《船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅活有效性檢測(cè)規(guī)程》

ICST/CI×××—2024

CCS

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CIXXX—2024

船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅活有效

性檢測(cè)規(guī)程

Codefortestingtheeffectivenessofbiologicalinactivationinship

ballastwatermanagementsystems

（征求意見(jiàn)稿）

2024-X-X發(fā)布2024-X-X實(shí)施

中國(guó)國(guó)際科技1促進(jìn)會(huì)發(fā)布

T/CI×××—2024

船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅活有效性檢測(cè)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅活性能的采樣規(guī)程、L型和S型存活生物指示性

檢測(cè)規(guī)程和詳細(xì)檢測(cè)方法、菌落總數(shù)檢測(cè)規(guī)程、耐熱大腸桿菌檢測(cè)規(guī)程、大腸埃希氏菌檢測(cè)

規(guī)程、腸球菌檢測(cè)規(guī)程和有毒霍亂弧菌檢測(cè)規(guī)程。本文件適用于船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅

活性能的檢測(cè)與評(píng)估。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB5750.12-2023生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)

GB19489-2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB4789.38-2012食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)

GB17378.7海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第7部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測(cè)檢測(cè)方法

GB/T12763海洋調(diào)查規(guī)范第6部分：海洋生物調(diào)查

ASTMD5392-2014用兩步膜濾法分離和計(jì)數(shù)水中大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法

JT/T1393-2021船舶壓載水指示性分析取樣與檢測(cè)要求

SN/T1239-2015國(guó)境口岸霍亂檢驗(yàn)規(guī)程

HJ1215-2021水質(zhì)浮游植物的測(cè)定濾膜顯微鏡計(jì)數(shù)法

國(guó)際海事組織2004《國(guó)際船舶壓載水和沉積物管理與控制公約》（以下簡(jiǎn)稱壓載水公

約）

國(guó)際海事組織BWM.2/Circ.70《船舶壓載水管理系統(tǒng)調(diào)試測(cè)試指南》

國(guó)際海事組織MEPC,173(58)《G2導(dǎo)則船舶壓載水取樣導(dǎo)則》

國(guó)際海事組織MEPC74/INF.18《在船舶壓載水中指示性檢測(cè)有毒有害海洋生物可用設(shè)備

總結(jié)》

美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生基金會(huì)認(rèn)證EPA/600/R-10/146《壓載水處理技術(shù)驗(yàn)證通用協(xié)議》

1

T/CI×××—2024

ISO6222-1999水質(zhì)可培養(yǎng)微生物的計(jì)數(shù)方法營(yíng)養(yǎng)瓊脂介質(zhì)中接種法進(jìn)行群落計(jì)數(shù)

法

ISO9308-1-2014水質(zhì)—大腸埃希氏菌和大腸菌群計(jì)數(shù)——第一部分低細(xì)菌背景區(qū)系

水的膜過(guò)濾法

ISO7899-2-2000水質(zhì)—腸球菌的檢測(cè)和計(jì)數(shù)第2部分：膜過(guò)濾法

ISO8199-1988水質(zhì)—微生物培養(yǎng)計(jì)數(shù)通用指南

ISO5667-3-2012水質(zhì)—取樣—第三部分：水樣的處理與保存

3術(shù)語(yǔ)和定義

SN/T1239界定的術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件，下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1

船舶壓載水Ballastwater

為保持船舶具有一定吃水深度或調(diào)整船體平衡，以便保證船舶航行安全平穩(wěn)，而需泵入

艙內(nèi)、在裝貨時(shí)再自艙內(nèi)排出的水體。

3.2

壓載水管理系統(tǒng)Ballastwatermanagementsystem

用于清除、殺死壓載水中的生物或(在排放前)使其失去活性的預(yù)制、商用處理系統(tǒng)。供

應(yīng)商壓載水處理產(chǎn)品的整體將用于實(shí)現(xiàn)供應(yīng)商對(duì)處理效果或運(yùn)行性能的主張，并以集成的方

式包括所有組件。

3.3

處理水Treatedballastwater

壓載水管理系統(tǒng)處理后排出的水。

3.4

環(huán)境水Ambientwater

在測(cè)試時(shí)提供給處理系統(tǒng)的水。環(huán)境水須在特定的生物密度范圍和水質(zhì)參數(shù)內(nèi)，用于評(píng)

定處理設(shè)備全面運(yùn)行條件下的效能。

3.5

等動(dòng)力取樣Isokineticsamplecollection

從取樣口收集樣品的水流速度與主壓載管中的速度相對(duì)等的取樣方式。

2

T/CI×××—2024

3.6

存活生物Viableorganisms

存活生物為有機(jī)體和活著的所有生命階段，本標(biāo)準(zhǔn)中僅指浮游生物。

3.6.1L型存活生物

是指最小尺寸≥50μm的浮游動(dòng)物。

3.6.2S型存活生物

是指最小尺寸＜50μm且≥10μm的浮游生物。

3.7

浮游生物Plankton

懸浮于水中，體型微小，無(wú)運(yùn)動(dòng)能力或游動(dòng)能力很弱，不能主動(dòng)做長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)，只能被

動(dòng)地“隨波逐流”，主要包括浮游植物與浮游動(dòng)物。

3.8

最小尺寸Minimumsize

基于《壓載水公約》的描述，特指浮游生物的體長(zhǎng)、體寬和體高中最小的尺寸，浮游生

物的身體長(zhǎng)度、寬度和高度則是通過(guò)測(cè)量最大的部分來(lái)確定的。

L型存活生物的最小尺寸：浮游動(dòng)物的剛毛、刺、觸須等不包括在內(nèi)，L型存活生物的

最小尺寸為生物的體寬部分如下圖所示。

圖1L型浮游生物最小尺寸的測(cè)定（需畫(huà)平行線顯示體長(zhǎng)）

S型存活生物的最小尺寸：以單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)體的體寬為最小尺寸，如下圖所示。

3

T/CI×××—2024

圖2S型浮游生物的最小尺寸示意圖

3.9

脈沖-振幅-調(diào)制Pulse-Amplitude-Modulation（PAM）葉綠素?zé)晒鈾z測(cè)法

通過(guò)發(fā)射一系列微弱的光，脈沖誘導(dǎo)藻類細(xì)胞內(nèi)葉綠素發(fā)出熒光（F0）而不進(jìn)行光合作

用，之后以快速?gòu)?qiáng)光脈沖關(guān)閉所有光合細(xì)胞的電子門(mén)暫時(shí)抑制光合作用，從而使葉綠素?zé)晒?/p>

達(dá)到最大(Fm)，可變熒光Fv=Fm-F0，根據(jù)Fm和F0可以計(jì)算出光合系統(tǒng)PSII的最大量子產(chǎn)量

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm，它反映了浮游植物的潛在最大光合能力，即藻類的生理狀態(tài)。基于這種方

