海洋生物技術-海洋動物細胞培養(yǎng)定稿

第二章海洋動物細胞培養(yǎng)一、細胞工程與動物細胞培養(yǎng)二、海洋動物細胞培養(yǎng)（以魚類細胞培養(yǎng)為例，海洋無脊椎動物細胞培養(yǎng)自學三、魚類細胞培養(yǎng)的應用一、細胞工程與細胞培養(yǎng)

細胞工程(cellengineering)是以細胞生物學和分子生物學為基礎理論，采用原生質體、細胞或組織培養(yǎng)等試驗方法或技術，在細胞水平上研究改造生物遺傳特性，以獲得具有新的性狀的細胞系或生物體以及生物的次生代謝產(chǎn)物，并發(fā)展有關理論和技術方法的學科。

細胞工程的核心技術：細胞培養(yǎng)與繁殖

目的：獲得新性狀、新個體、新物質1細胞工程的定義2細胞工程的研究范疇動物細胞與組織培養(yǎng)植物細胞與組織培養(yǎng)細胞融合細胞核移植染色體工程胚胎工程干細胞與組織工程轉基因生物與生物反應器3動物細胞工程

常用的技術手段：包括動物細胞培養(yǎng)、動物細胞融合、單克隆抗體、胚胎移植、核移植等。

動物細胞培養(yǎng)是其他細胞工程技術的基礎。動植物、微生物細胞的培養(yǎng)特征

植物分化成熟的植物細胞體，仍有可能發(fā)育成完整植株。動物隨著分化的演進，分化成熟細胞逐漸喪失其分化潛能,不能發(fā)育成為完整的動物個體。實驗證明，囊胚階段的細胞乃至成熟的體細胞，保持著全套基因組的細胞核仍具有全能性——可能發(fā)育成完整個體。細胞質中有著決定細胞分化全能性的物質，稱為分化決定子。決定動物細胞全能性的關鍵在于細胞質。植物體細胞具有全能性1．動物細胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)的重要區(qū)別在于：[]A．培養(yǎng)基不同；B．動物細胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進行；C．動物細胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細胞不能；D．動物細胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細胞只能培養(yǎng)成植株。動物細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展或動物胚胎分散成單個細胞一定濃度的細胞懸浮液原代培養(yǎng)動物胚胎或胰蛋白酶制成幼齡動物的剪碎單個細胞加培養(yǎng)液器官、組織細胞懸浮液細胞株細胞系原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)遺傳物質改變傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)：將組織取出來后，先用胰蛋白酶等處理使組織分散成單個細胞，然后配制成一定濃度的細胞懸浮液，再將懸浮液放入培養(yǎng)瓶中，這個過程稱為原代培養(yǎng)。(第1代~第10代以內)傳代培養(yǎng)：把原代培養(yǎng)增殖的細胞定期用胰蛋白酶把細胞從瓶壁上脫離出來，配制懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，這稱為傳代培養(yǎng)。細胞株：原代細胞和50代前的傳代細胞叫做細胞株。細胞系：50代后，遺傳物質發(fā)生了改變，并且有癌變的特點，無限傳下去的傳代細胞。細胞懸浮液10代細胞50代細胞細胞株細胞系

原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)的應用1）生產(chǎn)有價值的蛋白質生物制品；如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等。2）為治療和預防疾病提供理論依據(jù)（如為皮膚大面積燒傷的病人培養(yǎng)可供移植皮膚）3）用于檢測有毒物質2.魚類細胞培養(yǎng)的方法與技術2.1魚類細胞培養(yǎng)基的選擇主要是合成培養(yǎng)基，常用的有以下幾種：Eagle

