《酶工程》總復(fù)習(xí)

《酶工程》總復(fù)習(xí)整理生物酶工程主要研究內(nèi)容（1）用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）如：尿激酶原和尿激酶是治療血栓病的有效藥物。用DNA重組技術(shù)將人尿激酶原的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中，可使大腸桿菌細胞生產(chǎn)人尿激酶原，從而取代從大量的人尿中提取尿激酶。（2）用蛋白質(zhì)工程技術(shù)定點改變酶結(jié)構(gòu)基因（突變酶）如：酪氨酰－tRNA合成酶，用Ala5（第5位的丙氨酸）取代Thr51（第51位的絲氨酸），使該酶對底物ATP的親和力提高了100倍。（3）設(shè)計新的酶結(jié)構(gòu)基因，生產(chǎn)自然界從未有過的性能穩(wěn)定、活性更高的新酶。酶工程原理和基本過程菌種→擴大培養(yǎng)→發(fā)酵→發(fā)酵酶液→酶的提取→酶成品↓原料→前處理→殺菌→酶反應(yīng)器←酶的固定化↓反應(yīng)液→產(chǎn)品提取→產(chǎn)品世界三大酶制劑公司NovoNordisk（丹麥）GenencorInternational(美國杰能科國際公司）Cuitor(芬蘭）三大公司銷售額占世界總額的70%2、米氏常數(shù)的意義Km：米氏常數(shù)，物理意義為反應(yīng)速率為最大速率Vmax一半時底物的濃度，單位與底物濃度同（1）Km是酶的一個特性常數(shù)，Km大小只與酶性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)。當(dāng)?shù)孜锎_定，反應(yīng)溫度，pH及離子強度一定時，Km值為常數(shù)，可用來鑒別酶。Km一般在1×10-6~10-1mol/L之間不同的酶Km值不同，測定Km要在相同測定條件（pH、溫度、離子強度）下進行。（2）Km值可用于判斷酶的專一性和天然產(chǎn)物，若一個酶有幾種底物就有幾個Km值，其中Km值最小的底物稱為該酶的最適底物，又稱天然底物。（3）可近似表示酶與底物親和力的大小。真正表示酶與底物親和力為Ks=k2/k1(注Km=k2+k3/k1)（4）已知Km可由[S]計算v，或由v計算[S]。酶活力是指一定條件下，酶所催化的反應(yīng)初速度;酶催化反應(yīng)速度用單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。V=-dS/dt=dP/dt二、酶的活力單位：表示酶活力大小所用的兩個國際單位1IU：在最適反應(yīng)條件下，每分鐘催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，稱一個IU。1Kat：在最適反應(yīng)條件下，每秒鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，稱Kat單位1Kat＝6×107IU；1IU＝1/60μKat＝16.7nKat最適條件：最適溫度,最適pH、最適緩沖液離子強度、最適底物濃度。底物濃度要求：（1）通常很大，使酶飽和；（2）底物消耗≤5%。目前工業(yè)用酶大多數(shù)來自微生物。經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，通過人工操作，利用微生物細胞的生命活動獲得所需酶的技術(shù)過程稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。酶的發(fā)酵生產(chǎn)是現(xiàn)在酶生產(chǎn)的主要方法。酶發(fā)酵生產(chǎn)的前提之一：選育到性能優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物！對產(chǎn)酶微生物的要求：（1）產(chǎn)酶量高；（2）易培養(yǎng)和管理；（3）產(chǎn)酶性能穩(wěn)定；（4）利于酶產(chǎn)品的分離純化；（5）安全可靠、無毒性等。1960，Jacob和Monod提出的操縱子學(xué)說闡明；與生物合成相關(guān)的四個基因：調(diào)節(jié)基因Regulatorgene；啟動基因Promotergene；操縱基因Operatorgene；結(jié)構(gòu)基因Structuralgene；調(diào)節(jié)基因(R)：可產(chǎn)生一種變構(gòu)蛋白，通過與效應(yīng)物(effector)（包括誘導(dǎo)物和輔阻遏物）的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與操縱基因的結(jié)合力。調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。啟動基因（P）（啟動子）：有兩個位點：（1）RNA聚合酶的結(jié)合位點（2）cAMP-CAP的結(jié)合位點。CAP：分解代謝物活化劑蛋白，又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。操縱基因（Operatergene）:位于啟動基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時機與速度。結(jié)構(gòu)基因（Structuralgene）:決定某一多肽的DNA模板，與酶有各自的對應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為mRNA，再翻譯為蛋白質(zhì)。1.動物細胞培養(yǎng)的特點細胞生長速度慢。（需添加抗生素）細胞體積大，無細胞壁保護，對剪切力敏感。反應(yīng)過程成本高，產(chǎn)品價格貴。細胞具有錨地依賴性。原代細胞一般繁殖50代。首先，應(yīng)對被純化的酶的理化性質(zhì)有一個比較全面的了解;其次，判斷采用的方法和條件是否得當(dāng)，始終以活力回收率和純化倍數(shù)為指標(biāo)；再者，在純化工作中，往往不宜重復(fù)采用相同的步驟和條件；最后，要嚴格控制操作條件。隨著酶的逐步純凈，雜蛋白含量亦逐步降低，蛋白質(zhì)之間的相互作用力隨之下降，酶更不穩(wěn)定，因此，更要防止酶變性。（二）酶分離純化應(yīng)注意以下問題1、防止酶變性失活：熱、pH、泡沫、重金屬等。2、選擇有效的純化方法。3、酶活性測定應(yīng)貫穿純化過程的始終。先把一定濃度的銫鹽溶液與樣品液混合均勻，也可將一定量的銫鹽加到樣品液中使之溶解。在選定的離心力作用下，經(jīng)過足夠時間的離心分離。銫鹽在離心力的作用下，在離心力場中沉降，自動形成密度梯度。樣品中不同浮力密度的顆粒在其各自的等密度點位置上形成區(qū)帶。超臨界流體是指超過臨界溫度與臨界壓力狀態(tài)的流體。（2）超臨界CO2萃取的優(yōu)點①可以在接近室溫下進行提取，有效地防止了熱敏性物質(zhì)的氧化和逸散。②CO2是一種不活潑的氣體，萃取過程中不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，且屬不燃性氣體，無味，無毒，安全性非常好。③CO2氣體價格便宜，純度高，容易制取，且在生產(chǎn)中可以重復(fù)循環(huán)使用，從而有效地降低了成本。④分離工藝流程簡單。⑤萃取效率高，過程易于調(diào)節(jié)。（1）等溫變壓流程等溫法T1＝T2，P1＞P2（2）等壓變溫流程等壓法T1<T2，P1=P2（3）等溫等壓吸附流程吸附法T1=T2，P1=P2（4）添加惰性氣體的分離法流程酶分子修飾的意義提高酶的活力增強酶的穩(wěn)定性降低或消除酶的抗原性研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響(5)將引物與單鏈模板DNA配對,用各種DNA聚合酶和DNA連接酶將引物延長,形成互補鏈,得到共價閉合的雙鏈DNA,也叫異質(zhì)雙鏈質(zhì)粒(6)將異質(zhì)雙鏈質(zhì)粒引入宿主細胞,(如E.coli).轉(zhuǎn)化為兩個同質(zhì)雙鏈質(zhì)粒,一個含的基因是天然蛋白質(zhì)編碼的,另一個是為突變體編碼的(7)將這兩個基因分離并克隆,最后產(chǎn)物是細胞轉(zhuǎn)化突變型,能合成突變體蛋白質(zhì),與母體蛋白質(zhì)僅有1個氨基酸的差別,這個氨基酸就是事先選定的突變部位.抗體酶（abzyme）：是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性，也叫催化抗體。特點：1、反應(yīng)專一性相當(dāng)于或超過自然酶反應(yīng)的專一性，2、催化速度有的可達到自然酶催化的水平。但一般來說比非催化反應(yīng)快102～106倍，比天然酶催化反應(yīng)速度慢，僅為它的10-4-10-2。固定化酶的優(yōu)點①極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開;②可以在較長時間內(nèi)進行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng);③在大多數(shù)情況下,能夠提高酶的穩(wěn)定性;④酶反應(yīng)過程能夠加以嚴格控制;⑤產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留,簡化了提純工藝;⑥較游離酶更適合于多酶反應(yīng);⑦可以增加產(chǎn)物的收率,提高產(chǎn)物的質(zhì)量;⑧酶的使用效率提高,成本降低。固定化酶存在的缺點①