法可用來(lái)指示性檢測(cè)最小尺寸≥10μm且＜50μm（S型）浮游植物的活體數(shù)量。

3.10

活性熒光檢測(cè)法Activefluorescence

是將一定波長(zhǎng)的光照射到活的藻類細(xì)胞上后得到的活細(xì)胞中的葉綠素?zé)晒庑盘?hào)，基于這

種方法可用來(lái)指示性檢測(cè)最小尺寸≥10μm且＜50μm（S型）浮游植物的數(shù)量。

3.11

三磷酸腺苷Adenosinetriphosphate(ATP)熒光檢測(cè)法

在熒光素酶E（luciferase）和Mg2+的作用下，熒光素LH2（luciferin）與ATP發(fā)生腺

苷?；换罨?，活化后的熒光素LH2與熒光素酶E相結(jié)合，形成了熒光素—AMP復(fù)合體，并

放出焦磷酸（PPi）。該復(fù)合體被分子氧氧化，形成激發(fā)態(tài)復(fù)合物P*-E·AMP，放出CO2，當(dāng)

該復(fù)合物從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)發(fā)射光，并最終形成氧化蟲(chóng)熒光素P和AMP，其強(qiáng)度與生物密

度正相關(guān)，基于這種方法可用來(lái)指示性檢測(cè)最小尺寸≥50μm（L型）浮游生物，最小尺寸

≥10μm且＜50μm（S型）浮游生物的數(shù)量。

3.12

運(yùn)動(dòng)和熒光軌跡Motilityandfluorescenceassay（MFA）檢測(cè)法

4

T/CI×××—2024

根據(jù)浮游動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡成像后進(jìn)行智能計(jì)數(shù)，結(jié)合浮游植物自發(fā)熒光進(jìn)行檢測(cè)，基于這

種方法來(lái)示性檢測(cè)最小尺寸≥50μm（L型）存活生物，最小尺寸≥10μm且＜50μm（S

型）存活生物的數(shù)量。

3.13

指標(biāo)性微生物Indicatorbacteria

用以指示船舶壓載水衛(wèi)生狀況及安全性的指示性微生物，主要包括菌落總數(shù)、耐熱大腸

菌群、大腸埃希氏菌、腸球菌和有毒霍亂弧菌（O1和O139）。

3.14

菌落總數(shù)Aerobicplatecount

壓載水樣品經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等）培養(yǎng)后，所

得每mL檢樣中形成的菌落總數(shù)。

3.15

耐熱大腸菌群Fecalcoliforms

是指在44.5℃下培養(yǎng)24～48h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)

芽胞桿菌。

3.16

大腸埃希氏菌Escherichiacoli

又稱大腸桿菌，是廣泛存在于人和溫血?jiǎng)游锏哪c道中，需氧及兼性厭氧，44.5℃生長(zhǎng)，

IMViC（靛基質(zhì)、甲基紅、VP實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽）生化試驗(yàn)++--或-+--的革蘭氏陰性桿菌。

3.17

腸球菌Intestinalenterococci

一類革蘭氏陽(yáng)性球菌，兼性厭氧，無(wú)芽胞和莢膜，可分解膽汁七葉苷，是評(píng)估食品、水、

食品加工設(shè)備、食品生產(chǎn)環(huán)境等衛(wèi)生狀況的指標(biāo)菌之一。

3.18

有毒霍亂弧菌ToxicogenicVibriocholerae

革蘭氏陰性菌，菌體短小呈逗點(diǎn)狀，有單鞭毛、菌毛，部分有莢膜，共分為139個(gè)血清

群，其中O1群和O139群可引起霍亂。

5

T/CI×××—2024

4船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅活性能檢測(cè)采樣規(guī)程

4.1取樣信息收集

樣品采集前應(yīng)與船方或壓載水設(shè)備生產(chǎn)商充分了解壓載水管理系統(tǒng)型號(hào)與安裝信息，如

設(shè)備主管道是否有專用取樣口，取樣口的位置、直徑大小及類型，設(shè)備操作限制參數(shù)等，相

關(guān)信息見(jiàn)附錄A-1/A-2/A-3。

4.2取樣方案制定

根據(jù)船舶和設(shè)備基本信息，制定測(cè)試方案，其內(nèi)容至少包括：檢測(cè)時(shí)間、登輪地點(diǎn)、試

航線路、試航時(shí)間、返回?？康母劭凇y(cè)試艙位（標(biāo)明處理艙及對(duì)照艙）、壓載水處理設(shè)備

類型及安裝位置、檢測(cè)項(xiàng)目、取樣方式、檢測(cè)方法、計(jì)劃參與取樣和檢測(cè)的人員等，并填寫(xiě)

附錄A-1/A-2/A-3/A-4相關(guān)信息。

4.3取樣設(shè)備性能要求

4.3.1主要取樣器具組成

壓載水取樣設(shè)備應(yīng)包括管路連接單元、過(guò)濾與計(jì)量單元、樣品收集單元。

4.3.2主要取樣器具要求

取樣管路閥門(mén)建議使用隔膜閥，避免因調(diào)節(jié)流速而造成生物死亡，管路連接單元包含取

樣探頭與連接軟管；過(guò)濾與計(jì)量單元包含過(guò)濾裝置與流速流量監(jiān)控裝置，流量計(jì)需定期計(jì)量

和期間核查。

4.3.3濾網(wǎng)要求

取樣設(shè)備應(yīng)根據(jù)需要能對(duì)最小尺寸≥50μm存活生物（L型）樣品進(jìn)行收集，取樣設(shè)備

中所有接觸或接近壓載管路的部件應(yīng)具備防腐蝕性，過(guò)濾裝置濾網(wǎng)或?yàn)V膜孔徑對(duì)角線直徑應(yīng)

達(dá)到50μm，網(wǎng)孔孔徑需定期進(jìn)行計(jì)量和期間核查，每次取樣后濾網(wǎng)和管路需清洗干凈，

并進(jìn)行紫外滅菌20min。

4.4主要取樣耗材

4.4.1樣品袋：5L

4.4.2水樣瓶：1000mL

4.4.3無(wú)菌取水袋：500mL

4.4.4棕色玻璃瓶：250mL

4.4.5鹽度計(jì)精度1‰

6

T/CI×××—2024

4.4.6溫度計(jì)精度0.1℃

4.4.7潛水泵

4.5登輪取樣前準(zhǔn)備工作

4.5.1應(yīng)與代理人員或船方人員或設(shè)備商調(diào)試工程師溝通，了解船舶運(yùn)行情況，壓載水壓載

與卸載情況，壓載水處理系統(tǒng)運(yùn)行情況，確保船上設(shè)備及安全防護(hù)措施運(yùn)作正常，按照要求

填寫(xiě)附錄A-1/A-2/A-3船舶信息，壓載水信息，壓載水設(shè)備信息。

4.5.2加強(qiáng)與碼頭經(jīng)營(yíng)部門(mén)的聯(lián)系，在作業(yè)現(xiàn)場(chǎng)發(fā)出安全指令后方可登輪進(jìn)入作業(yè)現(xiàn)場(chǎng)。

4.5.3取樣作業(yè)人數(shù)至少2人，取樣人員應(yīng)按照要求穿戴好防護(hù)裝備，穿戴整齊后方可進(jìn)入

作業(yè)現(xiàn)場(chǎng)，如：安全繩、救生圈、防墜器、安全帽、護(hù)目鏡、勞保手套、聽(tīng)力護(hù)具、防護(hù)鞋、

登輪服。

4.5.4進(jìn)入特殊區(qū)域取樣時(shí)，宜參考相關(guān)國(guó)際公約的要求。

4.6樣品采集

取樣人員在排放點(diǎn)附近的排放管上進(jìn)行壓載水取樣。遇不能從排放管取樣的情況下，可

采用通過(guò)測(cè)深管、人孔和排水口等方式進(jìn)行取樣。

4.6.1壓載水管理系統(tǒng)主管路取樣

4.6.1.1處理水取樣時(shí)需與船方或設(shè)備調(diào)試工程師確認(rèn)處理水艙位以及處理時(shí)間是否已經(jīng)

達(dá)到設(shè)備技術(shù)指標(biāo)要求，檢查設(shè)備處理日志，如壓載水管理系統(tǒng)出現(xiàn)常見(jiàn)錯(cuò)誤類別需進(jìn)行現(xiàn)

場(chǎng)應(yīng)急處理，類別及處理方式詳見(jiàn)附錄B；

4.6.1.2取樣人員需拍攝設(shè)備銘牌、流量計(jì)初始數(shù)值，階段性取樣體積以及取樣后總體積數(shù)

值以備電子存檔，或使用執(zhí)法記錄儀開(kāi)展取樣監(jiān)督工作；

4.6.1.3壓載水主管路取樣等動(dòng)力取樣要求

在壓載水完全發(fā)展成湍流的狀態(tài)下，在排放管內(nèi)取樣，壓載水管理系統(tǒng)主管路取樣示意

圖如圖3所示。

7

T/CI×××—2024

圖3壓載水管理系統(tǒng)主管路取樣示意圖

取樣流速應(yīng)滿足國(guó)際海事組織MEPC,173(58)G2導(dǎo)則船舶壓載水取樣導(dǎo)則要求的等動(dòng)力

取樣，計(jì)算公式如下式所示，取樣平均流速不應(yīng)超過(guò)50L/min。

2

???

?????

Q為取樣流量，Q為壓載水主管?路排=放?流×量，D?為取樣管直徑，D為壓載水主管道排

isom?isom

放管直徑。因此，每次取樣時(shí)，取樣工程師應(yīng)提前獲悉壓載水設(shè)備主管道直徑，經(jīng)過(guò)現(xiàn)場(chǎng)換

算，攜帶合適尺寸的取樣設(shè)備管路，并通過(guò)隔膜閥調(diào)整合適的取樣流速，以達(dá)到等動(dòng)力取樣

要求。

4.6.1.4壓載水處理系統(tǒng)主管道出水口附近搭建取樣設(shè)備，可根據(jù)不同尺寸壓載水處理系統(tǒng)

取樣口，采用不同規(guī)格墊片與法蘭連接排水口與取樣設(shè)備通水管路或采用同等方式連接設(shè)備

通水管路。

4.6.1.5啟動(dòng)船舶壓載水處理設(shè)備，檢查其運(yùn)行情況，通過(guò)取樣管路上隔膜閥將流量調(diào)節(jié)至

合適流速運(yùn)行3-5min，清洗排放管路。

4.6.1.6待流量計(jì)歸零后，拍照取證，打開(kāi)壓載水處理系統(tǒng)采樣口閥門(mén)，正式取樣，在取樣

過(guò)程中，階段性從取樣管路中取具有代表性的≥10μm和<50μm（S型）生物樣品5-10L，

微生物樣品500mL，理化指標(biāo)樣品250mL，至少分3次取完S型生物樣品及微生物樣品。

4.6.1.7當(dāng)處理水取樣達(dá)到1000L后，關(guān)閉設(shè)備等動(dòng)力采樣口閥門(mén)，并拍照流量計(jì)取證；

如處理水取不到1000L，則需在附錄A取樣表格中進(jìn)行情況說(shuō)明。

4.6.1.8環(huán)境水取樣可通過(guò)調(diào)換艙室在對(duì)照艙通過(guò)設(shè)備主管路排放口進(jìn)行取樣，需更換取樣

濾網(wǎng)，如隨航取樣，則可通過(guò)舷邊使用隔膜泵進(jìn)行富集取樣。

4.6.1.9環(huán)境水取樣過(guò)程參考處理水，需更換濾網(wǎng)，取樣體積達(dá)到100L后，關(guān)閉設(shè)備等動(dòng)