sMEM、LeibowitzL-15、M199和M1640。Eagle

sMEM適用于多種細胞的生長培養(yǎng)，如CCO、AS、CHSE-214、RTG-2等，還可以通過在其中添加或減少某些成分用于特殊研究的細胞培養(yǎng)，是一些海水魚類細胞系培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基；M199所含的營養(yǎng)成分豐富而且全面，可以在細胞培養(yǎng)中用作維持液，可以使一些細胞的存活時間達到33天，是一些淡水魚類細胞系常用的培養(yǎng)基；在對魚類組織進行細胞培養(yǎng)時，要根據(jù)不同種類的魚選擇適合其生長的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)海水魚類細胞時，要在培養(yǎng)基中加入適當量的NaCl（1.5%），以維持滲透壓（4ⅹ105Pa），但是NaCl的濃度不能太高，太高會不利于細胞生長。M199培養(yǎng)基：本培養(yǎng)基最初專用于雞成纖維細胞的的營養(yǎng)研究。如今，M199培養(yǎng)基廣泛用于非轉化細胞、疫苗和病毒的研究以及上皮細胞的原代培養(yǎng)。貨號產(chǎn)品名稱/描述規(guī)格單價L0325M199培養(yǎng)基,含Hanks'Salts,不含L-Glutamine500ml300.00L0330M199培養(yǎng)基,含Hanks'Salts,含L-Glutamine500ml320.00L0331M199培養(yǎng)基,含Hanks'Salts,含L-Glutamine,含25mMHepes500ml430.00L0356M199培養(yǎng)基,含Earles'Salts,不含L-Glutamine500ml300.00L0355M199培養(yǎng)基,含Earle'sMod.Salts,含L-Glutamine,含1.25g/L碳酸氫鈉500ml320.00L0360M199培養(yǎng)基,含Earle'sSalts,含L-Glutamine,含25mMHepes500ml430.00P0420M199培養(yǎng)基,含Earle'sSalts,含L-Glutamine,不含碳酸氫鈉,干粉For1L70.00For5L250.00For10L440.00P0425M199培養(yǎng)基,含Earles'Salts,含L-Glutamine,不含碳酸氫鈉,含25mMHepes,干粉For1L70.00For5L250.00For10L440.00P0410M199培養(yǎng)基,含Hanks'Salts,不含L-Glutamine,不含碳酸氫鈉,干粉For1L70.00For5L250.00For10L440.00合成培養(yǎng)基的種類雖多，但一般都含有氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和一些其它輔助性成分。(1)氨基酸必需氨基酸是動物細胞本身不能合成的，因此，在制備培養(yǎng)基時需加入必需氨基酸，另外還需要半胱氨酸和酪氨酸。而且由于細胞系不同，對各種氨基酸的需要也不同。有時也加入其他非必需氨基酸，氨基酸濃度常常限制可得到的最大細胞密度，其平衡可影響細胞存活的生長速率。在細胞培養(yǎng)中，大多數(shù)細胞需要谷氨酰胺作為能源和碳源。(氨基酸為L型)(2)維生素Eagle基本培養(yǎng)基中只含B族維生素，其他維生素都靠從血清中取得。血清濃度降低時，對其他維生素的需求更加明顯，但也有些情況，即使血清存在，它們也必不可少。維生素限制可從細胞存活和生長速率看出，而不是以最大細胞密度為指標。(3)碳水化合物碳水化合物是細胞生命的能量來源，有的是合成蛋白質和核酸的成分，主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸鈉等。(4)無機鹽無機鹽是細胞的重要組成部分之一，它們積極參與細胞的代謝活動。無機鹽中Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-和HCO3-等金屬離子及酸根離子是決定培養(yǎng)基滲透壓的主要成分。對懸浮培養(yǎng)，要減少鈣，可使細胞聚集和貼壁最少，碳酸氫鈉濃度與氣相CO2濃度有關。(5)有機添加劑復雜培養(yǎng)基都含有核苷、檸檬酸循環(huán)中間體、丙酮酸、脂類、氧化還原劑如抗壞血酸、谷胱甘肽等及其他各種化合物。同樣，當血清量減少時，必須添加這種化合物，它們對克隆和維持這些特殊細胞有益。(6)血清組織細胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基是血清。這是因為血清中含有大量的蛋白質、核酸、激素等豐富的營養(yǎng)物質，對促進細胞生長繁殖，粘附及中和某些物質的毒性起著一定的作用。最常用的是小牛血清，胎牛血清。人血清用于一些人細胞系。大多數(shù)動物細胞培養(yǎng)必須在培養(yǎng)基中添加血清，但在許多情況下，細胞可在無血清條件下維持和增殖。目前合成培養(yǎng)基的配方都已相對固定，并形成配制好的干粉型商品。其成分趨于簡單化，以能維持細胞生長的最低需求，而去除了不必要的成份。同時為適應某些特殊培養(yǎng)的需要補加一些新的成分，如培養(yǎng)雜交瘤細胞時采用DMEM培養(yǎng)基需補加丙酮酸鈉和2-硫基乙醇；為增加細胞轉化和DNA合成，有時補加植物血凝素(PHA)等。這些變化需根據(jù)實驗和細胞的具體要求而定。培養(yǎng)方法和環(huán)境要求（一）培養(yǎng)的方法動物細胞的體外培養(yǎng)有兩種類型：1.貼壁依賴性細胞，大多數(shù)動物細胞，包括非淋巴組織的細胞和許多異倍體體系的細胞部屬于這一類型。這一類需采用貼壁培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)是指大多數(shù)動物細胞在離體培養(yǎng)條件下都需要附著在帶有適量正電荷的固體或半固體的表面上才能正常生長，并最終在附著表面擴展成單層?；静僮鬟^程是：先將采集到的活體動物組織在無菌條件下采用物理(機械分散法)或化學(酶消化法)的方法分散成細胞懸液，經(jīng)過濾、離心、純化、漂洗后接種到加有適宜培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿(瓶、板)中，再放入二氧化碳培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。用此法培養(yǎng)的細胞生長良好且易于觀察，適于實驗室研究。但貼壁生長的細胞有接觸抑制的特性，一旦細胞形成單層，生長就會受到抑制，細胞產(chǎn)量有限。如要繼續(xù)培養(yǎng)，還需將已形成單層的細胞再分散，稀釋后重新接種，然后進行傳代培養(yǎng)。2.非貼壁依賴性細胞，來源于血液、淋巴組織的細胞，許多腫瘤細胞(包括雜交瘤細胞)和某些轉化細胞屬于這一類型。這一類可采用類似微生物培養(yǎng)的方法進行懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)是指少數(shù)懸浮生長型動物細胞在離體培養(yǎng)時不需要附著物，懸浮于培養(yǎng)液中即可良好生長。懸浮生長的細胞其培養(yǎng)和傳代都十分簡便。培養(yǎng)時只需將采集到的活體動物組織經(jīng)分散、過濾、純化、漂洗后，按一定密度接種于適宜培養(yǎng)液中，置于特定的培養(yǎng)條件下即可良好生長。傳代時不需要再分散，只需按比例稀釋后即可繼續(xù)培養(yǎng)。此法細胞增殖快，產(chǎn)量高，培養(yǎng)過程簡單，是大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的理想模式。但在動物體中只有少數(shù)種類的細胞適于懸浮培養(yǎng)。

