DB51T 2469-2018 鱘魚海豚鏈球菌病診斷技術(shù)規(guī)程　　

1DB51DB51/T2469—2018鱘魚海豚鏈球菌病診斷技術(shù)規(guī)程2018-04-18發(fā)布2018-05-01實施四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 1 1 2 2 2 2 2 4 5 6 91SC/T7201.1魚類細菌病檢疫技術(shù)規(guī)程2DNA分子量標準參照物與核酸提取試劑盒等選用專業(yè)試劑公司提供的商品化試劑，上述未提及的見附錄HeartInfusion,BHIA.1）。28℃培養(yǎng)36h～48h后，挑取表面光滑、微隆起、針3按SC/T7014表2的乙酰甲基甲醇（V-P）試驗的規(guī)定執(zhí)行。培養(yǎng)基下層出現(xiàn)紅色為陽性，不出現(xiàn)紅9.2.7糖、醇類（L—阿拉伯糖、菊糖、核糖、乳糖、D-甘露醇、山梨醇6），震蕩懸浮，加入50μL10％的SDS溶液（A.7），10μL20mg/mL的蛋白酶K（A.8），混勻，37℃溫育1h；加入100μL5mol/L的NaCl溶液（A.9），充分混勻，再加入100μLCTAB/NaCl溶液（A.10）混勻，65℃溫育20min；加入等體積的酚﹕氯仿﹕異戊醇（25:24:1）（A.11），混勻，12000r/min離心5min；取上清液加入等體積的氯仿﹕異戊醇（24:1A.12混勻，12000r/min離心5min；取42s1.0μL，引物(20μmol/L)P1-F和P1-R各1.0μL，TaqDNA酶（5U/μL）0.5μL，DNA補足至50μL。混勻后，3000r/min離心30s。PCR擴增程序：94℃預變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72用TAE電泳緩沖液（A.13）配制1％的瓊脂糖平板，凝固后放入水平電泳槽，使電泳緩沖液沒膠面。將上述6μL樣品和2μL溴酚藍指示劑溶液（A.14）混合后加入樣品孔，使用DNA分子量標準參照物作對照。120V電泳約20min，當溴酚藍到9.3.4.1.4取上清液加入等體5---+----+---6 7將0.121gTris堿（分子量121.1），0.0372g乙二胺四乙酸二鈉（分子量372.24）加入80mL雙蒸水將29.22gNaCl（分子量58.444.1gNaCl溶解于80mL雙蒸水中，緩將25體積的酚、24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中，上面加上TE在400mL雙蒸水中溶解121gTris堿，加入28.55mL冰乙酸和50ml0.5/LEDTA。再加雙蒸水定容至8將溴酚藍100mg，加雙蒸水5mL，在室溫下過夜。待溶解后再稱取蔗糖25g，加雙蒸水溶解后移入溴91cgcaagtgccaaaggtgttaaagaaaaaatcaattgtcctaacagttgatgcgataatggctttgttttccctgttggaggaaaaacaatggactatgtttataaaagatgcctttcgtgctttagaagctggagagccttagcatctggtgcagat