力采樣口閥門(mén)，并拍照流量計(jì)取證。

4.6.2人孔取樣

4.6.2.1適用對(duì)象

（1）此方法適用于未安裝壓載水管理系統(tǒng)或系統(tǒng)出現(xiàn)故障，在壓載水頂邊艙和邊艙滿載

或較高水位時(shí)的樣品采集；

（2）壓載水艙人孔中取樣僅用于壓載水在艙內(nèi)或之前進(jìn)行了壓載水處理的情況；

（3）若壓載水處理中的任何過(guò)程是在壓載水排放期間進(jìn)行的，不應(yīng)在壓載水艙人孔中取

樣；

8

T/CI×××—2024

（4）盡可能靠近排放管路的排放點(diǎn)進(jìn)行取樣。

4.6.2.2采集程序

（1）由船方人員負(fù)責(zé)確認(rèn)并打開(kāi)位于甲板上的人孔蓋；

（2）人孔附近搭建取樣裝備，使用潛水泵連接取樣裝備，潛水泵放入人孔后，泵的吸入

管應(yīng)降低到不同深度采集不同水深樣品，取樣流程參考4.6.1。

4.6.3測(cè)深孔/空氣管中取樣

4.6.3.1適用對(duì)象

（1）此方法適用于未安裝壓載水管理系統(tǒng)或系統(tǒng)出現(xiàn)故障，壓載水頂邊艙和邊艙樣品采

集，自測(cè)量管處采集方法也適用于壓載水底邊艙和底艙的樣品采集；

（2）確保壓載水在測(cè)深管/空氣管內(nèi)外充分混合；

（3）船舶記錄簿記錄置換了壓載水時(shí)，應(yīng)謹(jǐn)慎使用測(cè)深管/空氣管取樣；

（4）非多孔測(cè)深管在置換過(guò)壓載水的情況下，管中的壓載水可能會(huì)沒(méi)有受到置換的影響，

導(dǎo)致無(wú)法滿足代表性取樣的要求。

4.6.3.2采集程序

（1）由船方人員打開(kāi)測(cè)量管/空氣管上蓋，用測(cè)量尺測(cè)定水深和水面高度；

（2）使用合適的潛水泵從測(cè)深空/空氣管中抽取壓載水樣品；如液面在操作部位以下10m

深及以下，不適合用負(fù)壓泵；

（3）測(cè)深孔/空氣管附近搭建取樣裝備，使用潛水泵連接取樣裝備，潛水泵放入人孔后，

泵的吸入管應(yīng)降低到不同深度采集不同水深樣品，取樣流程參考4.6.1。

4.6.4排水口取樣

4.6.4.1適用對(duì)象

此方法適用于壓載水頂邊艙有手動(dòng)排水口且便于采樣時(shí)的樣品采集，自測(cè)量管處采集方

法也適用于壓載水底邊艙和底艙的樣品采集。

4.6.4.2采集程序

（1）由船方人員打開(kāi)壓載水艙頂邊艙手動(dòng)排水閥門(mén)，排水3-5min。

（2）用采樣桶自甲板上墜下或自岸上送至排水口處下方接水。

4.7樣品保存、運(yùn)送

4.7.1樣品封存

9

T/CI×××—2024

采集樣品直接注入樣品瓶，根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目需求進(jìn)行必要現(xiàn)場(chǎng)預(yù)處理，貼標(biāo)簽，封口，樣

品標(biāo)簽需包括：船舶名稱、IMO號(hào)、樣品類別、取樣方式、取樣日期、取樣體積、檢測(cè)項(xiàng)目

等要素。

4.7.2樣品現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)

現(xiàn)場(chǎng)可利用鹽度計(jì)、溫度計(jì)等指示性檢測(cè)設(shè)備對(duì)樣品的溫度、鹽度進(jìn)行檢測(cè)，相關(guān)結(jié)果

填入附錄A-5。

4.7.3樣品運(yùn)輸

將樣品封存放入取樣包中，并由取樣人員快遞或?qū)＼囉?4h內(nèi)低溫（4℃±2℃）送達(dá)

實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展檢測(cè)，除有毒霍亂弧菌與理化樣品以外，其他樣品需存放在保溫箱或車載冰箱中。

5L型和S型存活生物指示性檢測(cè)規(guī)程

5.1檢測(cè)方法

指示性方法可選擇附錄C中的方法或根據(jù)實(shí)際的需要選擇其他合適的方法。

5.2指示性檢測(cè)設(shè)備要求

指示性檢測(cè)設(shè)備宜具備出廠檢測(cè)報(bào)告，設(shè)備使用說(shuō)明書(shū)，設(shè)備精度與誤差分析報(bào)告，歷

史檢測(cè)數(shù)據(jù)報(bào)告，詳細(xì)檢測(cè)數(shù)據(jù)偏離分析報(bào)告，第三方產(chǎn)品檢測(cè)報(bào)告。

5.3S型存活生物指示性檢測(cè)

5.3.1PAM分析法

基于PAM分析方法，對(duì)壓載水中≥10μm且＜50μm（S型）浮游植物進(jìn)行指示性檢測(cè)

分析，至少檢測(cè)3次及以上，檢測(cè)設(shè)備或推薦方法參見(jiàn)附錄C。

5.3.2活性熒光檢測(cè)法

基于活性熒光檢測(cè)法，對(duì)壓載水中≥10μm且＜50μm（S型）浮游植物進(jìn)行指示性檢

測(cè)分析，至少檢測(cè)3次及以上，檢測(cè)設(shè)備或推薦方法參見(jiàn)附錄C。

5.4L型和S型存活生物指示性檢測(cè)

5.4.1ATP分析法

基于ATP分析方法，對(duì)壓載水中L型和S型存活生物進(jìn)行指示性檢測(cè)分析，L型生物檢

測(cè)量不少于500mL，S型生物檢測(cè)量不少于200mL，至少檢測(cè)3次及以上，方法標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)

附錄C。

5.4.2MFA分析法

10

T/CI×××—2024

基于MFA分析方法，對(duì)壓載水中L型和S型存活生物進(jìn)行指示性檢測(cè)分析，L型生物檢

測(cè)量不少于600mL，S型生物檢測(cè)量不少于200mL，檢測(cè)1次，方法標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)附錄C。

5.5指示性檢測(cè)結(jié)果判定

《國(guó)際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)附錄E。

5.5.1PAM分析法

基于PAM分析法對(duì)S型生物的檢測(cè)，結(jié)果為PASS或者FAIL，檢測(cè)3次，以2次同樣結(jié)

果為最終記錄，如2次及以上為PASS，則判定S型生物符合《國(guó)際船舶壓載水與沉積物控

制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)，如2次及以上為FAIL，需開(kāi)展顯微鏡詳細(xì)檢測(cè)，如果詳細(xì)檢測(cè)依

然超標(biāo)，則判定S型生物不符合《國(guó)際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)，D-2

排放標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)附錄E。

5.5.2活性熒光檢測(cè)法

基于活性熒光檢測(cè)法對(duì)S型生物的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為RiskFail或者RiskHigh或者

RiskLow，檢測(cè)3次，以2次同樣結(jié)果為最終記錄，如2次及以上為RiskFail或者RiskHigh，

需開(kāi)展顯微鏡詳細(xì)檢測(cè)，如果詳細(xì)檢測(cè)依然超標(biāo)，則判定S型生物不符合《國(guó)際船舶壓載水

與沉積物控制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)，D-2排放標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)附錄E。

5.5.3ATP分析法

基于ATP分析法，對(duì)壓載水中L型和S型存活生物進(jìn)行指示性檢測(cè)分析，檢測(cè)結(jié)果為

MostLikelyCompliant或者SignalClosetoLimit或者M(jìn)ostLikelynotCompliant，

樣品檢測(cè)3次，以3次平均結(jié)果為最終記錄，如結(jié)果為SignalClosetoLimit或者M(jìn)ost

LikelynotCompliant，則需開(kāi)展顯微鏡詳細(xì)檢測(cè)，如果詳細(xì)檢測(cè)依然超標(biāo)，則判定L型和

S型存活生物不符合《國(guó)際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)；如3次平均結(jié)

果為MostLikelyCompliant，則判定L型和S型存活生物符合《國(guó)際船舶壓載水與沉積物

控制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)，排放標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)附錄E。

5.5.4MFA分析法

基于MFA分析法對(duì)壓載水中L型和S型存活生物進(jìn)行指示性檢測(cè)分析，檢測(cè)結(jié)果為Very

LowRisk或者LowRisk或者HighRisk，檢測(cè)1次，LowRisk或者HighRisk，則需開(kāi)展

顯微鏡詳細(xì)檢測(cè)，如果詳細(xì)檢測(cè)依然超標(biāo)，則判定L型和S型存活生物不符合《國(guó)際船舶壓

載水與沉積物控制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)；如檢測(cè)過(guò)VeryLowRisk，則判定L型和S型存

活生物符合《壓載水公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)，排放標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)附錄E。

11

T/CI×××—2024

5.5.5復(fù)驗(yàn)

