《保健食品中14種真菌毒素含量的高通量快速測定 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》

ICS67.050

CCSX04

團體標準

T/GDFCAXXX—2023

保健食品中14種真菌毒素含量的高通量快

速測定超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

DeterminationofmycotoxinscontentinhealthfoodsbyLiquidchromatography

-tandemmassspectrometry

2023-XX-XX發(fā)布2024-XX-XX實施

廣東省食品流通協(xié)會??發(fā)布

T/

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GDFCA

XXX—2023

保健食品中14種真菌毒素含量的高通量快速測定超高效液相色譜

-串聯(lián)質(zhì)譜法

1范圍

本文件描述了采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行保健食品中14種真菌毒素含量的高通量快速測

定的方法。

本文件適用于口服液、片劑、膠囊、顆粒劑、糖果制品等劑型保健食品中黃曲霉毒素(AFTB1，AFTB2，

AFTG1，AFTG2)、伏馬毒素（FB1，F(xiàn)B2，F(xiàn)B3）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、

T-2毒素、雜色曲霉素（ST）、赭曲霉毒素A（OTA）、桔青霉素（CIT）和展青霉素（PAT）14種真菌毒

素含量的測定，保健食品原輔料及其他植物性食品可參照執(zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4原理

試樣中的真菌毒素，用2%甲酸乙腈溶液提取，提取液經(jīng)氯化鈉鹽析后用分散固相萃取凈化除雜，凈

化液經(jīng)氮吹濃縮、復溶、定容后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應監(jiān)測模式（MRM）測定，外標法定量。

5試劑和材料

除另有說明外，所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。

5.1乙腈（C2H3N,CAS號：75-05-8）：色譜純。

5.2甲酸（CH2O2,CAS號：64-18-06）。

5.32%甲酸乙腈溶液：準確吸取20mL甲酸（5.2），用乙腈（5.1）定容到1000mL。

5.4甲醇（CH4O,CAS號：67-56-1）。

5.5乙酸（C2H4O2,CAS號：77671-22-9）。

5.6甲醇乙酸水溶液：準確吸取4mL,用純水定容到100mL。取其中90mL溶液，加入10mL甲醇（5.4），

混勻。

5.7乙酸銨（C2H7NO2,CAS號：631-61-8）。

5.8氯化鈉（NaCl,CAS號：7647-14-5）。

5.9無水硫酸鎂（MgSO4,CAS號：7487-88-9）。

5.10真菌毒素標準品：14種真菌毒素的中文名稱、英文名稱、CAS號、分子式及相對分子量參見附

錄A的表A.1，均為有證標準物質(zhì)，純度≥95%。

5.11標準儲備溶液：分別稱取適量（精確至0.1mg）真菌毒素標準品，用乙腈（5.1）溶解并定容至

10mL。儲備溶液避光-20℃儲存，有效期1年

3

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5.12混合標準溶液：分別移取適量14種真菌毒素標準品，用乙腈（5.1）溶解稀釋定容配制成嘔吐毒

素（DON）、展青霉素（PAT）、桔青霉素（CIT）濃度為5000ng/mL的標準儲備液，伏馬毒素B1(FB1)、

伏馬毒素B2(FB2)、伏馬毒素B3(FB3)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、赭曲霉毒素A(OTA)、T-2毒素(T-2)、雜

色曲霉素(ST)濃度為500ng/mL的標準儲備液，黃曲霉毒素B1(AFTB1)、黃曲霉毒素B2(AFTB2)、黃曲霉

毒素G1(AFTG1)、黃曲霉毒素G2(AFTG2)濃度為50ng/mL的標準儲備液。-20℃冰箱中避光保存。

6儀器和設備

6.1液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)儀：配有電噴霧離子源（ESI）。

6.2分析天平：感量0.001g和0.01mg。

6.3渦旋振蕩器。

6.4超聲儀。

6.5離心機：轉(zhuǎn)速≥14000r/min

6.6氮吹儀。

7試樣的制備

7.1固態(tài)試樣

將固體飲料、糖果制品、片劑研細，混勻，均分成50~100g兩份，分別裝入潔凈容器內(nèi)；膠囊連同

膠囊殼一起搗碎，混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器，密封，并標明標記，于常溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

