DB45T 2572-2022 抗(耐)枯萎病香蕉種質(zhì)鑒選技術(shù)規(guī)程

ICS65.202.20CCSB3145germplasmresistant(tolerant)toFusariumwiltIDB45/T2572—2022本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出、歸口并宣貫。本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所。本文件主要起草人：周維、黃素梅、韋紹龍、李朝生、韋弟、覃柳燕、韋莉萍、田丹丹、何章飛、龍盛風(fēng)、黃曲燕、李寶深、李佳林、黃典紅。1DB45/T2572—2022抗（耐）枯萎病香蕉種質(zhì)鑒選技術(shù)規(guī)程本文件確定了抗（耐）枯萎病香蕉種質(zhì)鑒選的程序、界定了香蕉抗枯萎病種質(zhì)鑒選的術(shù)語(yǔ)和定義、規(guī)定了苗期鑒選、田間鑒選的操作要求等。本文件適用于廣西壯族自治區(qū)行政區(qū)域內(nèi)抗(耐)枯萎病香蕉種質(zhì)的鑒選。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T1807香蕉鐮刀菌枯萎病診斷及疫情處理規(guī)范NY/T2248熱帶作物品種資源抗病蟲(chóng)性鑒定技術(shù)規(guī)程香蕉葉斑病、香蕉枯萎病和香蕉根結(jié)線蟲(chóng)病NY/T5022無(wú)公害食品香蕉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程SN/T2665香蕉枯萎病菌檢疫鑒定方法DB45/T1759香蕉二級(jí)組培苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和定義NY/T1807、NY/T2248及SN/T2665界定的術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。人工接種鑒定artificialinoculationidentification按一定量將收集的病原菌接種到參鑒種質(zhì)材料，創(chuàng)造發(fā)病條件，根據(jù)參鑒種質(zhì)材料的抗性表現(xiàn)和發(fā)病程度確定參鑒種質(zhì)抗性級(jí)別的一種方法。自然發(fā)病鑒定non-inoculationidentification根據(jù)參鑒種質(zhì)在田間自然發(fā)病感染誘發(fā)程度，確定參鑒種質(zhì)抗性級(jí)別的鑒定方法。苗期鑒選identificationandscreeningintheseedlingstage在溫室內(nèi)采用人工接種鑒定的方法，將參鑒種質(zhì)無(wú)病二級(jí)組培苗傷根后移栽至含規(guī)定病原菌孢子濃度的基質(zhì)中，28℃條件下種植一定時(shí)間后，調(diào)查各個(gè)參鑒種質(zhì)發(fā)病情況，經(jīng)結(jié)果分析確定各個(gè)香蕉參鑒種質(zhì)的抗性水平，選出符合田間鑒選的高抗種質(zhì)要求的一種方法。田間鑒選identificationandscreeninginthefield在枯萎病病區(qū)選擇試驗(yàn)地種植經(jīng)苗期鑒選的抗性種質(zhì)，調(diào)查各個(gè)參鑒種質(zhì)在不同生長(zhǎng)時(shí)期發(fā)病程度，經(jīng)結(jié)果分析確定各個(gè)香蕉種質(zhì)的抗性水平,選出對(duì)枯萎病具有抗性植株的一種方法。2病情指數(shù)校正系數(shù)(K,)sicknessindexcorrectionfactor(K?)經(jīng)過(guò)理論推算與實(shí)際結(jié)果驗(yàn)證相結(jié)合，確定一個(gè)合理數(shù)值，使用該數(shù)值與對(duì)照品種的病情指數(shù)相除所得的比值。發(fā)病率校正系數(shù)(K?)incidencecorrectionfactor(K?)經(jīng)過(guò)理論推算與實(shí)際結(jié)果驗(yàn)證相結(jié)合，確定一個(gè)合理數(shù)值，使用該數(shù)值與對(duì)照品種的發(fā)病率相除所得的比值。