因船舶壓載水中存活生物可能隨著時(shí)間的推移進(jìn)行不斷繁殖、再生或死亡，因此其數(shù)量

一直是動(dòng)態(tài)變化的，壓載水樣品不接受復(fù)驗(yàn)。

5.6結(jié)果記錄

原始檢測(cè)記錄應(yīng)包括樣品編號(hào)、樣品名稱、檢測(cè)日期和時(shí)間、檢測(cè)方法、儀器設(shè)備、檢

測(cè)結(jié)果、檢測(cè)人、復(fù)核日期、復(fù)核人等內(nèi)容，指示性檢測(cè)結(jié)果均需保留電子圖片存檔，以備

復(fù)查溯源。

5.7質(zhì)量控制

定期每季度進(jìn)行陽(yáng)性及陰性對(duì)照試驗(yàn)。將培養(yǎng)的浮游生物制成100-200cells/mL的懸

浮液，鏡檢后對(duì)指示性檢測(cè)設(shè)備按照操作程序進(jìn)行陽(yáng)性試驗(yàn)。陰性對(duì)照則使用純凈水進(jìn)行，

如陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果不符合要求，則應(yīng)查明原因后重新調(diào)試設(shè)備。6L型與S型

存活生物顯微鏡詳細(xì)檢測(cè)規(guī)程

6L型存活生物詳細(xì)檢測(cè)規(guī)程

6.1檢測(cè)原理

直接觀察法：通過(guò)顯微鏡觀察L型生物，當(dāng)生物體的某部分被嚴(yán)重破壞時(shí)，該生物體被

判定為不可存活；對(duì)于形態(tài)完整但是不動(dòng)的浮游動(dòng)物，可以觀察器官活動(dòng)（如心跳）判斷其

存活/死亡；如不能觀察器官活動(dòng)，則可用解剖針輕輕戳動(dòng)，看其是否有反應(yīng)，如無(wú)反應(yīng)則

判斷為死亡，記錄活體數(shù)量的方法。

差減法：通過(guò)顯微鏡觀察L型生物，當(dāng)生物體的某部分被嚴(yán)重破壞時(shí)，該生物體被判定

為不可存活；對(duì)于形態(tài)完整但是不動(dòng)的浮游動(dòng)物，可以觀察器官活動(dòng)（如心跳）判斷其存活

/死亡；如不能觀察器官活動(dòng)，則可用解剖針輕輕戳動(dòng)，看其是否有反應(yīng)，如無(wú)反應(yīng)則判斷

為死亡。差減法為先計(jì)數(shù)死亡個(gè)體，再使用滴管加幾滴魯哥氏試劑到計(jì)數(shù)框內(nèi)，將樣品固定，

再計(jì)數(shù)全體死亡個(gè)體數(shù)，兩個(gè)計(jì)數(shù)相減的數(shù)量為活體數(shù)量的個(gè)數(shù)。

6.1.1主要設(shè)備、器具

（1）倒置顯微鏡或體視顯微鏡（物鏡4×、10×、20×、40×；目鏡1×）

（2）浮游動(dòng)物計(jì)數(shù)框(80mm×100mm，22mL)

（3）計(jì)數(shù)器

（4）電動(dòng)加樣管：量程20mL

（5）燒杯

12

T/CI×××—2024

6.1.2主要試劑及其配置

6.1.2.1試劑

碘化鉀（KI，分析純），碘（I2，分析純）

6.1.2.2配置

魯哥氏試劑：6g碘化鉀（KI）溶于少量水中（10mL-20mL），待其完全溶解后，加

入4g碘（I2）充分搖動(dòng)，待碘完全溶解后定容到100mL。

6.1.3L型存活生物活體計(jì)數(shù)

6.1.3.1準(zhǔn)備工作

L型存活生物樣品送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，用量筒計(jì)量樣品瓶中壓載水濃縮后的體積（V1），每

次取20mL樣品作為一個(gè)子樣品，根據(jù)表1數(shù)量水平選擇不同的檢測(cè)方法，根據(jù)樣品應(yīng)在取

樣后24h內(nèi)開(kāi)展檢測(cè)工作。

6.1.3.2樣品初篩

可先觀察一個(gè)浮游生物計(jì)數(shù)框的活體生物數(shù)量，預(yù)估L型活體生物的數(shù)量，如活體生物

個(gè)體低于2個(gè)則為低數(shù)量水平，2-20個(gè)為中數(shù)量水平，超過(guò)20個(gè)則為高數(shù)量水平，低數(shù)量

水平推薦計(jì)數(shù)片數(shù)為10片，中數(shù)量水平為5片，高數(shù)量水平則為3片，如表1所示：

表1L型存活生物推薦計(jì)數(shù)片數(shù)及方法

水平推薦計(jì)數(shù)片數(shù)推薦計(jì)數(shù)方法

高數(shù)量水平（>100inds./m3）3片差減法/直接觀察法

中數(shù)量水平（10inds./m3-100inds./m3）5片差減法/直接觀察法

低數(shù)量水平（<10inds./m3）10片差減法/直接觀察法

6.1.3.3樣品檢測(cè)

（1）直接觀察法

A.將瓶中樣品輕輕上下顛倒若干次搖勻；

B.迅速用電動(dòng)定量加樣管取20mL樣品注入浮游動(dòng)物計(jì)數(shù)框內(nèi)，在倒置或體視顯微鏡

下計(jì)數(shù)存活的數(shù)量（nL1），檢測(cè)浮游動(dòng)物計(jì)數(shù)框移動(dòng)方式如圖4所示；

13

T/CI×××—2024

圖4浮游動(dòng)物計(jì)數(shù)框在顯微鏡視野下的移動(dòng)方式示意圖

C.當(dāng)生物體的某部分被嚴(yán)重破壞時(shí)，該生物體被判定為不存活；對(duì)于形態(tài)完整但是不

動(dòng)的浮游動(dòng)物，可以觀察器官活動(dòng)（如心跳）判斷其存活/死亡；如不能觀察器官活動(dòng)，則

可用解剖針輕輕戳動(dòng)，看其是否有反應(yīng)，如無(wú)反應(yīng)則判斷為死亡；

D.每個(gè)樣品平均單片存活生物個(gè)體數(shù)按如下計(jì)算公式來(lái)計(jì)算。

計(jì)算公式：?jiǎn)纹婊钌飩€(gè)數(shù)平均數(shù)為NL=(NL1+NL2+NL3+....NLm)/m；

NL為平均單片L型存活生物個(gè)體數(shù)，單位為inds./片；NL1，NL2，NL3，NLm為第1片，第2

片，第3片，....第m片上L型存活生物個(gè)體數(shù)，單位為inds.；m為計(jì)數(shù)片數(shù)；單片體積

數(shù)為20mL。

（2）差減法

A.將瓶中樣品輕輕上下顛倒若干次搖勻；

B.用電動(dòng)加樣管取20mL瓶中樣品注入浮游動(dòng)物計(jì)數(shù)框內(nèi)，在倒置或體視顯微鏡下計(jì)