7.2液體試樣

將其充分攪拌均勻，均分成50~100g兩份，分別裝入潔凈容器，密封，并標明標記，于常溫儲存?zhèn)?/p>

用。

8測定步驟

8.1樣品預處理

8.1.1固態(tài)試樣或半固態(tài)試樣：稱取2g（精確到0.01g）樣品置于50mL離心管中，加入5mL水，

渦旋5min，再加入V110mL含2%甲酸乙腈溶液，渦旋3min后超聲提取30min；加入1g氯化鈉，渦旋3min，

于12000r/min條件下離心5min。吸取6mL上清液置于內(nèi)含200mgC18填料和1g無水硫酸鎂的10mL離

心管中，渦旋震蕩3min，于12000r/min下離心5min；移取V22.5mL上清液，于40℃氮氣吹干，用V31mL

甲醇乙酸溶液（5.6）復溶，渦旋振蕩3min，于14000r/min條件下離心30min，上清液上機測定。

8.1.2液體試樣：稱取2g（精確到0.01g）樣品置于50mL離心管中，渦旋5min，再加入V110mL

含2%甲酸乙腈溶液，渦旋3min后超聲提取30min；加入1g氯化鈉，渦旋3min，于12000r/min條件下

離心5min。吸取6mL上清液置于內(nèi)含200mgC18填料和1g無水硫酸鎂的10mL離心管中，渦旋震蕩3min，

于12000r/min下離心5min；移取V22.5mL上清液，于40℃氮氣吹干，用V31mL甲醇乙酸溶液（5.6）復

溶，渦旋振蕩3min，于14000r/min條件下離心30min，上清液上機測定。

8.2混合基質(zhì)匹配標準曲線繪制

取空白試樣，按上述方法處理制得其空白基質(zhì)溶液，準確量取混合標準溶液適量，用空白基質(zhì)溶液

稀釋成黃曲霉毒素（AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2）濃度為0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0ng/mL，伏

馬毒素（FB1、FB2、FB3）、雜色曲霉素（ST）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素A（OTA）、T-2毒

素（T-2）濃度為1.0、2.5、5.0、10、25、50ng/mL，桔青霉素（CIT）、展青霉素（PAT）、嘔吐毒素

（DON）濃度為10、25、50、100、250、500ng/mL的基質(zhì)匹配混合標準工作溶液，臨用現(xiàn)配。供超高效

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。以上述溶液中各真菌毒素的濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，繪制

標準曲線。

8.3儀器參考條件

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8.3.1液相色譜參考條件如下（適用于展青霉素外的其他毒素）：

a)色譜柱：KinetexF5色譜柱（2.1×100mm，2.6μm），或性能相當者。

b)流速：0.4mL/min。

c)柱溫：40℃。

d)進樣量：5μL。

e)流動相及梯度洗脫程序見表1。

表1梯度洗脫程序表

時間/minA:0.1%甲酸-5mmol/L乙酸銨水溶液/%B:甲醇/%

0955

6.08020

8.08020

15.01090

18.01090

18.1955

20.0955

8.3.2液相色譜參考條件如下（適用于展青霉素）：

a)色譜柱：UltraAQC18色譜柱（2.1×100mm3μm），或性能相當者。

b)流速：0.3mL/min。

c)柱溫：40℃。

d)進樣量：5μL。

e)運行時間：10min。

f)流動相及梯度洗脫程序見表2。

表2梯度洗脫程序表

時間/minA：水/%B：甲醇/%

0955

3.0955

6.0595

8.0595

8.1955

10.0955

8.3.3質(zhì)譜參考條件如下：

a)離子源：電噴霧離子源源（ESI﹢/-）；

b)掃描模式：正、負離子掃描；

c)監(jiān)測方式：多反應離子監(jiān)測（MRM）；

d)離子源溫度：550℃；

e)碰撞氣：高純氮氣，干燥氣、霧化氣、鞘氣等均為氮氣或其他合適氣體；

f)離子噴霧電壓：5500V；

g)霧化氣壓力：50psi；

h)氣簾氣壓力：40psi；

i)輔助加熱氣壓力：50psi；

j)碰撞氣壓力：中檔；

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k)質(zhì)譜優(yōu)化條件參數(shù)見表3。

表3真菌毒素的UPLC-MS-MS優(yōu)化參數(shù)

化合物母離子子離子去簇電壓/V碰撞能量/eV保留時間/min

黃曲霉毒素B1313.1(+H)285.0a/241.015031/4512.7

黃曲霉毒素B2315.1(+H)287.0a/259.015035/4012.5

黃曲霉毒素G1329.0(+H)243.0a/283.015037/3412.3

黃曲霉毒素G2331.0(+H)245.0a/285.015040/3712.0

伏馬毒素B1722.4(+H)334.3a/352.311059/5413.4

伏馬毒素B2706.4(+H)336.4a/354.311757/4914.2

伏馬毒素B3706.4(+H)336.2a/354.411554/4713.9

+a

T-2毒素489.2(+NH4)245.1/387.121036/2613.8

雜色曲霉素325.0(+H)281.0a/309.921050/3314.6

桔青霉素251.0(+H)233.0a/191.016021/3512.1

赭曲霉毒素A402.0(-H)358.1a/211.0-150-27/-3714.1

嘔吐毒素297.0(+H)203.0a/157.012018/273.07

展青霉素152.9(-H)108.9a/80.8-80-12/-213.45

玉米赤霉烯酮317.1(-H)175.0a/273.1-100-34/-2714.4

a為定量離子

8.4超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定

8.4.1定性測定

將基質(zhì)匹配混合標準工作溶液和試樣溶液注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，記錄基質(zhì)匹配混合標

