T-CVMA 172-2024 豬繁殖與呼吸綜合征病毒磁微粒化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)方法

T/CVMA172—2024豬繁殖與呼吸綜合征病毒磁微粒化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)方法Magneticparticlechemiluminescentimmunoassaydetectionofantibodiesagainstporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus2024-7-4發(fā)布2024-7-4實(shí)施中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布I本文件由洛陽(yáng)現(xiàn)代生物技術(shù)研究院有限公司學(xué)、河南科技大學(xué)、許昌市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、西藏自治區(qū)動(dòng)12規(guī)范性引用文件NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范CLIA：化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescenceimmunoassPRRSV：豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductiveandRLU：相對(duì)光單位發(fā)光值（RelativeLightUnit）carbodiimidehydrochlori2HRP標(biāo)記羊抗豬IgG制備酶標(biāo)二抗，待測(cè)樣本中的抗體與酶標(biāo)二抗結(jié)合形成抗原--待檢抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)6.1包被磁微粒混懸液，按照附錄A制6.2酶標(biāo)二抗（HRP標(biāo)記羊抗豬IgG）。按照NY/T541中規(guī)定進(jìn)行樣本的采集與處理，期間做好個(gè)人防護(hù)。按常規(guī)方法抽取2mL～3按照NY/T541中規(guī)定進(jìn)行血清樣本的存放與運(yùn)輸。血清樣本若在一周內(nèi)檢測(cè)，置2℃~8℃條件下保存。若超過一周檢測(cè)，置于-20℃以下冷凍保存。運(yùn)將待檢樣品從2℃~8℃或-20℃冰箱取出，靜置至室溫。3參照磁微?；瘜W(xué)發(fā)光儀器系統(tǒng)操作說明，按設(shè)定的反應(yīng)程序設(shè)置儀器參數(shù)，將分裝有1×濃縮洗滌液、酶結(jié)合物、發(fā)光底物A和發(fā)光底物B的試劑瓶分別插入儀器相應(yīng)試劑孔位置。開機(jī)自檢，待儀器自將陰、陽(yáng)性對(duì)照和待檢樣本的樣本架放入儀器樣本倉(cāng)，選擇“PRRS”項(xiàng)目，點(diǎn)擊“開始”按鈕進(jìn)行檢b）加磁微?；鞈乙骸Ｃ靠追謩e加入磁微?；鞈乙?0μL。c）孵育?；靹蚝?7℃溫育20min。f）孵育?；靹蚝?7℃溫育20min。h）顯色。每孔加入發(fā)光底物A和發(fā)光底物B各50μL，混勻i）讀值。檢測(cè)完成后，儀器自動(dòng)計(jì)算并讀取數(shù)據(jù)結(jié)果，打印報(bào)告。如本次檢測(cè)完畢則清空廢液、9試驗(yàn)成立條件S/P≥0.4，為豬繁殖與呼吸綜合征抗體陽(yáng)性；S/P＜4取1mL磁微粒原液進(jìn)行磁分離至上清澄清，棄去上清；移液器移取1mL加入1mL4mg/mLEDC活化劑溶液，蓋緊瓶蓋/容器封口，室溫條件下?lián)u床溫育反應(yīng)60min。A.2洗滌A.3包被先加入10mL包被緩沖液，將反應(yīng)容器內(nèi)的磁微粒以100r/min攪拌5min，豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP2重組蛋白包被抗原。蓋緊瓶蓋/容器封器，2℃~8℃條件下反應(yīng)120min。A.4封閉將反應(yīng)容器進(jìn)行磁分離至上清澄清，棄去上清；移液器精確移取4mL磁微粒洗滌液加入反應(yīng)容器液加入反應(yīng)容器內(nèi)；以100r/min混合15min，最終進(jìn)行磁分離至上清澄清，棄去上清。A.5制備后儲(chǔ)存準(zhǔn)確量取磁微粒保存液100mL加入反應(yīng)容器內(nèi)，以1005胭脂紅色素，攪拌均勻，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，無菌定量分裝，置2℃~8℃保存。6用豬繁殖與呼吸綜合征病毒活疫苗免疫豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陰性健康豬，耳根后肌肉注檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體為陽(yáng)性，則可經(jīng)前腔靜脈大量采血分離血清。將分離的血清經(jīng)56℃水浴滅活30min后，經(jīng)0.22μm濾器過濾除菌，按血清量的0.04%加入Proclin-300防腐陽(yáng)性對(duì)照，置2℃~8℃保存?zhèn)溆?。挑選豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陰性健康豬，經(jīng)前腔靜脈大量采血分離血