參鑒種質(zhì)的實(shí)際病情指數(shù)與病情指數(shù)校正系數(shù)的乘積。參鑒種質(zhì)的實(shí)際發(fā)病率與發(fā)病率校正系數(shù)的乘積。4技術(shù)流程抗(耐)枯萎病香蕉種質(zhì)鑒選技術(shù)流程如圖1所示。田間抗(耐)病種苗期抗(耐)病圖1抗(耐)枯萎病香蕉種質(zhì)鑒選技術(shù)流程5苗期鑒選5.1參鑒品種(系)的要求參鑒種質(zhì)以6～8葉的無(wú)病二級(jí)香蕉組培苗為宜，二級(jí)組培苗的劃分按DB45/T1759的規(guī)定執(zhí)行。5.2病原菌的分離、培養(yǎng)及致病性鑒定5.3病原菌培養(yǎng)基質(zhì)制備將椰糠、玉米粉和水按質(zhì)量比2:10:7的比例混合均勻，分裝在玻璃瓶中，高溫高壓滅菌(121℃,20min)二次。無(wú)菌條件下，將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周的Foc4菌餅(直徑0.8cm~1.0cm)接種于高壓滅菌二次后的基質(zhì)中，28℃,暗培養(yǎng)21d。將培養(yǎng)Foc4的基質(zhì)碾碎混勻，取10g基質(zhì)加90mL無(wú)菌水稀釋?zhuān)Y(jié)合梯度稀釋法，顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并計(jì)算出基質(zhì)中Foc4分生孢子濃度。35.4鑒選基質(zhì)制備根據(jù)5.3所得病原基質(zhì)接種體的Foc4孢子濃度，將病原基質(zhì)接種體與未種植過(guò)植物的新椰糠按照一定比例混勻，使病原基質(zhì)中Foc4分生孢子濃度達(dá)10?個(gè)/g~10個(gè)/g,用于香蕉苗期種質(zhì)鑒選。5.5試驗(yàn)設(shè)計(jì)參鑒種質(zhì)、對(duì)照品種的小區(qū)處理采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，4次重復(fù)，每小區(qū)種植株數(shù)10～30株。每10份參鑒種質(zhì)設(shè)1份已知感病品種作為對(duì)照，參鑒種質(zhì)少于10份時(shí)設(shè)1份已知感病品種作為對(duì)照，對(duì)照品種宜采用高感品種巴西蕉或威廉斯。5.6接種方法苗期抗性鑒定宜通過(guò)傷根法進(jìn)行人工接種。將5～6葉參鑒香蕉種質(zhì)的無(wú)病二級(jí)組培苗取出，用剪刀將組培苗2～3條根，距離根尖0.5cm處剪傷后，種植到按5.4要求制作的鑒選基質(zhì)中，正常水肥管理。5.7調(diào)查及計(jì)算方法5.7.1接種30d后觀察并調(diào)查植株外觀發(fā)病情況，第40d調(diào)查每株香蕉苗的外部及內(nèi)部枯萎病癥狀。按照表B.1及圖B.1的標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查植株內(nèi)部及外部癥狀的病害級(jí)別，按照表C.1的格式記錄。5.7.2根據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果，按式(1)計(jì)算種質(zhì)材料的病情指數(shù)(DD),按式(2)(3)計(jì)算校正指數(shù)及相對(duì)病情指數(shù)，所得結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后一位。DI——病情指數(shù)；R.——各級(jí)病株數(shù)；N——調(diào)查總株數(shù)；K——最高級(jí)數(shù)值。50——相對(duì)系數(shù)；K?——病情指數(shù)校正系數(shù)；DIC——感病對(duì)照品種病情指數(shù)。式中：RDI——相對(duì)病情指數(shù)；DIT——參鑒種質(zhì)病情指數(shù)。5.8抗病性評(píng)價(jià)根據(jù)參鑒種質(zhì)平均相對(duì)病情指數(shù)，按照表1分別評(píng)價(jià)苗期對(duì)枯萎病的抗性水平。