數(shù)已死亡的L型生物（Nd(Dead)），檢測(cè)存活生物框轉(zhuǎn)動(dòng)如圖4所示；

C.當(dāng)生物體的某部分被嚴(yán)重破壞時(shí)，該生物體被判定為不存活；對(duì)于形態(tài)完整但是不

動(dòng)的浮游動(dòng)物，可以觀察器官活動(dòng)（如有心跳）判斷存活；如不能觀察器官活動(dòng)，則可用浮

游動(dòng)物解剖針輕輕戳動(dòng)，看其是否有反應(yīng)，如無(wú)反應(yīng)則判斷為死亡；

D.先計(jì)數(shù)死亡個(gè)體Nd，再使用滴管加幾滴魯哥氏試劑到計(jì)數(shù)框內(nèi)，將樣品固定，再按

照如下計(jì)算公式，計(jì)數(shù)全體Nt(Total)個(gè)體數(shù)；

計(jì)算公式：?jiǎn)纹婊钌飩€(gè)體數(shù)NL=Nt(Total)-Nd(Dead);

單片存活生物平均個(gè)數(shù)NL，參考計(jì)算公式2：

單片存活生物個(gè)數(shù)平均數(shù)為NL=(NL1+NL2+NL3+....NLm)/m；

14

T/CI×××—2024

NL為平均單片L型存活生物個(gè)體數(shù)，單位為inds./片；NL1，NL2，NL3，NLm為第1片，第2

片，第3片，....第m片上L型存活生物個(gè)體數(shù)，單位為inds.；m為計(jì)數(shù)片數(shù)；單片體積

數(shù)為20mL。

注：第三片計(jì)算結(jié)果和前兩片的平均數(shù)之差如不大于其均數(shù)的±20%，其均數(shù)視為有效

結(jié)果，否則必須再測(cè)一片，直至三片數(shù)值與前兩片平均數(shù)之差不超過(guò)平均數(shù)的20%為止，即

可視為有效平均計(jì)數(shù)結(jié)果。

6.1.3.4計(jì)算

3

每m壓載水樣品中L型存活生物個(gè)體數(shù)量DL可參考如下公式計(jì)算：

計(jì)算公式：

DL(inds./m3)=（NL×V1）/（V2×V3）

式中：NL為每個(gè)樣品平均單片存活生物個(gè)體數(shù)（inds./片）；V1為濃縮樣體積（mL）；

3

V2為計(jì)數(shù)體積（20mL）；V3為采樣量（m）。

6.2S型存活生物詳細(xì)檢測(cè)規(guī)程

6.2.1檢測(cè)原理

雙熒光染色法（CMFDA/FDA），其中FDA是熒光素二乙酸酯，英文全稱是Fluorescein

Diacetate，CMFDA是5-氯甲酸熒光素酯是FDA的氯甲基衍生物，英文全稱

5-chloromethy-lfluoresceindiacetate，這兩種是可自由透過(guò)活細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞進(jìn)行示蹤

的熒光染料。具細(xì)胞膜滲透性，無(wú)色，不具有熒光發(fā)光性。當(dāng)通過(guò)被動(dòng)運(yùn)輸穿透細(xì)胞膜進(jìn)入

活細(xì)胞后，CMFDA中的親脂性基團(tuán)可被胞漿內(nèi)非特異性酯酶水解，生成5-氯甲基熒光素

（5-chloromethylfluorescein）；5-氯甲基熒光素可發(fā)出綠色熒光，因帶電荷而不能自由

穿透細(xì)胞膜，并利用自身氯甲基與細(xì)胞內(nèi)蛋白和多肽中的谷胱甘肽在谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶作

用下生成加合物，能完好地保留在胞內(nèi)。經(jīng)CMFDA/FDA標(biāo)記的細(xì)胞，在465nm-495nm波段

下可激發(fā)穩(wěn)定的熒光，穩(wěn)定標(biāo)記的時(shí)間可達(dá)數(shù)天（至少3d），可用于S型細(xì)胞的活體計(jì)數(shù)。

6.2.2主要設(shè)備、器具

（1）正置或倒置熒光顯微鏡（可激發(fā)465nm-495nm波段）

（2）浮游植物計(jì)數(shù)框（50mm×20mm×1mm，1mL）

（3）計(jì)數(shù)器

（4）移液槍：量程1mL，10μL

（5）燒杯：500mL

15

T/CI×××—2024

（6）離心管：1.5mL

6.2.3主要試劑及其配置

6.2.3.1試劑

熒光素二乙酸酯（FDA），5-氯甲酸熒光素酯（CMFDA），二甲基亞砜（DMSO）

6.2.3.2CMFDA的配制

（1）將50μg的CMFDA，加入430μL的二甲基亞砜（DMSO）并渦旋混勻，配制成

濃度為250μM的CMFDA存儲(chǔ)液，避光；

（2）通過(guò)移液槍，將存儲(chǔ)液等分成100μL每份，保存在1.5mL的離心管中；

（3）每管貼上標(biāo)簽，注明復(fù)溶日期和濃度，-20℃，避光保存；

（4）每次用完后仍需重新-20℃，避光保存。

6.2.3.3FDA的配制

（1）取100mg的FDA溶于4.8mL的DMSO中，配制成濃度為50mM的FDA準(zhǔn)備液；

（2）取10μL的50mMFDA準(zhǔn)備液，溶于990μL的二甲基亞砜DMSO中，制成濃

度為500μM的FDA儲(chǔ)存液；

（3）通過(guò)移液槍，將存儲(chǔ)液等分成100μL每份，保存在1.5mL的離心管中；每管

貼上標(biāo)簽，注明復(fù)溶日期和濃度，-20℃避光保存。

（4）每次用完后仍需重新保存在-20℃避光保存。

6.2.4S型存活生物計(jì)數(shù)

6.2.4.1準(zhǔn)備工作

S型存活生物樣品送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，采用CMFDA和FDA雙熒光染料進(jìn)行染色，并使用1mL

浮游植物計(jì)數(shù)框在熒光顯微鏡激發(fā)光465-495nm下進(jìn)行染色細(xì)胞計(jì)數(shù)，樣品應(yīng)在取樣后24

h內(nèi)開(kāi)展檢測(cè)工作。

預(yù)估樣品密度水平，選擇生物分布較為平均的視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，視野中計(jì)數(shù)10個(gè)格子，

如活體細(xì)胞總數(shù)小于10，則為低密度水平；如計(jì)數(shù)10-100個(gè)活體細(xì)胞總數(shù)，則為中密度水

平，大于100個(gè)活體細(xì)胞的為高密度水平，參考表2開(kāi)展推薦計(jì)數(shù)條數(shù)計(jì)算。

表2S型存活生物推薦浮游植物框計(jì)數(shù)方法

S型存活樣品預(yù)估密度水平推薦計(jì)數(shù)條數(shù)

