DB37T 4415-2021 β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鑒定及牛奶中β-乳球蛋白的檢測技術(shù)　　

37Detectionofβ-lactoglobulingeneknockoutcowandβ-lactoglobulinincow'smilkI本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定高亞平、劉文浩、王金鵬、楊春紅、李彥芹、宋明智、1β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鑒定及牛奶中β-乳球蛋白的檢測技術(shù)本文件確立了β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛的定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（P奶中β-乳球蛋白（BLG）的定性免疫印跡（Western-Blot本文件適用于β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛以及牛奶中βGB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測GB/T27642—2011牛個(gè)體及親子鑒定微衛(wèi)星DNNY/T1663—2008乳與乳制品中β-乳球蛋白的測定聚丙烯酰胺凝膠電泳法NY/T1672—2008綿羊多胎主效基因FecB分子檢測技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T2695—2015牛遺傳缺陷基因檢測技術(shù)規(guī)程SN/T2497.16—2010進(jìn)出口危險(xiǎn)化學(xué)品安全試驗(yàn)方法第16部分：Western-Bl農(nóng)業(yè)部2031號(hào)公告-14-2013轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品成分檢測普通牛(Bostaurus)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因牛β-乳球蛋白基因Bostaurusβ-lactoglobulBLG基因（NCBIReferencesequence:NC_037338.1簡稱PAEP，來源于普通牛（Bostaurus4聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法-基因定性通過設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增出包含牛BLG基因全長的DNA片段，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。依據(jù)BLG基24.2試劑或材料4.3儀器設(shè)備4.3.1PCR擴(kuò)增儀：溫度范圍4℃~99℃,溫度梯度范圍20℃,模塊單元96×0.2mL。4.3.6高壓滅菌鍋：使用溫度范圍45℃~135℃4.3.7微波爐。4.4樣品4.5試驗(yàn)步驟基因組DNA提取按照GB/T27642—2011DNA濃度和純度檢測按照NY/T1672—2008中7.3的規(guī)定執(zhí)行。3按照NY/T2695—2015中6.44.5.5測序分析4.6結(jié)果判定與表述4.6.1對(duì)照檢測結(jié)果分析4.6.2樣品檢測結(jié)果判定和表述5免疫印跡（Western-Blot）法-蛋白定性檢測對(duì)預(yù)處理的牛奶樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，使用牛β-乳球蛋白特異性第一抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行檢測，根據(jù)條帶位置和著色5.2試劑或材料）：45.2.815%SDS分離膠（5mL）：1.1mL蒸餾水，2.5mL30%丙烯酰胺溶液，1.3mL1.5MTris-HCl(pH8.8)，0.05mL10%SDS，0.05mL10%過5.2.95%SDS濃縮膠（2mL）：1.4mL蒸餾水，0.33mL30%丙烯酰胺溶液，0.25mL1.0MTris-HCl(pH6.8)，0.02mL10%SDS，0.02mL10%過）：）：）：5.3儀器設(shè)備5.3.3高壓滅菌鍋：使用溫度范圍45℃~1355.3.4金屬水浴鍋：控溫范圍-10℃~100℃。5.4樣品稱取固態(tài)樣品5g，加適量水溶解，定容至50mL，5.5試驗(yàn)步驟-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，加入5×SDS加樣緩沖液，100℃水浴10min。55.5.4轉(zhuǎn)膜按照SN/T2497.16—2010中轉(zhuǎn)5.5.5封閉在自封袋中加入適當(dāng)比例稀釋的兔抗牛β-乳球蛋白一抗抗體，放入PVDF膜，排凈氣泡后封口，室溫水平搖動(dòng)2h。5.5.7洗膜封口，室溫水平搖動(dòng)1h。