所得結(jié)果按表C.2的格式填寫(xiě)。4免疫(I)高抗(HR)抗(R)中抗(MR)感(S)高感(HS)5.9抗(耐)病種質(zhì)篩選傷根接種于Foc4孢子濃度為106個(gè)/g病原基質(zhì)中，從植株外觀判斷發(fā)病情況，發(fā)病率為50%～80%時(shí)，選取外觀未見(jiàn)發(fā)病癥狀的植株，將植株根部沖洗干凈后，從球莖底端1/5處橫切，觀察球莖褐變面選取球莖無(wú)褐變或有淺色褐變且面積小于剖面面積5%的植株，重新種植于無(wú)Foc4的育苗基質(zhì)中，作為抗(耐)枯萎病種質(zhì)材料供進(jìn)一步研發(fā)。6田間鑒選6.1鑒選圃地6.1.1鑒選圃地的選擇選擇前作香蕉枯萎病發(fā)病率在70%以上，土壤肥力一致，發(fā)病均勻且未經(jīng)輪作其他作物的舊蕉園；6.1.2灌溉條件及空氣質(zhì)量6.2參鑒種質(zhì)的要求6.3田間設(shè)計(jì)參鑒種質(zhì)、對(duì)照品種的小區(qū)處理采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，4次重復(fù)，每小區(qū)種植株數(shù)20～40株，對(duì)6.4田間管理按NY/T5022的規(guī)定執(zhí)行。參鑒品種及對(duì)照品種全生育措施。6.5調(diào)查及計(jì)算方法6.5.1病情調(diào)查及發(fā)病率計(jì)算方法按NY/T2248的規(guī)定執(zhí)行。6.5.2校正系數(shù)及相對(duì)發(fā)病率按式(4)、(5)計(jì)算。K?——發(fā)病率校正系數(shù)；5DB45/T2572—202280％——相對(duì)系數(shù)；IC——感病對(duì)照品種發(fā)病率。式中：RIR——相對(duì)發(fā)病率；IT——待測(cè)品種（系）發(fā)病率?？共⌒栽u(píng)價(jià)根據(jù)參鑒種質(zhì)平均相對(duì)發(fā)病率，按照表2分別評(píng)價(jià)田間對(duì)枯萎病的抗性水平。所得結(jié)果按表C.3的格式填寫(xiě)。表2香蕉種質(zhì)田間枯萎病抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)00＜RIR＜10%10%≤RIR＜20%20%≤RIR＜40%40%≤RIR＜60%≥60%抗（耐）病種質(zhì)篩選6.7.1根據(jù)苗期抗性評(píng)價(jià)結(jié)果，從參鑒品種中選擇抗性級(jí)別為中抗及以上級(jí)別的參鑒品種（系），按4.9方法篩選得到的抗（耐）種質(zhì)，選取經(jīng)無(wú)病基質(zhì)種植1個(gè)月以上恢復(fù)生長(zhǎng)的植株，種植到鑒選圃地中，逐月觀察植株的發(fā)病情況，對(duì)出現(xiàn)典型的黃葉、莖部縱裂等外部癥狀的植株進(jìn)行球莖橫切，觀察判斷是否為發(fā)病植株，判斷方法按NY/T1807的規(guī)定執(zhí)行。6.7.2挖出已確定的發(fā)病植株并淘汰處理，持續(xù)觀察未病參鑒植株，直至全生育期收獲，篩選留存未病或極輕病植株（發(fā)病最嚴(yán)重癥狀為：黃葉數(shù)/總?cè)~數(shù)≤10挖其吸芽觀察判斷，若內(nèi)外部均未見(jiàn)枯萎病癥狀，則取其吸芽進(jìn)行再繁殖，作為抗（耐）枯萎病種質(zhì)材料供進(jìn)一步研發(fā)。6DB45/T2572—2022香蕉枯萎病的病原及癥狀A(yù).1病原菌香蕉枯萎病主要由尖孢鐮刀菌古巴專(zhuān)化型4號(hào)生理小種(Fusariumoxysporumf.sp.cubense,race4A.2香蕉枯萎病主要癥狀香蕉植株發(fā)病后，外部病癥主要表現(xiàn)為：葉片由下部向上部逐漸變黃、萎蔫、葉鞘向外折曲，葉片下垂、新葉抽出遲緩或不能抽出、畸形；嚴(yán)重者，整株葉片枯死倒掛。假莖近地面處出現(xiàn)縱裂。