2025版高考生物二輪復(fù)習(xí)課件 易錯(cuò)點(diǎn)11 酶切位點(diǎn)的選擇

酶切位點(diǎn)的選擇易

錯(cuò)點(diǎn)11[名師支招]1.單酶切和雙酶切 (1)單酶切 ①過程：先用同一種限制酶切割載體和含目的基因的DNA分子，獲得帶有相同黏性末端或平末端的片段。再通過DNA連接酶連接平末端或相同的黏性末端，獲得重組質(zhì)粒。②缺點(diǎn)：單酶切時(shí)，目的基因和載體的所有接口都是相同的，所以容易出現(xiàn)目的基因反接或自身環(huán)化，如下圖所示。(2)雙酶切①過程：利用兩個(gè)不同限制酶切割目的基因和載體，使目的基因和載體均具有兩個(gè)不同的黏性末端，就可以避免反接，并減少自身環(huán)化的情況。②方向：插入位置前后分別要有啟動(dòng)子和終止子，保證目的基因的表達(dá)。2.酶切位點(diǎn)選擇 (1)不破壞目的基因和標(biāo)記基因：若在目的基因、標(biāo)記基因或其他重要結(jié)構(gòu)上有某酶切位點(diǎn)，為避免這些結(jié)構(gòu)被破壞，要避免使用相關(guān)的限制酶。(2)根據(jù)T－DNA片段選擇限制酶：若對(duì)Ti質(zhì)粒進(jìn)行操作，則酶切位點(diǎn)應(yīng)位于T－DNA片段上，才能在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞基因組上。(3)同尾酶的使用：同尾酶是指一組識(shí)別序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。比如限制酶MboⅠ(↓GATC)和BamHⅠ(G↓GATCC)就是一對(duì)同尾酶，NotⅠ(GC↓GGCCGC)和Bsp120Ⅰ(G↓GGCCC)也是同尾酶。盡管同尾酶切割的黏性末端相同，可以被DNA連接酶連接，但是由于兩端的序列不同，連接后的產(chǎn)物失去酶切位點(diǎn)，除非特殊情況，一般不會(huì)使用。[典例賞析]1.(2023·湖北卷，4)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)DA.若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D.若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落解析若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確；若用PvuⅠ酶切，重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；DNA凝膠電泳技術(shù)可以分離不同大小的DNA片段，重組質(zhì)粒的大小與質(zhì)粒不同，能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；SphⅠ的酶切位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因，重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯(cuò)誤。2.(2024·河北邯鄲模擬節(jié)選)植物內(nèi)生菌是指能夠定殖在植物細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)，并與植物建立共生關(guān)系的一類微生物。 (1)某酵母菌能分泌一種可高效降解纖維素的酶，這種酶由W基因編碼。為在放線菌中表達(dá)W基因，需以圖中質(zhì)粒為載體。W基因以乙鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA自身延伸的方向?yàn)開_______。注：圖中MfeⅠ與EcoRⅠ切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，其余不相同。5′→3′①很多啟動(dòng)子具有物種特異性，在質(zhì)粒中插入W基因，其上游啟動(dòng)子應(yīng)選擇________(填字母)。A.酵母菌啟動(dòng)子 B.芽孢桿菌啟動(dòng)子C.放線菌啟動(dòng)子C②應(yīng)使用限制酶_________________切割圖中質(zhì)粒，使用限制酶_________________切割圖中含W基因的DNA片段，以獲得能正確表達(dá)W基因的重組質(zhì)粒。(2)利用PCR技術(shù)對(duì)放線菌是否含有W基因進(jìn)行________水平鑒定，應(yīng)根據(jù)目的基因(W基因)兩端的堿基序列來設(shè)計(jì)________進(jìn)行擴(kuò)增。MfeⅠ、HindⅢEcoRⅠ、HindⅢ分子引物解析

(1)轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA自身延伸方向?yàn)?′→3′。①該基因工程是將酵母菌的W基因?qū)敕啪€菌，想讓W(xué)基因在放線菌中成功表達(dá)，應(yīng)當(dāng)選擇放線菌啟動(dòng)子。②按照選擇限制酶的原則綜合分析，MfeⅠ與EcoRⅠ切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，但MfeⅠ會(huì)破壞目的基因，所以質(zhì)粒使用限制酶MfeⅠ、HindⅢ切割，含W基因的DNA片段使用限制酶EcoRⅠ、HindⅢ切割。(2)PCR技術(shù)是DNA分子的體外復(fù)制技術(shù)，屬于分子水平。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增，應(yīng)根據(jù)目的基因兩端的堿基序列設(shè)計(jì)引物，使引物與模板鏈能特異性結(jié)合。3.(2024·河北邢臺(tái)模擬)二十碳五烯酸(EPA)能促進(jìn)體內(nèi)飽和脂肪酸代謝，具有降低血液黏稠度、預(yù)防心腦血管疾病的功效。研究人員利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)從海洋生物中提取了EPA合成途徑的關(guān)鍵基因pfaB，并將其導(dǎo)入酵母菌內(nèi)，通過酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)EPA。圖1和圖2分別是轉(zhuǎn)基因過程中使用的含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒?；卮鹣铝袉栴}：(1)根據(jù)圖1分析，利用PCR擴(kuò)增pfaB基因時(shí)，所選用的引物是_________________。在PCR儀中進(jìn)行n次循環(huán)，需要消耗___________個(gè)引物。(2)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)選擇___________________這兩種限制酶分別切割含目的基因的DNA和質(zhì)粒，采用雙酶切方法進(jìn)行切割的目的是______________________________________________________________。引物5和引物42n＋1－2BamHⅠ和HindⅢ避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化，防止目的基因與質(zhì)粒反向連接(3)據(jù)圖2分析，將基因表達(dá)載體導(dǎo)入酵母菌后，可用添加了____________的培養(yǎng)基對(duì)目的基因成功導(dǎo)入并表達(dá)的酵母菌進(jìn)行篩選。(4)采用PCR等技術(shù)可檢測pfaB基因是否插入酵母菌染色體中，得到的PCR產(chǎn)物一般通過________________來鑒定，DNA分子的遷移速率與__________________________________________________有關(guān)。氨芐青霉素瓊脂糖凝膠電泳

凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象解析

(1)利用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，子鏈的延伸方向是5′端→3′端，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)該包含酶切位點(diǎn)序列，所以選用的引物為引物5和引物4。一個(gè)DNA分子經(jīng)過n次復(fù)制形成2n個(gè)DNA，共含有2n＋1條鏈，除兩條親代的模板鏈外，剩下的每一條鏈的形成都需要消耗引物，所以需要消耗2n＋1－2個(gè)引物。(2)圖示分析：結(jié)合圖示分析可知，應(yīng)選擇限制酶BamHⅠ和HindⅢ分別切割含目的基因的DNA和質(zhì)粒。采用雙酶切的方法對(duì)含目的基因的DNA和質(zhì)粒進(jìn)行切割，可以避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化，防止目的基因與質(zhì)粒的反向連接。(3)由圖2可知