固定化時,酶活力有損失;②增加了生產(chǎn)的成本,工廠初始投資大;③只能用于可溶性底物,而且適于催化小分子底物,對大分子底物不適宜;④與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng),特別是需要輔助因子的反應(yīng);二、固定化酶的制備原則根據(jù)應(yīng)用目的、應(yīng)用環(huán)境，選擇固定化的方法，都要遵循以下基本原則：①必須注意維持酶的催化活性及專一性。②固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動化、連續(xù)化。③固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻④酶與載體必須結(jié)合牢固,從而使固定化酶能回收貯藏,利于反復(fù)使用。⑤固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性,所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。⑥固定化酶成本要低,以利于工業(yè)使用。酶傳感器由生物識別元件和能量轉(zhuǎn)換器相結(jié)合所構(gòu)成的分析儀器。生物識別元件(Biologicalrecognitionelement)是酶經(jīng)固定化后形成的一種生物敏感膜結(jié)構(gòu)，對被測定的物質(zhì)有選擇性的分子識別能力。換能器(Transducer)將識別元件上進行的生化反應(yīng)中消耗或生成的化學(xué)物質(zhì)，或產(chǎn)生的光或熱等轉(zhuǎn)換為電信號，并呈現(xiàn)一定的比例關(guān)系。酶傳感器主要由固定化酶膜和變換器組成：固定化酶膜：選擇性地“識別”并催化被檢測物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；變換器：把催化反應(yīng)中底物或產(chǎn)物的變量轉(zhuǎn)換成電信號，通過儀表顯示出來。

離子液(Ionicliquid)是由有機陽離子與有機（無機）陰離子構(gòu)成的、在室溫下呈液態(tài)的低熔點鹽類，揮發(fā)性低，穩(wěn)定性好。以酶為催化劑進行反應(yīng)所需的設(shè)備稱為酶反應(yīng)器。酶反應(yīng)器基本上是游離酶、固定化酶或固定化細胞催化反應(yīng)的容器(附加有混合、取樣和檢測設(shè)備)。作用:酶反應(yīng)器是用于完成酶促反應(yīng)的核心裝置。它為酶催化反應(yīng)提供合適的場所和最佳的反應(yīng)條件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。它處于酶催化應(yīng)過程的中心地位，是連接原料和產(chǎn)物的橋梁。以盡可能低的成本，按一定的速度由規(guī)定的反應(yīng)物制備特定產(chǎn)物。反應(yīng)器選擇注意要點：（1）分子量較大-一般不采用膜反應(yīng)器；（2）溶解度低，黏度高-選用攪拌罐式或流化床式；（3）底