內(nèi)部癥狀主要表現(xiàn)為：橫切或縱切球莖可見(jiàn)內(nèi)部變褐色、深褐色、棕紅色、深紅色、黑棕色等，病害嚴(yán)重的植株，整個(gè)球莖內(nèi)部明顯地變?yōu)樯罴t色及黑褐色，中柱和內(nèi)層的葉鞘變褐色；橫切發(fā)病植株假莖可見(jiàn)維管束有紅棕色或紫紅色斑點(diǎn)，并從假莖基部逐漸向上延伸。病莖旁所生吸芽的導(dǎo)管也會(huì)受侵染，縱剖球莖，可以看到紅棕色的維管束從母株延伸侵染的跡象。7(規(guī)范性)病害分級(jí)圖表表B.1香蕉苗期枯萎病發(fā)病程度分級(jí)表0葉片未變黃，假莖組織未見(jiàn)變褐1老葉輕微黃化或不黃，假莖組織未見(jiàn)變褐3老葉黃化，假莖組織未見(jiàn)變褐5老葉黃化、嫩葉部分有黃化，新葉抽出困難，7葉片全部黃化，假莖上、下部均有褐色條狀病變9圖B.1香蕉苗期枯萎病內(nèi)部癥狀分級(jí)圖8DB45/T2572—2022抗性評(píng)價(jià)記錄表抗性評(píng)價(jià)及調(diào)查結(jié)果記錄見(jiàn)表C.1～表C.3。表C.1香蕉種質(zhì)對(duì)枯萎病苗期抗性評(píng)價(jià)調(diào)查表（人工接種鑒定）123456789表C.2_香蕉種質(zhì)對(duì)枯萎病苗期抗性評(píng)價(jià)表（人工接種鑒定）9DB45/T2572—2022表C.3香蕉種質(zhì)對(duì)枯萎病田間抗性評(píng)價(jià)表發(fā)病率(%)DB45/T2572—2022土壤中尖孢鐮刀菌古巴專(zhuān)化型4號(hào)生理小種（Foc4）孢子濃度檢測(cè)方法D.1平板計(jì)數(shù)法采用五點(diǎn)取樣法，對(duì)栽種香蕉土壤采用隨機(jī)取樣法，或采取發(fā)病植株下土樣。樣本采集過(guò)后置于陰涼處自然風(fēng)干，過(guò)20目篩。每個(gè)樣本取0.1g干重，溶于100ml無(wú)菌水中，懸浮震蕩混勻，經(jīng)滅菌紗布過(guò)濾后梯度稀釋制備10-3g/ml、10-4g/ml、10-5g/ml、10-6g/ml孢子懸浮液。涂布于Komada選擇性培養(yǎng)基上，依據(jù)選擇性培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)，確定孢子濃度。DB45/T2572—2022參考文獻(xiàn)[1]黃素梅,韋紹龍,韋莉萍,李朝生,覃柳燕,韋弟,田丹丹,龍盛風(fēng),何章飛,周維.8種香蕉種質(zhì)對(duì)枯萎病的抗性比較與分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2019,40(11):2189-2196.[2]劉勇,秦西云,李文正,陳學(xué)軍,馬文峰,文輝,龔偉,張第喜,王炳豪.抗青枯病煙草種質(zhì)資源在云南省的評(píng)價(jià)[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2010,11(1):10-16.[3]吳征彬.棉花枯黃萎病及其抗性鑒定技術(shù)[J].植物遺傳資源科學(xué),2000,1(4):47-51.[4]黃永輝,陳琦光,遲遠(yuǎn)麗,楊媚,周而勛.土壤理化因素對(duì)香蕉枯萎病菌生長(zhǎng)和侵染的影響[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,35(02):30-34.[5]李敏慧,習(xí)平根,姜子德,等.廣東香蕉枯萎病菌生理小種的鑒定[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(002):38-41.[6]舒燦偉,張?jiān)疵?曾蕊,周而勛.香蕉枯萎病菌4個(gè)生理小種生化特征的比較[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(03):32-37.[7]LiXingshen,BaiTingting,LiYunfeng,etal.ProteomicanalysisofFusariumoxysporumf.sp.cubensetropicalrace4-inoculatedresponsetoFusariumwiltsinthebananarootcells.[J