從培養(yǎng)方式來看，動物細胞無論是貼壁培養(yǎng)或是懸浮培養(yǎng)，均可采用分批式、分批補料式、半連續(xù)式、連續(xù)式等多種培養(yǎng)方式。從培養(yǎng)系統(tǒng)來看，主要采用中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)和微載體系統(tǒng)，且以灌注式連續(xù)培養(yǎng)方式為佳。1、分批式培養(yǎng)(Batchculture)分批式培養(yǎng)是指先將細胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應器內進行培養(yǎng)，細胞不斷生長，同時產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，終止培養(yǎng)。在細胞分批培養(yǎng)過程中，不向培養(yǎng)系統(tǒng)補加營養(yǎng)物質，而只向培養(yǎng)基中通入氧，能夠控制的參數(shù)只有pH值、溫度和通氣量。因此細胞所處的生長環(huán)境隨著營養(yǎng)物質的消耗和產(chǎn)物、副產(chǎn)物的積累時刻都在發(fā)生變化，不能使細胞自始至終處于最優(yōu)的條件下，因而分批培養(yǎng)并不是一種理想的培養(yǎng)方式。分批培養(yǎng)過程特征如圖2、分批補料式培養(yǎng)(Fed-batchculture)分批補料式培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應器，在適宜的條件下接種細胞，進行培養(yǎng)，使細胞不斷生長，產(chǎn)物不斷形成，而在此過程中隨著營養(yǎng)物質的不斷消耗，不斷地向系統(tǒng)中補充新的營養(yǎng)成分，使細胞進一步生長代謝，直到整個培養(yǎng)結束后取出產(chǎn)物。分批補料式培養(yǎng)只是向培養(yǎng)系統(tǒng)補加必要的營養(yǎng)成分，以維持營養(yǎng)物質的濃度不變。由于分批補料式培養(yǎng)能控制更多的環(huán)境參數(shù)，使得細胞生長和產(chǎn)物生成容易維持在優(yōu)化狀態(tài)。3、半連續(xù)式培養(yǎng)(Semi-continuousculture)半連續(xù)式培養(yǎng)是在分批式培養(yǎng)的基礎上，將分批培養(yǎng)的培養(yǎng)液部分取出，并重新補充加入等量的新鮮培養(yǎng)基，從而使反應器內培養(yǎng)液的總體積保持不變的培養(yǎng)方式。4、連續(xù)式培養(yǎng)(Continuousculture)連續(xù)式培養(yǎng)是指將細胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應器內進行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)液不斷加入反應器內，另一方面又將反應液連續(xù)不斷地取出，使反應條件處于一種恒定狀態(tài)。與分批式培養(yǎng)不同，連續(xù)式培養(yǎng)可以保持細胞所處環(huán)境條件長時間地穩(wěn)定，可以使細胞維持在優(yōu)化的狀態(tài)下，促進細胞的生長和產(chǎn)物的形成。由于連續(xù)式培養(yǎng)過程可以連續(xù)不斷地收獲產(chǎn)物，并能提高細胞密度，在生產(chǎn)上已被應用于培養(yǎng)非貼壁依賴性細胞。連續(xù)培養(yǎng)一般是采用灌注培養(yǎng)：灌注培養(yǎng)是把細胞接種后進行培養(yǎng)，一方面連續(xù)往反應器中加入新鮮的培養(yǎng)基，同時又連續(xù)不斷地取出等量的培養(yǎng)液，但是過程中不取出細胞，細胞仍留在反應器內，使細胞處于一種營養(yǎng)不斷的狀態(tài)。高密度培養(yǎng)動物細胞時，必須確保補充給細胞足夠的營養(yǎng)以及除去有毒的代謝物。灌注培養(yǎng)時用新鮮培養(yǎng)液進行添加，確保上述目的實現(xiàn)。通過調節(jié)添加速度，則使培養(yǎng)保持在穩(wěn)定的、代謝副產(chǎn)物低于抑制水平的狀態(tài)。采用此法，可以大大提高細胞的生長密度，有助于產(chǎn)物的表達和純化。由于連續(xù)培養(yǎng)過程可以連續(xù)不斷地收獲產(chǎn)物，并能提高細胞密度，因此，在生產(chǎn)中廣泛被采用。如英國Celltech公司采用灌注培養(yǎng)雜交瘤細胞，連續(xù)不斷地生產(chǎn)單克隆抗體，獲得巨大經(jīng)濟效益。雖然灌注培養(yǎng)具有不少優(yōu)點，但也存在培養(yǎng)基消耗量比較大，操作過程復雜，培養(yǎng)過程中，易受污染等缺點。（二）細胞培養(yǎng)的環(huán)境要求細胞的生長、繁殖和代謝等生理性質，在很大程度上受各種環(huán)境因素的影響。為了使動物細胞反應處于最佳狀態(tài)，了解環(huán)境因素對其影響無疑是很重要的。影響動物細胞生長、繁殖的環(huán)境因素很多，主要有細胞生長的支持物、氣體交換、培養(yǎng)溫度、pH、滲透壓及其它因素等方面。

