰箱（2~8℃,-20℃和-70℃三種）、PCR擴增儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、微波爐、分析天平、1.5mL離心管、0.2mL離心管、微量移液器和吸頭。6試劑和材料2DB21/T2251—20146.1Trizol：RNA抽提試劑，外觀為粉紅色，分裝至棕色瓶中，于4～8℃保存。6.2氯仿：4℃預冷。6.3異丙醇：4℃預冷。6.475%乙醇：用新開啟的無水乙醇和DEPC水配制，-20℃預冷。6.5DEPC水：去離子水中加入0.1%DEPC，37℃作用1h，121（士2）℃,高壓滅菌15min。6.6RNA酶抑制劑（40U/μL）。6.7DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶（5U/μL）。6.8dNTP(2.5mmol/L)。6.9用于RT-PCR反應的引物濃度為20μmol/L，其序列如下：上游引物F：5′-TTCCCAGCGTAGTTGAGATTG-3′下游引物R：5′-CGAAGTGGCTCTGGATTTGTT-3′6.10反轉錄酶：AMV反轉錄酶（5U/μL）。6.11反轉錄引物：OligodT-AdaptorPrimer（2.5μmol/L）。6.12陰性對照：DEPC水。6.13陽性對照：PEDV細胞培養(yǎng)物。6.14PBS：磷酸鹽緩沖液（0.02mol/LpH7.2）。6.15TAE：三羥甲基氨基甲烷一乙酸電泳緩沖液。6.16溴化乙錠。6.17DL2000DNAMarker。注：除另有說明，所用試劑均為分析純；所有試劑均用無RNA酶的容器分裝。7操作步驟7.1樣品的采集、前處理、存放和運送7.1.1采樣注意事項采樣及樣品前處理過程中應戴一次性手套，樣本間不得交叉污染。7.1.2采樣工具藥匙、15mL離心管和1.5mL離心管經121（士2）℃高壓滅菌15min；剪刀、鑷子經160℃干烤2h。7.1.3腸內容物的采集與前處理3DB21/T2251—2014采取病死或剖殺豬的小腸內容物，裝入15mL滅菌離心管中，按1：5倍體積加入PBS（見附錄A混勻，3000rpm離心20min，取上清液轉入1.5mL離心管中編號備用，待檢。7.1.4糞便的采集與前處理用藥匙采取發(fā)病豬新鮮糞便，裝入15mL滅菌離心管中，按1：5倍體積加入PBS（見附錄A混勻，3000rpm離心20min，取上清液轉入1.5mL離心管中編號備用，待檢。7.1.5細胞培養(yǎng)物細胞培養(yǎng)物凍融3次，轉入1.5mL離心管中編號備用。7.1.6存放與運送采集或處理的樣品在2~8℃條件下保存應不超過24h；若需長期保存，應放置-70℃冰箱，但應避免反復凍融（凍融不超過3次）。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在6~8h之內運送到實驗室。按照《獸醫(yī)實驗室生物安全技術管理規(guī)范》進行樣品的生物安全標識。7.2RT-PCR檢測7.2.1RNA提取在核酸提取室進行。7.2.1.1取n個滅菌的1.5mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽性對照管數(shù)+陰性對照管數(shù)，對每個離心管進行編號。7.2.1.2每管加入750μLTrizol，分別加入被檢樣品、陽性對照和陰性對照各250uL，顛倒10次混勻，室溫靜置5min；再加入250μL氯仿，混勻器上振蕩混勻15s（也可以用手反復顛倒混勻）。4℃12000g離心15min。7.2.1.3取與7.1.1中相同數(shù)量滅菌的1.5mL離心管，加入500μL異丙醇(4℃預冷)。取7.1.2中離心后的上清液約500μL轉移至相應的管中，顛倒混勻，室溫靜置15min。7.2.1.44℃12000g離心15min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體，加入1mL75%乙醇，顛倒洗滌。7.2.1.54℃12000g離心10min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體。7.2.1.64000g離心10s，用微量加樣器小心將殘余液體吸干，室溫干燥3~10min。7.2.1.7加入20μL經DEPC處理的水和2μLRNA酶抑制劑，輕柔混勻，溶解管壁上的RNA，冰上保存?zhèn)溆?。提取的RNA應在2h內進行RT-PCR擴增；于-70℃冰箱長期保存。7.2.2反轉錄7.2.2.1反轉錄體系建立10μL的反應體系，按下列組分加入離心管中：MgCl22μL10×RTBufferRNaseFreedH2O3.75μL4DB21/T2251—2014dNTPMixture(各10mM)1μLRNaseInhibitor0.25μLAMVReverseTranscriptase*10.5μLOligodT-AdaptorPrimer0.5μL實驗樣品RNA1μL7.2.2.2反轉錄條件7.2.3PCR7.2.3.1PCR反應體系建立50μL的反應體系，按下列組分加入PCR專用離心管中：5×PCRBuffer滅菌蒸餾水28.75μLHSTaqDNA聚合酶0.25μL上游特異性PCR引物0.5μL下游特異性PCR引物0.5μL反轉錄產物7.2.3.2PCR反應條件7.2.3.3電泳將PCR擴增產物6μL與1μL上樣緩沖液混合，點樣于1.2%瓊脂糖凝膠（見附錄A）板加樣孔中，瓊脂糖凝膠板一側點樣孔加入DL2000DNAMarker（分子質量標準物緩沖液為1×TAE，以5V/cm電壓電泳25min。8結果判定紫外凝膠成像儀下觀察結果，當陽性對照出現(xiàn)在428bp擴增條帶，陰性對照未出現(xiàn)目的條帶時，實驗結果可作為判定依據。被檢樣品出現(xiàn)428bp擴增條帶為PEDV陽性，未出現(xiàn)428bp擴增條帶的樣品判為陰性。56DB21/T2251—2014（規(guī)范性附錄）A.10.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制A.1.10.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H20)71.64g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.1.20.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H20)31.21g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.1.3量取0.2moL/L磷酸氫二鈉溶液360mL，0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液140mL，稱取氯化鈉38g，用無離子水溶解稀釋至5000mL，4℃保存。A.2電泳緩沖液(50倍)A.2.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉(EDTA)溶液(pH8.0)二水乙二銨四乙酸二鈉(分析純)滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調pH至8.0滅菌雙蒸水加至100mLA.2.2TAE(三羥甲基氨基甲烷一乙酸)電泳緩沖液(50倍)羥基甲基氨基甲烷(Tris)（分析純)242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二銨四乙酸