高密度水平（>103cells/mL）3條法計(jì)數(shù)（2、5、8條）

16

T/CI×××—2024

中密度水平（102cells/mL-103cells/mL）5條法計(jì)數(shù)（2、4、6、8、10條）

低密度水平（<102cells/mL）全片計(jì)數(shù)

6.2.4.2檢測(cè)

（1）將水袋中S型生物樣品輕輕顛倒，再倒入500mL燒杯中，用1000μL移液槍吸取

S型尺寸樣品980μL于1.5mLEP管中，分別再加入10μL的500μM的FDA工作液和

10μL250μM的CMFDA工作液，使FDA的終濃度為5μM，CMFDA的終濃度為2.5μM，

避光染色10min；

（2）將染色后樣品輕輕搖勻，用移液槍將樣品加入1mL計(jì)數(shù)框內(nèi)，在激發(fā)波長(zhǎng)為465

nm-495nm的熒光顯微鏡下，4倍或10倍物鏡下分別計(jì)數(shù)被FDA和CMFDA著色的S型尺寸活

體細(xì)胞數(shù)，被染色的生物體、運(yùn)動(dòng)的生物體或被染色同時(shí)運(yùn)動(dòng)的生物體都被視為存活生物，

并用顯微鏡軟件測(cè)量存活生物細(xì)胞的最小尺寸，如圖5所示；

圖5雙熒光染色后顯微鏡視野下活體細(xì)胞示例圖

（3）染色后樣品應(yīng)在20min內(nèi)檢測(cè)完畢，以防熒光信號(hào)減弱；參考HJ1215水質(zhì)浮游

植物的測(cè)定濾膜顯微鏡計(jì)數(shù)法，檢測(cè)時(shí)注意視野范圍內(nèi)細(xì)胞參照?qǐng)D5Whipple視野計(jì)數(shù)約定

規(guī)則，即：視野中處于下邊界及右邊界線的細(xì)胞計(jì)入總數(shù)，處于上邊界及左邊界線的細(xì)胞不

計(jì)入總數(shù)，如圖6所示。若出現(xiàn)絲狀體等較大個(gè)體顯著穿過(guò)兩個(gè)或多個(gè)格子的邊界時(shí)，應(yīng)在

低倍鏡下單獨(dú)計(jì)數(shù)，再計(jì)入總數(shù)；

圖6Whipple視野計(jì)數(shù)約定規(guī)則示意圖

17

T/CI×××—2024

（4）若單個(gè)視野中生物體過(guò)多，參考表2計(jì)數(shù)方法，可采用長(zhǎng)條計(jì)數(shù)法，選取兩相鄰刻

度從計(jì)數(shù)框左邊一直計(jì)數(shù)到計(jì)數(shù)框右邊稱為一個(gè)長(zhǎng)條。如樣品細(xì)胞數(shù)為高密度水平，則計(jì)數(shù)

3條，即第2、5、8條，單片細(xì)胞密度為3條計(jì)數(shù)數(shù)量除以計(jì)數(shù)條數(shù)；若樣品細(xì)胞數(shù)為中密

度水平，則計(jì)數(shù)五條，即第2、4、6、8、10，單片細(xì)胞密度為5條計(jì)數(shù)數(shù)量除以計(jì)數(shù)條數(shù)；

若生物體密度為低密度水平，則應(yīng)全片計(jì)數(shù)，破損細(xì)胞不計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)宜緩慢移動(dòng)顯微鏡載

物臺(tái)，如圖7所示，一般檢測(cè)片數(shù)為3片。

圖7顯微鏡視野在浮游植物框下移動(dòng)示意圖

（5）對(duì)于S型存活生物每mL細(xì)胞密度DS，參考如下計(jì)算公式：

計(jì)算公式：DS=(NS1+NS2+NS3)/3

式中：NS1為第1片計(jì)數(shù)細(xì)胞密度（cells/mL）；NS2為第2片計(jì)數(shù)細(xì)胞密度（cells/mL）；

NS3為第3片計(jì)數(shù)細(xì)胞密度（cells/mL）。

注：第三片計(jì)算結(jié)果和前兩片的平均數(shù)之差如不大于其均數(shù)的±20%，其均數(shù)視為有效

結(jié)果，否則必須再測(cè)一片，直至三片數(shù)值與前兩片平均數(shù)之差不超過(guò)均數(shù)的20%為止，即可

視為有效平均計(jì)數(shù)結(jié)果。

6.3原始記錄

原始檢測(cè)記錄應(yīng)包括樣品編號(hào)、樣品名稱、檢測(cè)日期和時(shí)間、檢測(cè)方法、儀器設(shè)備、檢

測(cè)結(jié)果、檢測(cè)人、復(fù)核日期、復(fù)核人等內(nèi)容，如樣品檢測(cè)不合格，則需對(duì)存活生物保存至少

10張帶標(biāo)尺圖片，保存的照片應(yīng)帶有系統(tǒng)自帶的標(biāo)尺和日期，以供溯源。

6.4結(jié)果報(bào)告

數(shù)量/細(xì)胞計(jì)數(shù)≤10個(gè)時(shí)，以實(shí)際數(shù)量報(bào)告；數(shù)量/細(xì)胞計(jì)數(shù)＞10個(gè)且≤100個(gè)時(shí)，以

整數(shù)報(bào)告；如＞于100個(gè)時(shí)，將第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，

后面用0代替位數(shù)，也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位

有效數(shù)字。

18

T/CI×××—2024

6.5結(jié)果判定

6.5.1最小尺寸≥50μm（L型）存活生物結(jié)果不符合附錄ED-2排放標(biāo)準(zhǔn)，則判定該壓載

水不合格，按照相應(yīng)法律、法規(guī)、部門(mén)規(guī)章等進(jìn)行處置。

6.5.2最小尺寸＜50μm且≥10μm（S型）存活生物結(jié)果不符合附錄ED-2排放標(biāo)準(zhǔn)，則

判定為該壓載水不合格，按照相應(yīng)法律、法規(guī)、部門(mén)規(guī)章等進(jìn)行處置。

6.5.3《國(guó)際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)附錄E。

6.6復(fù)驗(yàn)

因存活生物樣品24h內(nèi)檢驗(yàn)完畢，因此當(dāng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果中的某一項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果不符合

檢驗(yàn)依據(jù)的要求時(shí)，樣品不接受復(fù)驗(yàn)。

7菌落總數(shù)檢測(cè)規(guī)程

7.1檢驗(yàn)原理

將待測(cè)樣品原液或經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀

釋樣液涂布到平板上，經(jīng)過(guò)指定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)

的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞；統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣

接種量即可換算出樣品中的菌落總數(shù)。

7.2設(shè)備和材料

電子天平、抽濾裝置、0.45μm無(wú)菌濾膜、鑷子、量筒、恒溫培養(yǎng)箱、接種針、接種

環(huán)、酒精燈、培養(yǎng)皿等。

7.3培養(yǎng)基和試劑

7.3.1營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（g/L）

組分質(zhì)量

蛋白胨10.0g

牛肉膏3.0g

氯化鈉5.0g

瓊脂15.0-20.0g

將上述成分或商品化粉末，用1000mL去離子蒸餾水重懸，攪拌均勻，經(jīng)121℃高壓蒸

汽滅菌20min，冷卻至45-50°C倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基最終pH值應(yīng)為7.2±0.2，在