1、支持物體外培養(yǎng)的大多數(shù)動物細胞需在人工支持物上單層生長。在早期的實驗中，用玻璃作為支持物，開始是由于它的光學特性，后來發(fā)現(xiàn)它具有合適的電荷適合于細胞貼壁和生長。

(1)玻璃玻璃常用作支持物。它很便宜，容易洗滌，且不損失支持生長的性質，可方便地用于干熱或濕熱滅菌，透光性好，強堿可使玻璃對培養(yǎng)產(chǎn)生不良影響，但用酸洗中和后即可。

(2)塑料制品一次性的聚苯乙烯瓶是一種方便的支持物。但制成的聚苯乙烯是疏水性的，但它不適合于細胞生長，所以細胞培養(yǎng)用的塑料用品要用γ射線、化學藥品或電弧處理使之產(chǎn)生帶電荷的表面，具有可潤濕性。它光學性質好，培養(yǎng)表面平。除此之外，細胞也可在聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯和其他塑料上生長。

(3)微載體大規(guī)模動物細胞貼壁培養(yǎng)最常用的支持物是微載體。其材料有聚苯乙烯、交聯(lián)葡萄糖、聚丙烯酰胺、纖維素衍生物、幾丁質、明膠等。通常用特殊的技術制成100～200μm直徑的圓形顆粒，微載體的制備是一種較復雜的技術，微載體的價格一般也比較貴。但它的最大優(yōu)點是使貼壁細胞可以像懸浮培養(yǎng)那樣進行。微載體表面光滑，有的還在表面深層，使表面帶有少量正電荷，適合于細胞貼附。支持物通過各種預處理后，可改善細胞的貼壁和生長性能。用過的玻璃容器比新的更適合細胞生長。這可能歸因于培養(yǎng)后的表面的蝕刻和剩余的微量物質，培養(yǎng)瓶中細胞的生長也可以改善表面以利第二次接種，這類調節(jié)因素可能是由于細胞釋放出的膠原或黏素。2、氣體交換

(1)氧氣氣相中的重要成分是氧氣和二氧化碳。各種培養(yǎng)對氧的要求不同，大多數(shù)動物細胞培養(yǎng)適合于大氣中的氧含量或更低些。據(jù)報道，對培養(yǎng)基硒含量的要求與氧濃度有關，硒有助于除去呈自由基狀態(tài)的氧。在大規(guī)模細胞培養(yǎng)中，氧可能成為細胞密度的限制因素。

(2)二氧化碳二氧化碳對動物細胞培養(yǎng)起著相對復雜的作用，氣相中的C02濃度直接調節(jié)溶解態(tài)C02的濃度，溶解態(tài)的C02受溫度影響，C02溶于培養(yǎng)基中形成H2C03，產(chǎn)生H2C03又能再離解：

由于HCO3-與多數(shù)陽離子的離解數(shù)很小，趨于結合態(tài)，故使培養(yǎng)基變酸。提高氣相中CO2含量的結果是降低培養(yǎng)液pH值，而它又被加入NaHC03濃度所中和：若HCO3-濃度增加，則式(14-18)平衡向左邊移動，直到系統(tǒng)在pH=7.4達到平衡。如果換用其他物質，如NaOH，實際效果是一樣的：2.2魚類組織或細胞的來源魚類的很多組織和器官均可用于進行細胞培養(yǎng)，但比較常用的是魚類的胚胎組織和幼魚的組織器官。由于這些組織和器官的分化程度低，分裂潛能大，所以是用于魚類原代細胞培養(yǎng)的最佳材料。成魚的性腺、腎、心、鰾、脾臟、鰭條、吻端等也是比較常用的培養(yǎng)材料，尤其是性腺與腎臟的應用最為廣泛。2.3魚類細胞培養(yǎng)的方法與技術目前較常用的原代培養(yǎng)的方法是：組織塊法、機械分散法、絡合劑分散法和酶消化法。組織塊法：當組織量較少時可采用此法。它是將組織剪成約1mm3的小塊，按一定比例將組織塊涂布在瓶壁上(每個25ml的細胞培養(yǎng)瓶約涂布25塊組織塊)，經(jīng)4-5h細胞貼壁后，輕輕加入適量的培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。機械分散法：適用于細胞間連接較松散的組織，如胚胎組織及幼魚全魚。將組織剪成約1mm3的小塊，放入底部有一銅網(wǎng)的注射器內，用壓力將組織擠出網(wǎng)孔，最后將分散的組織吹打后加入培養(yǎng)基，分裝，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。絡合劑分散法：目前使用的絡合劑主要是EDTA(乙二胺四乙酸)，它能與細胞間的鈣離子、鎂離子結合而使細胞連接松散，經(jīng)吹打即可分散。該法目前主要用于囊胚細胞培養(yǎng)及上皮型細胞系的傳代。

酶消化法：該方法是目前細胞培養(yǎng)中最常用的方法，適用于絕大多數(shù)組織器官。所用的酶主要是胰酶，常用濃度是0.25％。根據(jù)酶消化時溫度的不同，又可進一步分為冷消化法及熱消化法。冷消化法是將組織剪成約2mm3的小塊，然后置于5～20倍體積的胰酶中，4℃越夜(16～18h)，這種方法可以獲得較高的細胞產(chǎn)量和成活率；熱消化法作用的溫度通常是15～20℃，作用時間30～60min。消化完成后，棄胰酶，加入培養(yǎng)基吹打，最后分瓶，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

魚類培養(yǎng)細胞作為實驗對象，有著活體魚無法比擬的優(yōu)點:（1）成本低，細胞系的維護不需要大型的養(yǎng)殖設備和大量的換水與充氣；（2）重復性好，實驗條件可以精確控制。因此，對魚類細胞系進行深入研究，無論在理論研究方面，還是在實際應用方面，都具有深遠意義。1.魚類病毒學1988年，童裳亮等利用虹鱒脾細胞系從病魚中分離出魚傳染性胰臟壞死病毒，并對該病開發(fā)出ELISA和核酸探針檢疫技術。長江水產(chǎn)研究所和中