DB51T 2910-2022 鱘魚類志賀鄰單胞菌病診斷技術(shù)規(guī)程　　

CCSB52DB51四川省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 2 2 2 2 2 4 4 5 6文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)本文件主要起草人：劉亞、龔全、賴見生、吳曉雲(yún)、陳葉雨、宋明江、杜軍、劉光迅、周1鱘魚類志賀鄰單胞菌病診斷技術(shù)規(guī)程2規(guī)范性引用文件GB/T4789.28-2013食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)GB/T18652-2002致病性嗜水氣單胞菌檢SC/T7013-2008水生動物產(chǎn)地SC/T7014-2006水生動物檢鱘魚類志賀鄰單胞菌病Plesiomonasshigelloidesfors檢驗(yàn)中所需試劑、染色液與培養(yǎng)基的配制按照GB/T4789.28、GB/T18652和SC/T7014規(guī)定執(zhí)行，Taq酶、dNTPs、10×PCR緩沖液（無Mg2+），DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物選用專業(yè)試劑公司提試劑；微生物生化鑒定管可替代相應(yīng)鑒定培養(yǎng)基或鑒定試劑，上述未提及的見附4.2水2學(xué)顯微鏡、PCR擴(kuò)增儀、電子天平、微量移肝臟腫大充血，出血；部分病魚腸道腸腔內(nèi)有少量淡黃9.1革蘭氏染色9.2生理生化試驗(yàn)9.2.2氧化酶試驗(yàn)39.2.3吲哚試驗(yàn)按SC/T7014表2的吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)的規(guī)定執(zhí)行。培養(yǎng)基變紅為陽性；不變紅為9.2.4糖、醇類（葡萄糖、甘露醇）發(fā)酵試驗(yàn)將待檢菌穿刺接種于糖、醇類發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基（A.2），28℃培養(yǎng)24h后觀察。培養(yǎng)基9.2.5運(yùn)動性試驗(yàn)養(yǎng)36h-48h。若待檢菌由穿刺線向四周擴(kuò)散，其邊緣呈云霧狀，為運(yùn)動性酚氯仿法、高鹽法或采用商用試劑盒提取細(xì)菌基因組D9.3.3瓊脂糖凝膠電泳用TAE電泳緩沖液（A.3）配制1％的瓊脂糖平板，凝固后放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹參照物作對照。120V電泳約20min-40min，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止。于紫外光下觀察，并在長波9.3.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、測序、序列比對9.3.4.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化按每0.1g瓊脂糖凝膠加0.1mL酚，將酚加入9.3.3在漩渦震蕩儀上震蕩1min-2min；14000r/min離心5min。取上體積的氯仿：異戊醇（24:1A.6混勻，12000r/min離心5min。向收集的水溶液中加入1/10離心10min，棄上清。將沉淀的DNA溶于適當(dāng)體積9.3.4.2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序與同源性分析將上述純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定4+--+++測定的16SrRNA基因序列與附錄B所列的基因序列比較，同源性達(dá)試劑配方A.2糖、醇類發(fā)酵培養(yǎng)基溴百里酚藍(lán)1％水溶液3mL（溴百里酚藍(lán)先用少量95％乙醇溶解后，再加水配制在800mL雙蒸水中溶解242gTris堿，加入57.1mL冰乙酸和37.2gEDTA，充分混勻后，加雙蒸水定容至1L，室溫保存。使用時(shí)，配成1×TAE電A.4溴酚藍(lán)指示劑溶液6×上樣緩沖液將溴酚藍(lán)100mg，加雙蒸水5mL，在室溫下過夜。待溶解后再稱取蔗糖25g，移入溴酚藍(lán)溶液中，搖勻后定容至50A.5酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）A.6氯仿：異戊醇（24:1）將24體積的氯仿和1體積的異戊AAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTAATACTTTATGGGATTCGCTCACTATCGCTAGCTTGCCGCCCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACCGAATCGCTGGCAACAAAGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCATGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCCCCCTCTACAAGACTCTAGCTTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCAAGTTGAGCTCGGGGATTTCACATCTGACTTAACAAACCCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTGCGAGTAACGTCAATGCCACTAGGTATTAACTAGTGACCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCAGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCGTGACTGGTCATTCTCTCAAACCAGTTAGAGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCCACCTGGGTTCGATAG