第三章-食品微生物檢驗的基本程序

第三章

食品微生物檢驗的基本程序12/22/20241華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗本章的主要內(nèi)容一、食品微生物檢驗的一般步驟二、檢驗前的準備三、樣品的采集四、樣品的送檢五、樣品的處理方法六、致病菌檢驗參考菌群的選擇七、樣品的檢驗八、檢驗結(jié)果的報告12/22/20242華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗一、食品微生物檢驗的一般步驟樣品采集樣品處理樣品保存選擇參考菌群檢驗前的準備菌落總數(shù)大腸菌群致病菌分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)增菌純化染色鏡檢生化試驗血清學(xué)試驗動物試驗結(jié)果報告12/22/20243華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗二、檢驗前的準備工作

建立一個無菌取樣的分析清單，按清單準備工具、容器、設(shè)施（衣服、發(fā)網(wǎng)等）；盛樣品的容器應(yīng)當(dāng)被預(yù)先標(biāo)識，如樣品號、取樣日期、取樣人等；檢查所有取樣設(shè)施、工具和容器的滅菌日期、滅菌時間，并做好標(biāo)識；準備好所用的各種試劑，做好普通營養(yǎng)瓊脂或其他選擇必培養(yǎng)基；注意干冰或濕冰的準備及保存。

12/22/20244華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗三、食品檢驗樣品的采集12/22/20245華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗（一）采樣的意義便于食品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)督管理；鑒別食品中是否存在有毒有害物質(zhì)；為新產(chǎn)品、新資源利用、新食品化工產(chǎn)品、新工藝投產(chǎn)前進行衛(wèi)生鑒定。12/22/20246華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗（二）樣品的種類

大樣：整批檢驗中樣：采樣員從大樣各部分取得的混合樣（250克）小樣：檢驗員用來檢驗的樣品（一般為25克）。

表面污染：50cm2（5cm2×10處）罐頭食品：罐/批、班次一般每個品種>3罐，可以以每配料罐或滅菌鍋為一批。12/22/20247華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗（三）采樣的原則

@代表采樣當(dāng)時的及樣品整體的情況；

@考慮到各種影響樣品質(zhì)量的因素，防止樣品受到外源性污染；

@防止樣品變質(zhì)

@防止食品中固有微生物的數(shù)量和生長能力發(fā)生變化。

@不得加入防腐劑、固定劑等。@樣品采集和現(xiàn)場測定必須有二人以上參加。12/22/20248華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗（四）取樣方案進出口貿(mào)易合同對食品抽樣量有明確規(guī)定的，按合同規(guī)定抽樣。

合同沒有具體抽樣規(guī)定的，可根據(jù)檢驗的目的，產(chǎn)品及被抽樣品批的性質(zhì)和分析方法的性質(zhì)確定抽樣方案。參照同一產(chǎn)品的品質(zhì)檢驗抽樣數(shù)量抽樣，或按單位包裝件數(shù)N的開平方值抽樣。參照GB/T4789.1-2010《中華人民共和國國家標(biāo)準

食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗

總則》之采樣數(shù)量。國際上最為流行的抽樣方案為TheInternationalCommissiononMicrobiologicalSpecificationforFoods推薦的抽樣方案和隨機抽樣方案。12/22/20249華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗抽樣檢驗

1.經(jīng)驗（百分比抽樣）：批量不同時，相同質(zhì)量可能有不同的判斷結(jié)果。

2.統(tǒng)計抽樣檢驗：N批產(chǎn)品n樣本d不合格品隨機抽取全檢43210批產(chǎn)品合格批產(chǎn)品不合格d≤ACd≥Re比較判斷準則（Ac,Re）N,Ac,Re用數(shù)理統(tǒng)計的方法來確定不足：批產(chǎn)品合格中可能包括不合格品，反之批產(chǎn)品不合格中可能包括合格品。全檢不能被否定，全檢仍適用于價值較大，后果影響嚴重的產(chǎn)品。如高危害產(chǎn)品等AQL接收質(zhì)量限Ac接收數(shù)Re拒收數(shù)12/22/202410華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗國際食品微生物專業(yè)委員會

(ICMSF)推薦的抽樣方案采樣設(shè)想及其基本方法

可充分混合的物體，用于分析的樣品可能代表所抽“一批”（lot）樣品的真實情況，采樣時可以充分混勻后隨即采樣；不可充分混合的物體，在“多批”（Lots或“batchers”）食品的情況下就不能如此抽樣，因為“一批”容易包含在微生物的質(zhì)量上差異很大的多個單元。因此在選擇抽樣方案之前，必須考慮諸多因素（ICMSF，1986），包括：

——檢驗?zāi)康?/p>

——產(chǎn)品及被抽樣品的性質(zhì)

——分析方法12/22/202411華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗國際食品微生物專業(yè)委員會

(ICMSF)推薦的抽樣方案采樣基本原則（1）各種微生物本身對人的危害程度各有不同。（2）食品經(jīng)不同條件處理后，其危害度變化情況：①降低危害度；②危害度未變；③增加危害度。根據(jù)（1）（2）的情況來設(shè)定抽樣方案并規(guī)定其不同采樣數(shù)。

12/22/202412華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗幾個字母代號

n：系指一批產(chǎn)品采樣個數(shù)。

c：系指該批產(chǎn)品的檢樣菌數(shù)中，超過限量的檢樣數(shù)，即結(jié)果超過合格菌數(shù)限量的最大允許數(shù)。

m：系指合格菌數(shù)限量，將可接受與不可接受的數(shù)量區(qū)別開。

M：系指附加條件，判定為合格的菌數(shù)限量，表示邊緣的可接受數(shù)與邊緣的不可接受數(shù)之間的界限。12/22/202413華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗ICMSF的二級抽樣方案二級法只設(shè)有n、с及m值以其一點作為食品微生物的限量值，只設(shè)合格判定標(biāo)準m值，超過m值的，則為不合格品。以生食海產(chǎn)品魚為例n=5，c=0，m=102，（n=5即抽樣5個，c=0即意味著在該批檢樣中，未見到有超過m值的檢樣，此批貨物為合格品)。在中等或嚴重危害的情況下使用二級抽樣方案

12/22/202414華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗ICMSF的三級抽樣方案三級法有n、c、m及M值。M即附加條件后判定合格的菌數(shù)限量。設(shè)有微生物標(biāo)準m及M值兩個限量，超過m值的檢樣，即算為不合格品。其中以m值到M值的范圍內(nèi)的檢樣數(shù)，作為c值，如果在此范圍內(nèi)，即為附加條件合格，超過M值者，則為不合格。例如：冷凍生蝦的細菌數(shù)標(biāo)準n=5，c=3，m=102CFU/g，M=103CFU/g，其意義是從一批產(chǎn)品中，取5個檢樣，經(jīng)檢樣結(jié)果，允許≤3個檢樣的菌數(shù)是在m～M值之間，如果有3個以上檢樣的菌數(shù)是在m～M值之間或一個檢樣菌數(shù)超過M值者，則判定該批產(chǎn)品為不合格品。對健康危害低的情況下建議使用三級抽樣方案

12/22/202415華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗ICMSF的隨機抽樣方案隨機抽樣，就是保證在抽取樣本過程中，排除一切主觀意向，使批中的每個單位產(chǎn)品都有同等被抽區(qū)的機會的一種抽樣方法。在現(xiàn)場抽樣時，可利用隨機抽樣表進行隨機抽樣。隨機抽樣表系用計算機隨機編制而成，包括一萬個數(shù)字。其使用方法如下：a先將一批產(chǎn)品的各單位產(chǎn)品（如箱、包、盒等）按順序編號。如將一批600包的產(chǎn)品編為1、2……600。b.隨意在表上點出一個數(shù)。c.根據(jù)單位產(chǎn)品編號的位數(shù)進行抽樣。重復(fù)抽樣，直到完成應(yīng)抽樣品件數(shù)為止。12/22/202416華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗（六）食品微生物檢驗采樣方法采樣原則：能采取完整包裝的樣品就不拆開取樣，必須拆開包裝取樣的應(yīng)按無菌操作進行取樣.12/22/202417華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗1、直接食用的小包裝食品直到檢驗前不要開封，以防污染12/22/202418華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗2、統(tǒng)裝或大容器包裝的液體食品抽樣前搖動均質(zhì)，取樣不超過其容量的四分之三，測溫，記錄，冷卻（0-4℃），取樣檢測前再混勻一次，用100mL無菌注射器抽取,注入無菌盛樣容器。12/22/202419華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗3、統(tǒng)裝或大容器包裝固體和半固體食品大塊整體食品用無菌刀具和鑷子從不同的部位割取，并注意其代表性；若為檢驗食品的污染情況，可取表層樣品；若為檢驗食品品質(zhì)的情況，應(yīng)從深部取樣。

（肉類、魚類或類似食品要將表面樣品和深層樣品分開保存，防止交叉污染）

12/22/202420華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗4、統(tǒng)裝或大容器包裝的冷凍食品取樣時可以用錐子、木鉆等獲取深層樣品。樣品一旦融化，不可使其再凍，保持冷卻即可。大包裝小塊冷凍食品按小塊個體采??；大塊冷凍食品可用無菌刀從不同部位削取或用無菌手鋸從凍塊上鋸取樣品，放入無菌容器。12/22/202421華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗5、生產(chǎn)工序監(jiān)測采樣車間用水：采用帶有防塵磨口瓶塞的廣口瓶。取樣時應(yīng)先用流水處理出水口，再消毒出水口，才能取樣；若懷疑出水口的衛(wèi)生狀況，可以連帶取樣。取樣時避免用手接觸水樣或取樣瓶內(nèi)部。對于用氯氣處理過的水，取樣后在每100mL水樣中加入0.1mL的2％硫代硫酸鈉。12/22/202422華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗表面取樣：通過惰性載體將表面樣品上的微生物轉(zhuǎn)移到合適的培養(yǎng)基中進行微生物檢測。適應(yīng)于菌體數(shù)量較少的樣品。載體包括清水、拭子、膠帶等，其它有瓊脂腸、影印盤、觸片法、表面切片法等.12/22/202423華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗工作臺：將經(jīng)滅菌的內(nèi)徑為5cm×5cm的滅菌規(guī)格板放在被檢物體表面，用一浸有滅菌生理鹽水的棉簽在其內(nèi)涂抹10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。12/22/202424華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗12/22/202425華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗空氣監(jiān)測：采樣時，將含營養(yǎng)瓊脂的平皿（直徑9cm）置采樣點（約桌面高度），打開平皿蓋，使平皿在空氣中暴露5min。平皿12/22/202426華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗12/22/202427華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗生產(chǎn)工序監(jiān)測采樣工人手被檢人五指并攏，用一浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面，從指尖到指端來回涂擦10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。每只手表面細菌菌落總數(shù)（cfu/只手）＝平板上平均細菌菌落數(shù)×1012/22/202428華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗12/22/202429華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗6、采樣標(biāo)簽的填寫對采樣前后的大、中、小樣均要進行標(biāo)識，注明：編號、品名、來源、批號、數(shù)量、時間、采樣人姓名、采樣條件，并填寫記錄表格。盛樣容器必須有和樣品一致的標(biāo)記，并確保標(biāo)記牢固并防水。

12/22/202430華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗×××××采樣單樣品編號：━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━產(chǎn)品名稱（商品名）______規(guī)格型號__________注冊商標(biāo)__________生產(chǎn)廠家__________通訊地址__________郵政編碼□□□□□□受檢地點________通訊地址______郵政編碼□□□□□□采樣地點___________采樣日期__________采樣基數(shù)_________生產(chǎn)日期____________批號__________產(chǎn)品依據(jù)標(biāo)準_______有效成分及含量_________________________________________________檢驗?zāi)康豞_______________檢測項目________________

采樣人仔細閱讀以下句子，然后簽字我認真負責(zé)地填寫了該樣品采樣單，承認以上填寫的合法性，被該采親單位所證實的樣品系按照采樣方法取得的，該樣品具有代表性、真實性和公正性。代表單位（章）代表單位（章）簽字簽字日期年月日日期年月日

備注

12/22/202431華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗四、樣品的送檢要求12/22/202432華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗1、樣品的運送

—注意防污染、防散漏、防變質(zhì)防護包裝：液體防漏、冷凍食品防融，一般用減震材料（泡沫材料）和隔熱箱（內(nèi)裝干冰以維持<0℃）；盡快送檢：<3小時；冷凍食品應(yīng)保持冷凍狀態(tài)，非冷凍食品保持1～5℃；填寫送檢單，內(nèi)容與標(biāo)識單相似，有運送人簽字。不能由專人運送的樣品，可以托運，但要確保安全。中毒樣品或致病菌樣品必須專人、專車運送。12/22/202433華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗2、檢樣的接收

樣品的接收

1、查對樣品：根據(jù)送檢單對照樣品，要求樣、單一致；

2、填表登記：內(nèi)容與標(biāo)識相似，注明接收日期等；一般先微檢，后化檢。

3、分類保藏：冷藏、冷凍或室溫。

樣品的拒收樣品數(shù)量、狀態(tài)、外形或包裝等與送檢單不符。12/22/202434華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗3、樣品的保存樣品到實驗室后應(yīng)在36h內(nèi)檢驗（貝類是6h）。進行必要和清晰的標(biāo)識：樣品名稱、樣品描述、樣品批號、企業(yè)名稱和地址、取樣人、時間、地點、溫度和測試目的。樣品在保存過程中采用適當(dāng)?shù)姆椒?，取保樣品和微生物的狀態(tài)，仍能代表取樣時的特性。（特別需要注意溫度、pH值、氧氣等條件變化）對樣品的貯存過程應(yīng)有記錄。12/22/202435華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗五、樣品的處理方法是指對采取的樣品的分取、粉碎及混勻等過程，以保證樣品的均勻性，在檢驗時能具有代表性。液體樣品固體樣品冷凍樣品12/22/202436華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗(一)液體樣品的處理

1.瓶裝液體樣品的處理2.盒裝或軟塑料包裝樣品的處理3.半固體或粘性液體食品12/22/202437華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗1.瓶裝液體樣品的處理先搖勻-表面消毒-用無菌工具開罐-吸樣（>2.5cm深度）用點燃的酒精棉球灼燒瓶口滅菌，接著用石炭酸或來蘇爾消毒后的紗布蓋好，再用滅菌開瓶器將蓋啟開；含有二氧化碳的樣品可倒入500mL磨口瓶內(nèi)，口勿蓋緊，覆蓋一滅菌紗布，輕輕搖蕩，待氣體全部逸出后，取樣25mL檢驗；酸性飲料：pH<4.5用滅菌的10%Na2CO3調(diào)至中性。12/22/202438華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗2.盒裝或軟塑料包裝樣品的處理將其開口處用75%酒精棉擦拭消毒，用滅菌剪子剪開包裝，覆蓋上滅菌紗布或浸有消毒液的紗布在剪開部分，直接吸取樣品25mL，或傾入另一滅菌容器中再取樣25mL檢驗。12/22/202439華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗3.半固體或粘性液體食品融化（45℃水?。?，小于15min，取樣。12/22/202440華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗（二）固體樣品的處理搗碎均質(zhì)法剪碎振搖法研磨法整粒振搖法胃蠕動均質(zhì)法12/22/202441華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗1.搗碎均質(zhì)法將中樣(≥100g)剪碎或攪拌混勻，從中取25g放入帶225mL稀釋液的無菌均質(zhì)杯中，8000~10000r/min均質(zhì)1~2min即可。12/22/202442華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗2.剪碎振搖法將中樣(≥100g)剪碎或攪拌混勻，從中取25g檢樣進一步剪碎，放入帶225mL稀釋液和直徑5mm左右玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振搖50次，振幅要大于40cm。12/22/202443華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗3.研磨法將中樣(≥100g)剪碎或攪拌混勻，從中取25g檢樣放入無菌缽中充分研磨后，再放入帶有225mL無菌稀釋液的稀釋瓶中，蓋緊蓋后充分搖勻。12/22/202444華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗4.整粒振搖法有完整自然保護膜的穎粒狀樣品(如蒜瓣、青豆等)，直接稱取25g整粒樣品置于帶有225mL稀釋液和直徑5mm左右玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振搖50次，振幅要大于40cm。12/22/202445華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗這是國外使用的一種新型的均質(zhì)樣品的方法，將一定量的樣品和稀釋液放入無菌均質(zhì)袋中，開機均質(zhì)。均質(zhì)器有一個長方形金屬盒，其旁安有金屬葉板，可打擊塑樹袋，金屬板由恒速馬達帶動，作前后移動而撞碎樣品。

5.胃蠕動均質(zhì)法12/22/202446華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院王麗（三）冷凍樣品的處理冷凍樣品，先將中樣在0~4℃下解凍，時間不能超過18h，或在45℃下解凍，時間不能超過15min。再取檢樣25g做稀釋處理。12/22/202447華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品