4℃避光條件下保存，兩周有效。

7.3.2無(wú)菌水：取適量實(shí)驗(yàn)用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。

7.3.310%Na2S2O3：稱取15.7g硫代硫酸鈉，定容100mL水中，滅菌。

19

T/CI×××—2024

7.4檢驗(yàn)程序

7.4.1水樣前處理

若電解原理的壓載水處理設(shè)備產(chǎn)生的樣品，則水樣含有活性氯成分，需在收到樣品后根

據(jù)樣品體積加入10%濃度Na2S2O3溶液，以除去活性氯對(duì)細(xì)菌的抑制作用（每125mL容積加

入0.1mL的Na2S2O3溶液，若500mL水樣則加入0.4mL的Na2S2O3溶液），在24h以內(nèi)處

理采集樣品。

7.4.2梯度稀釋

使用無(wú)菌容器進(jìn)行稀釋，設(shè)置2-3個(gè)梯度，每個(gè)梯度2-3個(gè)平行。根據(jù)不同類別水樣壓

載地點(diǎn)，樣品稀釋度可以參考表3，梯度稀釋可使用50mL原液加入450mL無(wú)菌水中。

表3樣品稀釋度參考表

樣品類型樣品狀態(tài)110-110-210-3

處理前▲▲▲

公海水

處理后▲▲▲

處理前▲▲▲

港口水

處理后▲▲▲

7.4.3接種

以無(wú)菌操作方式用1mL滅菌移液槍吸取充分混勻的樣品或稀釋樣品1mL，注入滅菌平

皿中，傾注15-20mL冷卻到44-47℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋搖平皿，使樣品或稀釋

樣品與培養(yǎng)基充分混勻，每個(gè)樣品或稀釋樣品傾注2個(gè)平皿。

7.4.4培養(yǎng)

待平皿內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底面向上（避免因表面水分凝結(jié)

而影響細(xì)菌均勻生長(zhǎng)），其中一組在36℃±2℃條件下，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)44±4h，另一

組是22℃±2℃培養(yǎng)68±4h后觀察結(jié)果。

7.4.5空白對(duì)照

用無(wú)菌水做實(shí)驗(yàn)室空白測(cè)定，培養(yǎng)后平皿上不得有菌落生長(zhǎng)，否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果

無(wú)效，應(yīng)查明原因后重新測(cè)定。

7.5計(jì)數(shù)

7.5.1計(jì)數(shù)規(guī)則

20

T/CI×××—2024

作平皿菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用眼睛直接觀察，必要時(shí)使用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各

平皿的菌落數(shù)后，應(yīng)求出不同稀釋度的平均菌落數(shù)，供下一步計(jì)算時(shí)應(yīng)用。平皿上有較大片

狀菌落超過(guò)平皿一半時(shí)，該平皿不參加計(jì)數(shù)。片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半菌落分

布又很均勻時(shí)，將此分布均勻的菌落計(jì)數(shù)。

片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半菌落分布又很均勻時(shí)，將此分布均勻的菌落計(jì)數(shù)，

并乘以2代表全皿菌落總數(shù)。

外觀（形態(tài)或顏色）相似，距離相近卻不相觸的菌落，只要它們之間的距離不小于最小

菌落的直徑，予以計(jì)數(shù)。緊密接觸而外觀相異的菌落，予以計(jì)數(shù)。

若未能及時(shí)觀察，可5±3℃溫度保存，48h內(nèi)計(jì)數(shù)。

7.5.2不同稀釋度的選擇及報(bào)告方式

（1）首先選擇平均菌落數(shù)在30-399之間者進(jìn)行計(jì)算，若只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符

合此范圍時(shí)，則將該菌落乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表4中實(shí)例1）。

（2）若有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在30-300之間，則視二者之比值來(lái)決定，若其

比值小于2應(yīng)報(bào)告兩者的平均數(shù)（如表4中實(shí)例2）。若大于2則報(bào)告其中稀釋度較小的菌

落總數(shù)（如表4中實(shí)例3）。若等于2亦報(bào)告其中稀釋度較小的菌落數(shù)（見(jiàn)表4中實(shí)例4）。

（3）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)以按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀

釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表4中實(shí)例5）。

（4）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)以按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋

倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表4中實(shí)例6）。

（5）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，則應(yīng)以最接近30或300的平均菌

落乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表4中實(shí)例7）。

（6）若所有稀釋度的平板上均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以未檢出報(bào)告之。

（7）如果所有平板上都有菌落密布，不要用“多不可計(jì)”報(bào)告，而應(yīng)在稀釋度最大的平

板上，任意數(shù)其中2個(gè)平板1cm2中的菌落數(shù)，除2求出每cm2內(nèi)平均菌落數(shù)，乘以皿底面

積63.6cm2，再乘以其稀釋倍數(shù)作報(bào)告。

（8）菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)按實(shí)有數(shù)報(bào)告，大于100時(shí)，采用兩位有效數(shù)

字，在兩位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計(jì)算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)也可用

10的指數(shù)來(lái)表示（見(jiàn)表4報(bào)告方式欄）。

表4稀釋度選擇及菌落總數(shù)報(bào)告方式

21

T/CI×××—2024

實(shí)不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個(gè)稀釋度菌落總數(shù)/報(bào)告方式（CFU/mL）

例10-110-210-3菌落數(shù)之比（CFU/mL）

1136516420——1640016000或1.6×104

22760295461.63775038000或3.8×104

32890271602.22710027000或2.7×104

4150308215001500或1.5×103

5多不可計(jì)1650513——5130051000或5.1×104

627115——270270或2.7×102

7多不可計(jì)305123020031000或3.1×104

8耐熱大腸桿菌檢測(cè)規(guī)程

8.1檢測(cè)原理

耐熱大腸桿菌Thermotolerantcoliforms又稱糞大腸菌群(FecalColiforms)，44.5℃

培養(yǎng)24h，能在mTEC擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并形成黃色菌落的腸桿菌科細(xì)菌。

8.2設(shè)備和耗材

電子天平、抽濾裝置、0.45μm無(wú)菌濾膜、鑷子、量筒、恒溫培養(yǎng)箱、接種針、接種

環(huán)、酒精燈等。

8.3培養(yǎng)基和試劑配置

（1）mTEC培養(yǎng)基（g/L）

組分含量

乳糖10.0g

氯化鈉7.5g

月示蛋白胨5.0g

磷酸氫二鉀3.3g

酵母提取物3.0g

X-Gluc0.5g

SDS0.2g

22

T/CI×××—2024

脫氧膽酸鈉0.1g

瓊脂15.0g

將上述成分或商業(yè)化產(chǎn)品粉末稱取