準工作溶液和試樣溶液中各化合物的保留時間，在相同條件下，如果樣品溶液中檢出的色譜峰的保留時

間與標準工作溶液中的某組分峰的保留時間一致（變化范圍在±2.5%），并且所選擇的兩對子離子的質(zhì)

荷比一致，樣品溶液中的定性離子相對豐度與濃度相當標準工作溶液中定性離子的相對豐度進行比較時，

相對偏差不超過表4規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在相應的被測物。

表4定性確定時相對離子豐度的最大允許偏差

相對離子豐度＞50%＞20%~50%＞10%~20%≤10%

允許的相對偏差±20%±25%±30%±50%

8.4.2定量測定

在儀器最佳工作條件下，將基質(zhì)匹配混合標準工作溶液和試樣溶液注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀

中，擬合標準工作曲線，外標法定量計算試樣溶液中各待測組分濃度。試樣溶液中各待測物的響應值均

應在儀器測定的線性范圍內(nèi)。14種真菌毒素典型色譜圖參見附錄B。

8.4.3空白試驗

取空白試樣，采用完全相同的測定步驟進行測定。。

9結(jié)果計算和表述

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試樣中真菌毒素的含量按式（1）計算，計算結(jié)果應扣除空白值：

CVV

X13····················································(1)

V2m

式中：

?——試樣中待測組分含量，單位為微克每千克（μg/kg）；

c——根據(jù)標準曲線或單點校準得到的待測組分溶液濃度，單位為微克每升（μg/L）；

?1——試樣提取液體積，單位為毫升（mL）；

?2——用于凈化分取的樣品體積，單位為毫升（mL）；

?3——樣品經(jīng)精華洗脫后的最終定容體積，單位為毫升（mL）；

?——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）或吸取試樣的體積，單位為毫升（mL）。

計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

10靈敏度和準確度、精密度

10.1靈敏度

黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的檢出限為0.2μg/kg，伏馬毒素B1、

伏馬毒素B2、伏馬毒素B3、T-2毒素、雜色曲霉素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的檢出限為2μg/kg，

展青霉素、桔青霉素、嘔吐毒素檢出限為20μg/kg。

黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的定量限為0.5μg/kg，伏馬毒素B1、

伏馬毒素B2、伏馬毒素B3、T-2毒素、雜色曲霉素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的定量限為5μg/kg，

展青霉素、桔青霉素、嘔吐毒素的定量限為50μg/kg。

10.2準確度

本方法中固體基質(zhì)和液體基質(zhì)的加標回收率要求70%~120%。

10.3精密度

本方法在重復性下獲得的兩次獨立測試結(jié)果的相對標準偏差不超過20%。

A

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附錄A

（資料性）

14種真菌毒素的中文名稱及英文名稱、CAS號、分子式及相對分子量

14種真菌毒素的中文名稱及英文名稱、CAS號、分子式及相對分子量，見表A.1。

表A.114種真菌毒素中文名稱及英文名稱、CAS號、分子式及相對分子量

序號中文名稱英文名稱CAS號分子式相對分子量

1黃曲霉毒素B1AflatoxinB11162-65-8C17H12O6312.27

2黃曲霉毒素B2AflatoxinB27220-81-7C17H14O6314.29

3黃曲霉毒素G1AflatoxinG11165-39-5C17H12O7328.27

4黃曲霉毒素G2AflatoxinG27241-98-7C17H14O7330.29

5伏馬毒素B1FumonisinB1116355-83-0C34H59NO15721.83

6伏馬毒素B2FumonisinB2116355-84-1C34H59NO14705.83

1422359-85-

7伏馬毒素B3FumonisinB3C34H59NO14705.83

0

8T-2毒素T-2toxin21259-20-1C24H34O9466.53

Sterigmatocyst

9雜色曲霉素10048-13-2C18H12O6324.28

in

10赭曲霉毒素AOchratoxinA303-47-9C20H18ClNO6403.813

11玉米赤霉烯酮Zearalenone17924-92-4C18H22O5318.36

12展青霉素Patulin