5.5.9洗膜5.5.10顯影5.6結(jié)果判定與表述β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品檢測到預(yù)期大?。?8kD）的條帶，空白和陰性對(duì)照無特異性條帶，則表明量處出現(xiàn)和β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品泳道中大小一致的條帶，判定該樣品含β-乳球蛋白，表述為“β-乳球在微孔板上預(yù)包被牛β-乳球蛋白抗體，樣品中的β-乳球蛋白與生物素標(biāo)記的β-乳球蛋白競爭性地和微孔中的抗體結(jié)合，然后加入親和素-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物，加入顯色底物，終止液終止反應(yīng)，再乘以稀釋倍數(shù)即可得出樣品中β-乳球蛋66.3.3高壓滅菌鍋：使用溫度范圍45℃6.3.4恒溫箱：溫控范圍為室溫+5℃~80℃。按照5.4.1和5.4.2對(duì)樣品進(jìn)行脫脂處理，用稀釋緩沖液將樣品稀釋1000倍（預(yù)測樣品中β-乳球蛋6.5.1準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需試劑，并平衡至室溫（20℃~25℃)。76.6.3標(biāo)準(zhǔn)曲線上樣品吸光度值對(duì)應(yīng)的β-乳球蛋白濃度，乘以樣品稀釋倍數(shù)，即為所測樣品中β-乳球蛋白含量。若檢測的β-乳球蛋白濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高濃度，對(duì)樣品進(jìn)行合適倍數(shù)稀釋后再檢測。計(jì)8gcctctcgcatctgacacttgtgttcaaaccacccatgctggtgttcggggggccacctatggggaaggctcctcactcctgtcccctgagagatcagaagtcccagtctggatgtcgaatggccgagctccctccagaggctccagggagggatccttgccccctccgccgccgcctccagctcctggtgccgcacccttgggcccgatctcgtagacgcctcagtccagtctctgcctccgtgttcactggcattctccccatgtcccctctgtgtccccgttttctctcacaaggacaccggacataagattagcccccgttccagcatcacctgaacagctcacatctgtaaagacctagattccaaacaagattccatcctgaagttcctggtggacgtgagttctggagcgacgcccttcaaccccatcacagcttgcggttcatcgcaaaacacggaacctgggatttatcgtaaaacccaggttcttcgtgaaacactgagcttcgaggcttgttgcaagaattaaaggtgctaatacagatcagggcaaggaccgaagctggccaagcctcctctttccatcacaggaaagggaggtctgggggcggccgggggtctgctcccgtgggtgggctctttctggtacagtcaccaacagtctctccgggaaggaaaccagaggccagagagcaagccagagctagtctaggagatccctgagcctccacccaagatgccgaccagccagcgggccccctggaaagaccctacagtctagggggggaacaggagccgacccgccaggcccccgctatcaggagacaccccaaccttgctcctgttcccctaccccagtacgcccacccgacccctgagatgagtggtttacttgcttagaatgtcaattgaaggcttttgtaccccctttgccagtggcacagggcacccacagcccgctgggtactgatgcccatgtggactcagccaggaggactgtcctgcgccctccctgctcgggccccctccatactcagcgacacacccagcaccagcattcccaccactcctgaggtctgaaggcagctcgctgtggtctgagcggtgcggagggaagtgccctgggagatttaaaatgtgagaggtgggaggtgggaggttgggtcctgtaggccttcccatcccacgtgcctgcacggagccctagtgctactcagtcatgcccccgcagcacccctcaggtcactttcccatcctgggggttattatgactgttgtcattgttgttgcctttttgctaccctaactgggcagcgggtgcttgcagagccctcgatactgaccaggttcccccctcggagctcgacctgaaccccatgtcaccctcgccccagcctgcagagggtgaggtgactgcagagataccctttacccaaggccacagtcacatggtttggaggagatggtgcccaaggcagaagccaccctccaggacacacctgcccccagtgctggctctgacctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctggcagccagcctggacccagagcctggacaccccctgcgcccccacttctggggcgtaccaggaaccgtccaggcccagagggggcctTCCTGCTTGGCCTCGAATGGAAGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAACCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGCCCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGGGGCCTGGATATCCAGAAGGTTCGAGGGTGCCCGGGTGGGTGGTGAGTTCGAGGGCTGGCTAGGCTGTGACGTCTGGGATTCCCATCAGTCAGCTAGAGCCGCCTGACAAATCGCCCGCCACAGGCTTCAACCAGGCCTTTAGTGTCTTGCATTCTGGAGGCTGGAAGCTGCAATCCGGGCATCGGCCCAGCTGGCTTCTCCTGCGGCCACTCTCCGGGGAGCAGACAGCCATCTTCTCCCTGTGTCCTTTGCGTGCCCTGGTTTCCTCTTCCTGTGAGGTCACCAGGCCTGCTGGATCCACGCCCGCCCACACAGCCTCACGTAACCTTTGTCATCTCTTTAAAGGCCGTGTCTCCAGTCCTGTGTTGAGGTTCTGGGGGTTAATGGGACACAGTTCAGCCCCTAAAAGAGTCCGCTCTGCCCCTCAAATTTTCCCCACCTCCAGCTATGGTCTCCCCAAGATCCAAATGTTGCCACGTGTGCGGGGGCTCATCTGGGTCCCTCTTTGGGCTCAGAGTGAGTCTGGGGAGAGCATTCCTCAGGGTGCCGAGTTGGGGGGAGGCATCTCAGGGCTGCCCAGGCCAGGGTGGGACAGAGAGCCCACTGTGGGGCTGGGGGCCCCTTCCCGCCCCTGGAGTGCAGCTCAAGGGCGACCTGGAGATCCTGCTGCAGAAATGGTGGGCGTCCCCCCCAACGGGGTGGGGTGCAGGAGGGACCAGGGCCCCAGGGCTGGGGAACGGGGCTTGGAGTTTCCTGGTACCCCTGGAGGTCCACCCAAGGCTGCTTATCCAGGGCTTTCTCTTTCTTTTTTTCCCCCAACTTTTATTAATTTGATGCTTCAGAACATCATCAAACAAATGAACACAAAACATCATTTTCGTTAACTTGGAAGGGGAGATAAAATCCACTGAAGTGGAAATGCATAGGAAAGATACATACAGTAAGGCAGGTATTCTGAATTCGCTGTTAGTTTGAGGATTACAAATGCACTTGAGCAACAGAGAGACGTTTTCATTATTTCTCGGTCTGAACAGCTCAGTATCTAAAATGAACAAGATGTCATGGAGACAAAGCCGGCGGGGGAGAGGCCCGTGTGAAGGCCGCTGGGCGTGCAGACCTGGGTCCTCGGGGCCCAGGCAGTTCCCACTACCAGCCCTGTCCACCCTCAGACGGGGGTCAGAGTGCAGGAGAGAGCTGGGTGGGTGTGGGGCAGAGATGGGGACCTGAACCCCAGGACTGCCTTTTGGGGTGCCTGTGGTCAAGGCTCTCCCCAACCTTTTCTCCCTGGCTCCATCTGACTTCTCCTGGCCCATCCACCCGGTCACCTGTGGCCCCAGAGGTGACAGTGAGTGCAGCCAAGGCCGGTTGGCCAGCCGGCCCCCTATGCCCACGCCACCCGCCTCCAG9CCCCTCCTGGGGCCGCCTTCTGCCCCTGGCCCTCAGTTCATCCTGATGAAAATGGTCCATGCCCGTGGCTCAGAAAGCAGCTGTCCCCAGGGGACGCCCACCACCCCCCAGGGACTGTGGGCAGGTGCAGGGGGCTGGCGTCAGGCCCCGAGATGCTAAGGGGCTGGTGGTGATGAAGACACTGCCGTGCCACCTGCTTCCCTGGCCTCCCTGCCACCTGCCCGGGGCCTTGGGCCGGTGGCCGTGGGCAGGTCCCGGCTGGGCAGGTCTGACACCCCAGGGTGACACCCGAGCTCTCTTTGCTGAGGGTGGGGTGGTGCTCGGGGCCCTCAGGCTGAGCTCAGGAGGTCCCTGTGCCCACCCAGGGGTAACCGAGAGCCGCTGCCCGCTCCAGGGGTCCAGGTGCCCCACGATCCCAGCCCACCCCACGGCTCCTTCATCTCCTGAAGACGAACTCTGTCCGCCCTCGCTCATTCACTTGTTTGTCCTAAATCCAAGATGAGAAAGCTTCGAGGTGGGGTTGGGGTTCCATCAGGGCCTGCCCTTCCGCCGGGCAGCCTGGGCCACATCTGCCCTTGGCCTCTTCAGGACTCACTCTGACTGGAGGCCCTGCACTGACTGATGCCAGGGTGCCCAGCCCAGGGTCTCCTGTGCCATCCGGCTGCACGGGGTTTGGATGCTGGTCCTGCCCCCAAGCTGCCCAGACACTGCAGGGCAGCTGGGGCCACCCGCAGGCCTCGGTCAGGGAGAGCCCCAGCTGCCCCCGCTCAGCGCTGCCCCCCAACAATTCCCCAGTCCTCAGGACGCATCCCTCTTCCCTTGCTGGGCAGTGTTCAGCCCCACCCGAGATCGGGGAAGCCCTATTTCTTGACCACTCCGGTCCCTGGGGAGGGCGGCCTCAGACTCAGTGGTGAGTGTTCCCAAGTCCAGGAGGTGGTGGAGGGTCCCTGGCGGATCCAGAGTTGGGCTTCCAGAGTGAGGGCTTCCTGGGCCCCATGTGCCTGGCAGTGGCAGCAGGGAAGGGGCCACACCATTTTGGGGCTGGGGGATGCCAGAGGGCGCTCCCCACCCCGTCCTCACCAAGTGGTGACCCCGGGGGAGCCCCGCTGGTTGTGGGGGGTGCTGGGGGCTGACCAGAAACCCCCCTCCTGGACCAGCTGTGTGGTCCTCGCTGCAACGGGGCCGGGGGGGACGGTGGGAGCAGGGAGCTTGATTCCCAGGAGGAGGAGGGATGGGGGGTCCCCGAGTCCCGCCAGGAGAGGGTGGTCATATACCGGGAGCCGGTGTCCTGGGGGCCTGTGGGTGACTGGGGACGGGGGCCAGACACACAGGCTGGGAGACGGGGGGCTGCAGCGCTCTGGTGTGACCATCACGATGGAGCCGGCGGTCACTATGAATCTAACAGCCTTTGTTACCGGGGAGTTTCAATTATTTCATCAAATAAGAACTCAGGCACAAAGCTGTCTTTCAACTGTCACGTCCTGAAAACAAATGGCAGGTGACATTTTCCATGCCATAGCAGTGCCACTGGGCATTTTCAGGGCCCATGTGCCAGGAGGGCGTGGGCATCGGCGAGTGGAGGCTCCTGGCCGTGTCAGCTGGCCCAGGGGGAGGAGGGGACCCAGACAGCCAGAGGTGGGGAGCAGGCTTTCCCCCTGTGACGCTGCAGACCCACCGCACTGCCCTGGGAGGAAGGGGAGGGAACTGGGCCAAGGGGGAAGGGCAGGTGTGCTGGAGGCCAAGGCAGACCTGCACACCACCCTGGAGAGCAGGGCATGCACATCCGGCTGTCCTTCAACCCAACCCAGGACCACCTCCTCCCATGGTGACCCCCAGCTCCCCAGGCCTCCCGGGAGGATGGAGACGGGGTGCAGGGCCCCGAGGTGGCCCCCTCCCCACCCCCTCCCCAGCTCCCTCTGTCCTGGGGTGTCCAGTCCCATCCTGACGCTCCCCCGCCACGGCTCTCCCTCCCCAGTGCCACATCTAGTGAGCCCCTGCCGGCGCCTCTGGGGTAAGCTGCCTGCCCTGCCCCACGTCCTGGGCACACACATGGGGTAGGGGTTCTTGGTTGGGCCCGGGAGCCCCCATTAGGCCCTGGGGTCCCCCGTAGGAATGGCTGGAAGCTGGGGTCCTTCCTGGAGACTACAGAGCCGGCTGGCCACATGCTCGCTCTTGTGGGGTGACCTGTGTCCTGGCCTCACTCACACGCTGATCTCCTCCACCTCCTTCCTGGCAGACCTAAGGGCCAAGGTGGAGGGCTCAGGAAGTGACACCTAAGGGGGAGGCTAGGGGGGTCCTTCTCCCAAAGGAGGGGCCGTCCTGAATCCCCAGCCACGGACAGGCTGGCAAGGGTCTGGCAGGTACCCCAGGAATCACAGGGGAGCCCCATGTCCATTTCAGAGCCCGGGAGCCTTGGCCCCTCTGGGGACAGACGATGTCATCCCCGCCTGCCCCATCAGGGGACCAGGAGGAACCGGGACCACATTCACCCCTCCTGGGACCCAGGCCCCTCCAGGCCCCTCCTGGGGCCTCCTGCTTGGGGCCGCTCCTCCTTCAGCAATAAAGGCATAAACCTGTGCTCTCccttctgagtctttcctggatgatgggccgggggtggagaaggcccgggacagggtggggagtggtctggctcagaggatgatggtagggctgggatccagggcgtctgcattacagtcttgtgacatctgggggcccacacacatctacggctctttgaaact注：下劃線部分為引物序列位置；大寫字母部分為β-乳球蛋白基因序列；大寫加粗斜體ATG為起始密碼子，TAG為gcctctcgcatctgacacttgtgttcaaaccacccatgctggtgttcggggggccacctatggggaaggctcctcactcctgtcccctgagagatcagaagtcccagtctggatgtcgaatggccgagctccctccagaggctccagggagggatccttgccccctccgccgccgcctccagctcctggtgccgcacccttgggcccgatctcgtagacgcctcagtccagtctctgcctccgtgttcactggcattctccccatgtcccctctgtgtccccgttttctctcacaaggacaccggacataagattagcccccgttccagcatcacctgaacagctcacatctgtaaagacctagattccaaacaagattccatcctgaagttcctggtggacgtgagttctggagcgacgcccttcaaccccatcacagcttgcggttcatcgcaaaacacggaacctgggatttatcgtaaaacccaggttcttcgtgaaacactgagcttcgaggcttgttgcaagaattaaaggtgctaatacagatcagggcaaggaccgaagctggccaagcctcctctttccatcacaggaaagggaggtctgggggcggccgggggtctgctcccgtgggtgggctctttctggtacagtcaccaacagtctctccgggaaggaaaccagaggccagagagcaagccagagctagtctaggagatccctgagcctccacccaagatgccgaccagccagcgggccccctggaaagaccctacagtctagggggggaacaggagccgacccgccaggcccccgctatcaggagacaccccaaccttgctcctgttcccctaccccagtacgcccacccgacccctgagatgagtggtttacttgcttagaatgtcaattgaaggcttttgtaccccctttgccagtggcacagggcacccacagcccgctgggtactgatgcccatgtggactcagccaggaggactgtcctgcgccctccctgctcgggccccctccatactcagcgacacacccagcaccagcattcccaccactcctgaggtctgaaggcagctcgctgtggtctgagcggtgcggagggaagtgccctgggagatttaaaatgtgagaggtgggaggtgggaggttgggtcctgtaggccttcccatcccacgtgcctgcacggagccctagtgctactcagtcatgcccccgcagcacccctcaggtcactttcccatcctgggggttattatgactgttgtcattgttgttgcctttttgctaccctaactgggcagcgggtgcttgcagagccctcgatactgaccaggttcccccctcggagctcgacctgaaccccatgtcaccctcgccccagcctgcagagggtgaggtgactgcagagataccctttacccaaggccacagtcacatggtttggaggagatggtgcccaaggcagaagccaccctccaggacacacctgcccccagtgctggctctgacctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctggcagccagcctggacccagagcctggacaccccctgcgcccccacttctggggcgtaccaggaaccgtccaggcccagagggggcctTCCTGCTTGGCCTCGAATGGAAGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAACCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGCCCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGGGGCCTGGATATCCAGAAGGTTCGAGGGTGCCCGGGTGGGTGGTGAGTTCGAGGGCTGGCTAGGCTGTGACGTCTGGGATTCCCATCAGTCAGCTAGAGCCGCCTGACAAATCGCCCGCCACAGGCTTCAACCAGGCCTTTAGTGTCTTGCATTCTGGAGGCTGGAAGCTGCAATCCGGGCATCGGCCCAGCTGGCTTCTCCTGCGGCCACTCTCCGGGGAGCAGACAGCCATCTTCTCCCTGTGTCCTTTGCGTGCCCTGGTTTCCTCTTCCTGTGAGGTCACCAGGCCTGCTGGATCCACGCCCGCCCACACAGCCTCACGTAACCTTTGTCATCTCTTTAAAGGCCGTGTCTCCAGTCCTGTGTTGAGGTTCTGGGGGTTAATGGGACACAGTTCAGCCCCTAAAAGAGTCCGCTCTGCCCCTCAAATTTTCCCCACCTCCAGCTATGGTCTCCCCAAGATCCAAATGTTGCCACGTGTGCGGGGGCTCATCTGGGTCCCTCTTTGGGCTCAGAGTGAGTCTGGGGAGAGCATTCCTCAGGGTGCCGAGTTGGGGGGAGGCATCTCAGGGCTGCCCAGGCCAGGGTGGGACAGAGAGCCCACTGTGGGGCTGGGGGCCCCTTCCCGCCCCTGGAGTGCAGCTCAAGGGCGACCTGGAGATCCTGCTGCAGAAATGGTGGGCGTCCCCCCCAACGGGGTGGGGTGCAGGAGGGACCAGGGCCCCAGGGCTGGGGAACGGGGCTTGGAGTTTCCTGGTACCCCTGGAGGTCCACCCAAGGCTGCTTATCCAGGGCTTTCTCTTTCTTTTTTTCCCCCAACTTTTATTAATTTGATGCTTCAGAACATCATCAAACAAATGAACACAAAACATCATTTTCGTTAACTTGGAAGGGGAGATAAAATCCACTGAAGTGGAAATGCATAGGAAAGATACATACAGTAAGGCAGGTATTCTGAATTCGCTGTTAGTTTGAGGATTACAAATGCACTTGAGCAACAGAGAGACGTTTTCATTATTTCTCGGTCTGAACAGCTCAGTATCTAAAATGAACAAGATGTCATGGAGACAAAGCCGGCGGGGGAGAGGCCCGTGTGAAGGCCGCTGGGCGTGCAGACCTGGGTCCTCGGGGCCCAGGCAGTTCCCACTACCAGCCCTGTCCACCCTCAGACGGGGGTCAGAGTGCAGGAGAGAGCTGGGTGGGTGTGGGGCAGAGATGGGGACCTGAACCCCAGGACTGCCTTTTGGGGTGCCTGTGGTCAAGGCTCTCCCCAACCTTTTCTCCCTGGCTCCATCTGACTTCTCCTGGCCCATCCACCCGGTCACCTGTGGCCCCAGAGGTGACAGTGAGTGCAGCCAAGGCCGGTTGGCCAGCCGGCCCCCTATGCCCACGCCACCCGCCTCCAGCCCCTCCTGGGGCCGCCTTCTGCCCCTGGCCCTCAGTTCATCCTGATGAAAATGGTCCATGCCCGTGGCTCAGAAAGCAGCTGTCCCCAGGGGACGCCCACCACCCCCCAGGGACTGTGGGCAGGTGCAGGGGGCTGGCGTCAGGCCCCGAGATGCTAAGGGGCTGGTGGTGATGAAGACACTGCCGTGCCACCTGCTTCCCTGGCCTCCCTGCCACCTGCCCGGGGCCTTGGGCCGGTGGCCGTGGGCAGGTCCCGGCTGGGCAGGTCTGACACCCCAGGGTGACACCCGAGCTCTCTTTGCTGAGGGTGGGGTGGTGCTCGGGGCCCTCAGGCTGAGCTCAGGAGGTCCCTGTGCCCACCCAGGGGTAACCGAGAGCCGCTGCCCGCTCCAGGGGTCCAGGTGCCCCACGATCCCAGCCCACCCCACGGCTCCTTCATCTCCTGAAGACGAACTCTGTCCGCCCTCGCTCATTCACTTGTTTGTCCTAAATCCAAGATGAGAAAGCTTCGAGGTGGGGTTGGGGTTCCATCAGGGCCTGCCCTTCCGCCGGGCAGCCTGGGCCACATCTGCCCTTGGCCTCTTCAGGACTCACTCTGACTGGAGGCCCTGCACTGACTGATGCCAGGGTGCCCAGCCCAGGGTCTCCTGTGCCATCCGGCTGCACGGGGTTTGGATGCTGGTCCTGCCCCCAAGCTGCCCAGACACTGCAGGGCAGCTGGGGCCACCCGCAGGCCTCGGTCAGGGAGAGCCCCAGCTGCCCCCGCTCAGCGCTGCCCCCCAACAATTCCCCAGTCCTCAGGACGCATCCCTCTTCCCTTGCTGGGCAGTGTTCAGCCCCACCCGAGATCGGGGAAGCCCTATTTCTTGACCACTCCGGTCCCTGGGGAGGGCGGCCTCAGACTCAGTGGTGAGTGTTCCCAAGTCCAGGAGGTGGTGGAGGGTCCCTGGCGGATCCAGAGTTGGGCTTCCAGAGTGAGGGCTTCCTGGGCCCCATGTGCCTGGCAGTGGCAGCAGGGAAGGGGCCACACCATTTTGGGGCTGGGGGATGCCAGAGGGCGCTCCCCACCCCGTCCTCACCAAGTGGTGACCCCGGGGGAGCCCCGCTGGTTGTGGGGGGTGCTGGGGGCTGACCAGAAACCCCCCTCCTGGACCAGCTGTGTGGTCCTCGCTGCAACGGGGCCGGGGGGGACGGTGGGAGCAGGGAGCTTGATTCCCAGGAGGAGGAGGGATGGGGGGTCCCCGAGTCCCGCCAGGAGAGGGTGGTCATATACCGGGAGCCGGTGTCCTGGGGGCCTGTGGGTGACTGGGGACGGGGGCCAGACACACAGGCTGGGAGACGGGGGGCTGCAGCGCTCTGGTGTGACCAT